CN113136377B

CN113136377B - 一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用

Info

Publication number: CN113136377B
Application number: CN202010060670.8A
Authority: CN
Inventors: 江会锋; 郭丹; 刘玉万; 彭凯; 卢丽娜
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN113136377A

Abstract

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用。本发明的聚糖酶是采用简并密码子替换聚糖酶中的部分核苷酸，实现密码子优化，提高其催化活性；本发明还提供乙偶姻的制备方法，使用表达该聚糖酶的微生物细胞进行全细胞催化，制备乙偶姻，并可以进一步制备川芎嗪。本发明的方法底物转化率高，产量高，降低了成本，适用于工业化生产。

Description

一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用

技术领域

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种聚糖酶及其在2,3,5,6-四甲基吡嗪生物合成中的应用。

背景技术

2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine,TMP)又叫做川芎嗪，是一种含氮杂环化合物。它是一种无色结晶化合物，熔点为80-82℃，易溶于乙醇、丙二醇等有机溶剂，微溶于乙醚。川芎嗪具有特殊的焦甜味、坚果味和烘焙味，存在于坚果、可可豆、咖啡等深受人们喜爱的食品中。另外，它也是白酒中的一种重要成分，不仅有助于增强酒的香味，而且在一定程度上有益健康。川芎嗪是一种公认的安全物质，是国家标准允许使用的食品添加剂，最大添加浓度为10mg/kg。

此外，川芎嗪是传统中药川穹的有效成分，具有扩张血管、轻度降压、抑制血小板黏附聚集和血栓形成、抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增生等较为良好的药理作用，现在临床上主要用于治疗闭塞性血管疾病，如脑栓塞、冠心病、心绞痛、脉管炎、慢性肺心病、慢性肾功能衰竭等。据中国化学制药工业协会报道，2018年度18个心脑血管类药物12个品种同比增长，其中注射用葛根素、注射用盐酸川芎嗪和注射用磷酸川芎嗪列产量前三位。而注射用盐酸川芎嗪冻干粉针剂(折算标准40mg)产量为6591万瓶，同比增长47.1％。数据显示，丹参川芎嗪注射液在2018年公立医疗机构终端销售额为40.78亿元人民币。

川芎嗪的生产方法主要包括植物提取法、化学合成法和生物发酵法。从植物组织提取吡嗪的方法包括有机溶剂法、超临界CO₂萃取法、高速逆流色谱技术等；化学合成法是现在国内外工业化生产川芎嗪的主要方式，其中美拉德反应会产生吡嗪类物质，Osulosekh路线会产生很多中间体，经过后续高级阶段的反应会生成大量的川芎嗪，化学合成法大多以2,3-丁二酮，2,3-丁二胺或者丁酮与亚硝酸乙酯为原料合成；微生物法通过高产菌株的筛选而后微生物发酵生产川芎嗪，如从枯草芽孢杆菌的发酵液中分离提纯川芎嗪。

目前，从植物组织提取川芎嗪，由于原材料的短缺，很难满足市场需求。化学合成法是现在国内外工业化生产川芎嗪的主要方式，但化学反应会涉及自由基反应，并且会带来一些环境问题。并且，由于化石原料供应的短缺，化学合成使用原料的价格也在不断上涨。同时，消费者更倾向于使用天然产品，尤其是在食品、药品和化妆品行业中。微生物发酵生产作为一种安全高效的生产方式，近年来越来越受到人们的关注。然而，目前使用微生物发酵法生产的川芎嗪产量都比较低，而高产的菌株又很难获得，这成为生物法合成川芎嗪的瓶颈。

Zhang等从乙醇出发，经乙醇脱氢酶反应形成乙醛，再经聚糖酶(Formolase)突变体FLS:L482S催化乙醛合成乙偶姻。该方法采用的是纯酶反应，产量低，成本高。

发明内容

为改善上述技术问题，本发明的第一方面提供一种聚糖酶(FLS)，其是将SEQ IDNO.1所编码的氨基酸序列5’端的12个氨基酸由简并密码子替换所得，所述聚糖酶相比于未替换密码子的聚糖酶在细胞中的表达增强，全细胞催化活性增强。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种聚糖酶突变蛋白，其氨基酸序列是在对应于SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列第21位的组氨酸H突变为谷氨酰胺Q(H21Q)。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述聚糖酶突变蛋白可以由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码。

第二方面，本发明还提供一种微生物细胞，包含第一方面所述聚糖酶或聚糖酶突变蛋白(H21Q)的编码基因，并且表达所述聚糖酶或聚糖酶突变蛋白(H21Q)。

在一个实施方案中，所述微生物细胞含有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施方案，所述微生物细胞是基因重组细胞，是将所述聚糖酶或其突变蛋白(H21Q)的编码基因构建重组表达载体，将所述载体导入宿主细胞，得到所述微生物细胞。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包含上述重组表达载体，所述宿主细胞可以选自原核细胞，如细菌；或是真核细胞；作为实例，所述宿主细胞为大肠杆菌或酵母。

第三方面，本发明还提供如上所述聚糖酶或突变蛋白(H21Q)或如上所述的微生物细胞在制备乙偶姻或川芎嗪中的应用。在一个实施方案中，所述应用包括将聚糖酶或聚糖酶突变蛋白(H21Q)或者微生物细胞与底物接触，催化底物生成目标化合物；所述底物为乙醛，或者进一步包括铵盐。在一个实施方案中，所述底物为乙醛，得到的目标化合物为乙偶姻，或者所述底物为乙醛和铵盐，得到的目标化合物包括川芎嗪。在另一实施方案中，所述应用包括用培养基发酵培养本发明的微生物细胞，在培养液中分离所述目标化合物，所述培养基中包括乙醛，或者进一步包括铵盐。在又一实施方案中，所述应用包括加入底物，培养本发明的微生物细胞，采用全细胞催化法制备上述目标化合物。本发明优选采用全细胞催化法。

基于上述聚糖酶、聚糖酶突变蛋白(H21Q)或微生物细胞的应用，本发明进一步提供一种乙偶姻的生物合成方法，包括以乙醛为底物，采用微生物细胞通过全细胞合成反应制备乙偶姻，所述微生物细胞表达聚糖酶或聚糖酶突变蛋白(H21Q)。在一个实施方案中，所述微生物细胞是如第二方面所述的微生物细胞，含有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施方案，所述微生物细胞含有包括聚糖酶或聚糖酶突变蛋白(H21Q)的重组质粒，所述重组质粒是将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与表达载体连接，形成重组表达载体，例如所述表达载体来源于本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体；作为实例，适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应中，乙醛的浓度为0.001～3.0molL^-1，例如0.5～3.0mol L^-1，优选为1.5mol L^-1。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应中，反应体系的pH为6～8，例如为7.5。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应中，反应的温度为30～45℃。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应，反应的时间为0.5～24小时，例如0.5～12小时。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应在缓冲溶液中进行，例如在磷酸盐缓冲液(含5mol L^-1Mg²⁺，pH为7.5)中进行。

根据本发明的实施方案，所述全细胞合成反应中细胞干重为0.1g/L～100g/L，例如1g/L～50g/L。

本发明还提供如上所述方法制备得到的乙偶姻在制备川芎嗪中的用途。

本发明还提供一种制备川芎嗪的方法，包括如下步骤：

1)制备乙偶姻；

2)将步骤1)制备的乙偶姻与铵盐反应制备得到川芎嗪。

根据本发明的实施方案，步骤1)中乙偶姻采用纯酶反应制备，或上述全细胞合成的方式制备。

根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述铵盐选自含NH₄ ⁺的化合物，例如选自磷酸氢二铵、甲酸铵、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵等铵盐中的至少一种。

根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述铵盐与乙偶姻的摩尔比为(3～1)：1。

根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述反应在30℃～130℃下进行，所述反应在高温条件下乙偶姻转化为川穹嗪的速率加快，例如在90-110℃下反应，再例如在100℃下进行。

根据本发明的实施方案，步骤1)和步骤2)可以“一锅法”直接反应，例如可以在步骤1)的反应混合物中直接加入所述铵盐进行反应，制备川芎嗪。

本发明还提供如上所述方法制备得到的川芎嗪。

有益效果

本发明的方法首次实现了利用乙醛为原料两步合成川芎嗪，具有以下优点：

第一，路线途径较短，仅用两步就可以合成川芎嗪，工艺较为简单；同时使用的原料价格低廉，并且在后续处理中仅仅通过重结晶就能够实现川芎嗪的分离提取；

第二，本发明的方法在乙偶姻合成过程中使用了全细胞催化技术，相比发酵而言，生成的杂质更少；

第三，本发明的方法制备川芎嗪的产量可达94g L^-1。

综上，本发明的方法以乙醛为原料采用生物合成法合成川芎嗪，避免酶直接暴露于高浓度底物中，改善了酶的耐受性，提高了酶的催化效率和底物转化率，产量高，为川芎嗪的工业化生产开辟了新的道路。

此外，本发明的方法通过全细胞合成制备乙偶姻，产物收率高，且大大降低了制备成本。

附图说明

图1为FLS蛋白纯化分析结果(M:蛋白Marker，泳道1:沉淀，泳道2:上清液，泳道3:镍亲和层析柱流出液，泳道4:50mM咪唑洗脱液，泳道5:200mM咪唑洗脱液)。

图2为空白对照反应体系及FLS纯酶反应液相图。

图3为不同乙醛浓度下FLS全细胞反应的效率。

图4为FLS表达筛选的SDS-PAGE(框线里为目标蛋白，C1：含pET-28a-FLS的BL21(DE3)IPTG诱导前的蛋白表达，C2：含pET-28a-FLS的BL21(DE3)IPTG诱导后的蛋白表达)。

图5为全细胞催化筛选FLS密码子优化菌株库。

图6中A为FLS对乙醛的催化活性，B为FLS:H21Q对乙醛的催化活性。

图7为FLS-77与FLS:H21Q-77全细胞合成的催化效率。

图8为乙偶姻合成反应条件的优化结果，其中第一行左图为不同乙醛浓度的影响，第一行右图为不同pH的影响，第二行左图为不同温度的影响，第二行右图为反应时间的影响。

图9为不同铵盐种类对川芎嗪收率的影响。

图10为实施例4中全细胞合成所得乙偶姻的液相色谱图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

如下实施例中部分分子的克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照该试剂、酶或试剂盒的产品说明进行操作，在如下实施例中不再详细描述。但上述差别不影响本申请实施例中的操作过程。

实施例1、构建乙偶姻合成的全细胞催化体系

1.fls基因获得

FLS是一种人工设计的酶，其基因序列为SEQ ID NO.1，通过基因合成获得。

2.表达载体的构建

将SEQ ID NO.1所示的fls基因替换pET-28a载体(Novagen，Kan⁺)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-28a-FLS。

3.基因的表达

为了体外检测FLS酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-FLS转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，0.1mg mL^-1)，37℃过夜培养，得包括FLS编码序列的重组菌；

(2)挑单克隆至5mL 2YT液体培养基中(Kan⁺，0.1mg mL^-1)，37℃、220r min^-1培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan⁺，0.1mg mL^-1)，37℃、220r min^-1培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mmol L^-1，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r min^-1离心15min；再加入50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬清洗一次，离心，弃去上清，加入约30mL的缓冲液悬起来。

4.蛋白纯化

(1)破碎菌：若菌液过于粘稠，可加入少量的DNA酶后再破碎菌。使用高压破碎仪在1200bar下将菌破碎2-3次，然后10000r min^-1离心45min。取上清，弃去沉淀。

(2)镍亲和层析柱纯化蛋白：首先使用一柱体积50mM磷酸盐缓冲液平衡层析柱；然后将离心后的上清加入，使目标蛋白吸附于镍柱。最后分别将含50mmol L^-1、200mmol L^-1咪唑的缓冲液加入镍柱进行杂蛋白清洗与蛋白洗脱。

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白：分别将离心后的上清、沉淀、镍亲和层析柱流出液、含杂蛋白的缓冲液与含目标蛋白的缓冲液加入蛋白loading，然后80℃煮10min，通过SDS-PAGE分析结果，如图1。

(4)浓缩目标蛋白：将含目标蛋白的缓冲液加入30kD的浓缩管中，通过离心将其浓缩至0.5mL左右，再加入两次缓冲液洗去残留的咪唑。

(5)蛋白浓度测定：将蛋白分别稀释10、20倍，取25μL于酶标板中。将蛋白浓度测定试剂盒Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)中的A液与B液按50:1混合，取200μL于酶标板中与蛋白稀释液混合。37℃反应0.5h后，在562nm下测定其吸光值，然后根据标准曲线计算蛋白浓度。

(6)蛋白保存：将浓缩后的蛋白放入EP管中，用液氮冷冻后于-80℃保存。

5.FLS催化乙醛缩合生成乙偶姻

FLS催化乙醛缩合生成乙偶姻反应方程式如下：

a.体外纯酶反应

FLS反应体系(200μL)：500mM乙醛，0.5mM TPP(焦磷酸硫胺素)，5mM Mg²⁺、1mg/ml上述步骤纯化的FLS蛋白和蛋白缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.5)。

将上述各组反应体系混匀后于30℃反应2h。反应结束后，用等体积的乙腈将酶失活，12000rpm离心30min,取其上清液进行HPLC检测，结果如图2。

空白对照反应体系(200μL)：300mM乙醛，0.5mM TPP(焦磷酸硫胺素)，5mM Mg²⁺和蛋白缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.5)。

b.全细胞反应

为了测定FLS全细胞催化反应的效率，在200μL反应体系中，加入干细胞重(DCW)为5g L^-1的步骤3(1)所得的FLS编码序列的重组菌，与间隔为100mmol L^-1的一系列梯度浓度的乙醛反应，在30℃，pH为7.4的条件下反应2h后离心，取其上清用乙偶姻显色法检测，结果如图3。

实施例2、密码子优化提高FLS表达

1、构建菌株库

通过引物设计，用FLS 5'端的12个氨基酸的简并密码子替换原有的密码子，其引物如下：

正向引物：

5'-CATATGATGgcnATGathacnggnggngarctrgtngtncgnacnctnATTAAAGCTG-3'(SEQID NO.6)

反向引物：

5'-CCATGCAGGCCAAACAGATGTTCTACGCCAGCTTTAAT-3'(SEQ ID NO.7)

以质粒pET-28a-FLS为模板，通过PCR获得目的条带，再经DMT酶消化模板，纯化PCR产物，最后将纯化后的产物转化BL21(DE3)，涂于含0.1mg mL^-1卡那霉素的LB平板，37℃培养。

(2)SDS-PAGE筛选：将平板上的菌落转接于含0.1mg mL^-1卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入0.5mmol L^-1IPTG诱导蛋白表达。37℃培养2h后，取OD₆₀₀为1的1mL菌液，离心除去上清，加入40μL 50mmol L^-1磷酸盐缓冲液与10μL蛋白loading。100℃煮10min后离心，取15μL上清液进行SDS-PAGE检测，结果如图4。

(3)全细胞反应筛选：将表达量提高的菌株转接于含0.1mg mL^-1卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入0.5mmol L^-1IPTG诱导蛋白表达。在16℃培养16h后收集菌。在细胞干重为5g L^-1菌中加入200μL含50mmol L^-1乙醛的磷酸盐缓冲液(含5mmol L^-1Mg²⁺，pH为7.5)，30℃振荡反应2h。将其离心后取上清，用显色法检测乙偶姻含量。使用各菌株反应生成乙偶姻的量除以对照组FLS反应生成乙偶姻的量，计算出各菌株的相对活性，结果如图5。由图5可知菌株FLS-77(其编码FLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的催化活性最高，是原菌株的3倍。

实施例3、FLS突变体在生物合成乙偶姻中的应用

1、FLS定向进化

FLS对乙醛的催化活性为92.3M^-1·s^-1(反应条件为：50mM乙醛，30℃，50mM磷酸盐，5mM MgSO₄，pH7.0。酶标仪测试的反应动力学)，结果如图6A所示。为了进一步提高FLS的催化效率，我们采用定向进化的方法，将FLS 77突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第21位的组氨酸(His)突变为谷氨酰氨(Gln)，从而得到突变体FLS 77:H21Q(SEQ ID NO.5)，它的kcat/Km达到188M^-1·s^-1，对乙醛的催化活性是FLS的2倍，结果如图6B所示。

2、FLS-77:H21Q全细胞催化活性

细胞干重为5g L^-1的突变体FLS-77:H21Q与600mM的乙醛进行全细胞反应(反应条件为：0.5ml体系，50mM磷酸盐，5mM MgSO₄，pH7.0，35℃，200rpm，反应8h)，结果如图7，较FLS-77而言，其催化效率(催化效率为相同条件下，最终得到的乙偶姻浓度的比值)提高了16％。

实施例4、乙偶姻合成反应条件的优化

对FLS-77:H21Q催化乙醛缩合的全细胞反应中乙醛浓度进行优化。将FLS-77:H21Q接种于含0.1mg mL^-1卡那霉素的50mL LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6时，加入0.5mmol L^-1IPTG诱导蛋白表达。在16℃诱导16h后，收集菌。在500μL体系中分别加入细胞干重(DCW)为5g/L FLS-77:H21Q，然后分别加入间隔500mM的一系列等梯度的乙醛，在30℃反应下8h，结果如图8中第一行左图(乙醛浓度优化图)，由该图可知，其最适反应的乙醛浓度为1.5mol L^-1。

对FLS-77:H21Q催化乙醛缩合的全细胞反应pH进行优化。在500μL体系中分别加入细胞干重(DCW)为5g/L FLS-77:H21Q，反应温度为30℃，反应pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30℃反应下8h，结果如图8中第一行右图所示，由该图可知，pH对该反应的影响不大，其最适的反应pH为7.5。

对FLS-77:H21Q催化乙醛缩合的全细胞反应温度进行优化。在500μL体系中加入细胞干重(DCW)为5g/L FLS-77:H21Q，再加入含1.5mol L^-1乙醛的50mol L^-1磷酸盐缓冲液(含5mol L^-1Mg²⁺，pH为7.5)，反应温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃，反应进行8h，结果如图8中第二行左图所示，其最适反应温度为35℃。

最后，将反应体系扩大至50mL，加入细胞干重为30g L^-1FLS-77:H21Q进行全细胞催化反应。为了得到乙偶姻的最大产量，在最适反应条件下(反应pH为7.5，温度为35℃)，连续流加乙醛，使其浓度保持1.5mol L^-1，结果如图8中第二行右图，反应12h后，乙偶姻的产量基本不再增加，最终得到222g L^-1(2.5mol L^-1)乙偶姻，其得率为86.5％。其液相检测结果(色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H Column(300mm x 7.8mm)色谱柱，在210nm紫外检测，进样量5微升，柱温35℃，流动相为5mM硫酸，流速为0.6ml/min，出峰时间在18.1min)如图10所示。由图10可知，所得产物中杂质少，乙偶姻纯度高。

实施例5、一锅法乙醛合成川芎嗪

1、川芎嗪合成条件优化

不同铵盐对川芎嗪的合成有影响。我们在实施例4中生成的222g L^-1乙偶姻的基础上分别加入磷酸氢二铵、甲酸铵、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵铵盐，其中NH₄ ⁺与乙偶姻的摩尔比为3:1，在100℃下反应3h，测定所生成的川芎嗪的含量，结果如图9。由图9可知磷酸氢二铵是最佳铵盐，更有利于生成川芎嗪。

2、一锅法合成川芎嗪

由上述结果可知乙偶姻与磷酸氢二铵反应对川芎嗪的积累最有效。在上述有乙醛生成的222g/L乙偶姻的50mL体系中，加入磷酸氢二铵，在100℃下反应3h，最终得到川芎嗪为94g L^-1，由乙醛反应至川芎嗪的产率为48％。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用

<130> CPCN19111592

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 1

<400> 1

atggctatga ttactggtgg tgaactggtt gttcgtaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcgtga 1728

<210> 2

<211> 1728

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2

<400> 2

atggcgatga taactggagg ggaactggtg gtccggaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

catctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcgtga 1728

<210> 3

<211> 1728

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3

<400> 3

atggcgatga taactggagg ggaactggtg gtccggaccc tgattaaagc tggcgtagaa 60

cagctgtttg gcctgcatgg cattcatatt gacaccattt ttcaggcttg cctggaccac 120

gacgtcccaa tcattgatac tcgccacgaa gcggcggcag gccacgctgc ggaaggttat 180

gcccgcgcgg gcgctaaact gggtgttgcc ctggtgaccg ctggcggtgg ctttaccaat 240

gccgttacgc cgatcgcgaa cgctcggacc gatcgcactc cggttctgtt cctgaccggt 300

tctggtgctc ttcgtgatga cgaaaccaac accctgcagg ccggtattga tcaggtggcc 360

atggcggccc cgatcacgaa atgggctcat cgtgttatgg caactgaaca catcccgcgt 420

ctggttatgc aggccattcg tgccgctctg agcgccccac gtggcccggt gctgctggat 480

ctgccatggg acatcctgat gaaccaaatc gatgaagatt ccgttatcat cccagacctg 540

gtgctgtctg ctcacggtgc ccatccagac ccggctgacc tggaccaggc tctggcactg 600

ctgcgtaaag ccgaacgccc agttatcgta ctgggctccg aggcgtcccg caccgcacgc 660

aagaccgcac tgagcgcatt cgtagcggcg accggtgtac cggttttcgc tgactatgaa 720

ggcctgtcca tgctgagcgg cctgccggac gctatgcgtg gcggcctggt gcagaacctg 780

tactcctttg caaaagctga tgcagctccg gacctggtac tgatgctggg tgctcgtttc 840

ggtctgaaca ccggtcatgg ttccggtcaa ctgatcccgc attctgctca ggtgatccag 900

gtggatccag acgcgtgtga actgggtcgc ctgcaaggca tcgcgctggg tatcgtggct 960

gatgtaggtg gcaccattga agcgctggct caggcgaccg cacaggacgc cgcgtggccg 1020

gaccgcggcg actggtgcgc caaggtaact gacctggccc aggagcgtta cgcttccatc 1080

gcggctaaat ccagctctga acatgcgctg cacccgttcc acgcttctca ggttatcgcg 1140

aaacacgtgg acgcaggcgt gaccgtcgtt gcggatggtg gcctgactta tctgtggctg 1200

tccgaagtta tgtctcgtgt caaaccaggc ggcttcctgt gccacggcta tctgaacagc 1260

atgggtgtag gcttcggtac tgccctgggt gcgcaggttg cggatctgga ggcaggtcgt 1320

cgtaccatcc tggtgaccgg cgacggctct gttggttatt ccattggcga attcgacacc 1380

ctggtacgca aacagctgcc gctgattgta attatcatga acaaccagtc ttggggctgg 1440

accctgcact ttcagcagct ggccgttggt cctaaccgtg tcaccggcac ccgcctggaa 1500

aatggttcct atcacggcgt tgctgcggca ttcggtgctg atggttacca cgtcgactct 1560

gtcgagagct tcagcgccgc tctggctcag gcactggcac acaaccgccc ggcatgcatc 1620

aacgttgctg tggccctgga cccgatcccg ccggaggaac tgatcctgat tggcatggac 1680

ccgtttgcgg gctccacgga gaatctgtat ttccaatccg gcgcgtga 1728

<210> 4

<211> 563

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 4

<400> 4

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Val Glu His Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr

20 25 30

Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg

35 40 45

His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Gly

50 55 60

Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu

85 90 95

Phe Leu Thr Gly Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu

100 105 110

Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp

115 120 125

Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg Leu Val Met Gln

130 135 140

Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile

165 170 175

Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala

180 185 190

Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val

195 200 205

Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu

210 215 220

Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu

245 250 255

Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu

260 265 270

Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser

275 280 285

Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp

290 295 300

Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp

325 330 335

Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu

340 345 350

Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His

355 360 365

Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp

370 375 380

Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly

405 410 415

Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln

420 425 430

Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp

435 440 445

Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys

450 455 460

Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly

485 490 495

Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly

500 505 510

Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu

515 520 525

Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val

530 535 540

Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala

<210> 5

<211> 563

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 5

<400> 5

Met Ala Met Ile Thr Gly Gly Glu Leu Val Val Arg Thr Leu Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Val Glu Gln Leu Phe Gly Leu His Gly Ile His Ile Asp Thr

20 25 30

Ile Phe Gln Ala Cys Leu Asp His Asp Val Pro Ile Ile Asp Thr Arg

35 40 45

His Glu Ala Ala Ala Gly His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Gly

50 55 60

Ala Lys Leu Gly Val Ala Leu Val Thr Ala Gly Gly Gly Phe Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Thr Pro Ile Ala Asn Ala Arg Thr Asp Arg Thr Pro Val Leu

85 90 95

Phe Leu Thr Gly Ser Gly Ala Leu Arg Asp Asp Glu Thr Asn Thr Leu

100 105 110

Gln Ala Gly Ile Asp Gln Val Ala Met Ala Ala Pro Ile Thr Lys Trp

115 120 125

Ala His Arg Val Met Ala Thr Glu His Ile Pro Arg Leu Val Met Gln

130 135 140

Ala Ile Arg Ala Ala Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Val Leu Leu Asp

145 150 155 160

Leu Pro Trp Asp Ile Leu Met Asn Gln Ile Asp Glu Asp Ser Val Ile

165 170 175

Ile Pro Asp Leu Val Leu Ser Ala His Gly Ala His Pro Asp Pro Ala

180 185 190

Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ala Glu Arg Pro Val

195 200 205

Ile Val Leu Gly Ser Glu Ala Ser Arg Thr Ala Arg Lys Thr Ala Leu

210 215 220

Ser Ala Phe Val Ala Ala Thr Gly Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Leu Ser Gly Leu Pro Asp Ala Met Arg Gly Gly Leu

245 250 255

Val Gln Asn Leu Tyr Ser Phe Ala Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu

260 265 270

Val Leu Met Leu Gly Ala Arg Phe Gly Leu Asn Thr Gly His Gly Ser

275 280 285

Gly Gln Leu Ile Pro His Ser Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp

290 295 300

Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala

305 310 315 320

Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp

325 330 335

Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu

340 345 350

Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His

355 360 365

Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp

370 375 380

Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu

385 390 395 400

Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly

405 410 415

Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln

420 425 430

Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp

435 440 445

Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys

450 455 460

Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp

465 470 475 480

Thr Leu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly

485 490 495

Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly

500 505 510

Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu

515 520 525

Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val

530 535 540

Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp

545 550 555 560

Pro Phe Ala

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 6

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

catatgatgg cnatgathac nggnggngar ctrgtngtnc gnacnctnat taaagctg 58

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 7

<400> 7

ccatgcaggc caaacagatg ttctacgcca gctttaat 38

Claims

1.一种聚糖酶（FLS），其特征在于，所述聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。

2.一种聚糖酶突变蛋白，其特征在于，所述聚糖酶突变蛋白其氨基酸序列是在对应于SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列第21位的组氨酸H突变为谷氨酰胺Q（H21Q），所述聚糖酶突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的聚糖酶突变蛋白，其特征在于，所述聚糖酶突变蛋白由SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列编码。

4.一种微生物细胞，其特征在于，包含权利要求1所述聚糖酶的编码基因，或权利要求2或3所述聚糖酶突变蛋白的编码基因，并且表达所述聚糖酶或聚糖酶突变蛋白。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是基因重组细胞，是将权利要求1所述聚糖酶，或权利要求2或3所述聚糖酶突变蛋白的编码基因构建重组表达载体，将所述载体导入宿主细胞，得到所述微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含所述重组表达载体，所述宿主细胞选自大肠杆菌或酵母。

7.权利要求1所述聚糖酶，或权利要求2或3所述的聚糖酶突变蛋白，或权利要求4-6任一项所述的微生物细胞在制备乙偶姻或川芎嗪中的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1所述聚糖酶，或权利要求2或3所述的聚糖酶突变蛋白，或者权利要求4-6任一项所述微生物细胞与底物接触，催化底物生成目标化合物；所述底物为乙醛，得到的目标化合物为乙偶姻，或者所述底物为乙醛和铵盐，得到的目标化合物包括川芎嗪。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括加入底物，培养权利要求4-6任一项所述的微生物细胞，全细胞催化反应，在培养液中分离所述目标化合物；

或者，所述应用包括用培养基发酵培养权利要求4-6任一项所述的微生物细胞，在培养液中分离所述目标化合物。

9.一种乙偶姻的生物合成方法，其特征在于，包括以乙醛为底物，采用微生物细胞通过全细胞合成反应制备乙偶姻，所述微生物细胞表达权利要求1所述聚糖酶或权利要求2或3所述的聚糖酶突变蛋白。

10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述微生物细胞是权利要求4-6任一项中所述的微生物细胞，含有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述微生物细胞含有重组质粒，所述重组质粒是将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列与表达载体连接，形成的重组表达载体。

12.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述全细胞合成反应中，乙醛的浓度为0.001~3.0 mol L^-1。

13.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述全细胞合成反应中，反应的温度为30~45^oC。

14.一种制备川芎嗪的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备乙偶姻；

2）将步骤1）制备的乙偶姻与铵盐，制备得到川芎嗪；

所述步骤1）是采用权利要求9-13任一项所述的方法制备，或者所述步骤1）是采用纯酶法制备；在步骤1）的反应混合物中直接加入所述铵盐，进行步骤2）的反应，制备川芎嗪；

其中，步骤1）所述纯酶法采用权利要求1所述聚糖酶，或权利要求2或3所述的聚糖酶突变蛋白。

15.根据权利要求14所述的制备川芎嗪的方法，其特征在于，步骤2）中，所述铵盐选自含NH₄ ⁺的化合物。

16.根据权利要求15所述的制备川芎嗪的方法，其特征在于，步骤2）中，所述含NH₄ ⁺的化合物选自磷酸氢二铵、甲酸铵、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵中的至少一种。

17.根据权利要求15所述的制备川芎嗪的方法，其特征在于，步骤2）中，所述铵盐与乙偶姻的摩尔比为（3~1）：1。

18.根据权利要求15所述的制备川芎嗪的方法，其特征在于，步骤2）中，所述反应在30℃~130℃下进行。