CN111172090B - 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法 - Google Patents

一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L‑精氨酸的方法，具体公开了一种通过过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A以及阳离子转运ATP酶CTAP1提高L‑精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了对基因mrp1和ctap1的敲除和过表达，通过对胞内[Na+]和[K+]的测定，明确离子转运蛋白在离子浓度、pH稳态和渗透压方面的调节作用。采用5L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组钝齿棒杆菌5‑5(mrp1ctap1)发酵至96h，重组菌的L‑精氨酸产量达到65.3g/L，产率为0.395g/g，比钝齿棒杆菌SYPA5‑5提高了39.1％。

Description

一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法
技术领域
本发明公开了一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法，具体公开了一种通过过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A以及阳离子转运ATP酶CTAP1提高L-精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-精氨酸(C6H14N4O2)是一种天然碱性氨基酸，其在食品添加剂、饲料和制药行业有着广泛的应用且有益于人类的生长发育。L-精氨酸具有多种生理功能与作用，广泛应用于人类生产生活，是氨基酸工业研究与开发的热点之一。在L-精氨酸合成过程中，离子转运为钝齿棒杆菌发酵提供适宜的胞内pH环境，同时维持离子稳态防止胞内出现高渗透压，是保证L-精氨酸高水平产量和产率的关键。
H+、K+和Na+是细菌中最关键、最重要的一价阳离子，在细菌的转运过程中发挥着至关重要的作用，因此离子在胞内外的分布影响着菌体的存活。细菌的转运系统也在不同的胞外环境下发挥作用，如碱性pH和高渗透压条件。H+用于调节胞内pH，从而保证适宜的胞内环境。K+是胞内含量最丰富的离子，参与多种细胞生理活动。其控制质膜电位，调节胞内pH，激活胞内酶。在酸性条件下，钝齿棒杆菌SYPA5-5的生长完全取决于K+的有效性和内部积累。此外，K+还可以作为一种渗透溶质，在高渗透压胁迫下，许多细菌迅速积累K+以恢复其膨胀压。Na+对细菌细胞的重要性通常归因于其在溶质吸收中的作用。
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是一种钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性菌，其生长迅速且可广泛使用不同的有机化合物作为碳源。该菌株不存在L-精氨酸脱氨酶，这使得胞内产生的L-精氨酸未被或有限度地被降解，对L-精氨酸的合成具有高效的促进作用，因此其突变株在国内的氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。钝齿棒杆菌SYPA5-5是发明人课题组筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株保藏编号为CGMCC NO.0890，在公开号为CN1441055A的专利中已公开)。
发明内容
本发明的目的在于利用一种过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1的重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸，得到的L-精氨酸产量和产率均提高，对于规模化制备L-精氨酸具有重要的应用价值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，是过表达了单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选地，编码所述Mrp1A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，编码所述CTAP1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述重组钝齿棒杆菌以pDXW-10作为原始表达载体。
优选地，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5作为宿主。
本发明提供了一种促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法，是在钝齿棒杆菌中过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
本发明提供了一种生产L-精氨酸的方法，是应用上述重组钝齿棒杆菌作为生产菌株发酵产L-精氨酸。
优选地，将OD600为20-30的重组钝齿棒杆菌接入发酵罐，发酵温度为28-32℃，pH值为6.5-7.5，搅拌速度为500-700r/min，空气流量为1-1.5vvm。
优选地，发酵罐装液量为30％-40％。
优选地，发酵过程中，当葡萄糖残留浓度小于10g/L时，补料。
本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌在生产L-精氨酸或含L-精氨酸的产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明成功在钝齿棒杆菌中实现了串联过表达mrp1和ctap1，CTAP1是特异性的K+转运ATP酶，可将胞外的K+运输到胞内，Mrp1A将K+和Na+等单价阳离子运输到胞外，同时将胞外H+运输至胞内，起到维持胞内pH稳定的作用。同时在L-精氨酸合成过程中离子转运蛋白还调控胞内离子浓度和渗透压，最终提高L-精氨酸的产量。在补料分批发酵中，5-5(mrp1ctap1)菌株L-精氨酸产量达到65.3g/L。产率为0.395g/g，比钝齿棒杆菌SYPA5-5提高了39.1％。
附图说明
图1为重组菌株5-5(mrp1ctap1)补料分批发酵过程中，随着发酵时间的增加，L-精氨酸产量、细胞干重以及葡萄糖消耗的数据。
具体实施方式
发明人课题组在前期研究中，发现在发酵时外源添加适量钾离子有利于促进钝齿棒杆菌SYPA5-5合成L-精氨酸。针对该现象主要研究结果如下：
(1)通过对钝齿棒杆菌SYPA5-5在0.5g/L和2.5g/L的外源K+条件下进行转录组数据分析，挖掘出阳离子转运ATP酶CTAP1和CTAP2以及K+转运相关的单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和Mrp2C，研究其在钝齿棒杆菌SYPA5-5快速合成L-精氨酸阶段，对菌株生长及L-精氨酸合成的影响。
(2)对基因mrp1，mrp2和ctap1，ctap2分别进行单敲除、双敲除和串联过表达，深入研究突变株胞内外离子浓度变化。研究发现CTAP1和CTAP2是特异性的K+转运ATP酶，离子转运蛋白Mrp1A和Mrp2C的缺失导致细胞内Na+无法运出细胞，胞内Na+积累导致浓度显著增加，细胞需要调节胞内离子强度，因此胞内K+浓度降低。Na+/K+，Na+/H+和K+/H+转运蛋白参与了离子的稳态，为钝齿棒杆菌SYPA5-5细胞适应不同离子条件的变化提供生理调节基础。
(3)通过BCECF-AM荧光探针检测钝齿棒杆菌SYPA5-5及重组菌株稳定期胞内pH，发现离子转运蛋白CTAP1和CTAP2将培养基中的K+运输到胞内，同时逆转运蛋白Mrp1A和Mrp2C将K+、Na+等单价阳离子从胞内运输到胞外，同时将胞外H+运输至胞内，在胞内起到中和L-精氨酸所导致的碱性环境，维持胞内pH稳定的作用。
本发明涉及一种通过过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白和阳离子转运ATP酶提高钝齿棒杆菌合成L-精氨酸产量的方法，通过以下实施例具体描述。
实施例1：敲除离子转运蛋白Mrp1A和CTAP1
以钝齿棒杆菌SYPA5-5基因组为模板，利用引物对Δmrp1-1/Δmrp1-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.5/6所示)和Δmrp1-3/Δmrp1-4(核苷酸序列如SEQ ID NO.7/8所示)扩增出mrp1基因上下游片段各500bp。回收后，以上下游片段为模板，利用mrp1-1(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和mrp1-4(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)引物融合PCR扩增出mrp1基因缺失片段。纯化回收PCR产物获得mrp1基因缺失片段，pK18mobSacB质粒酶切产物纯化回收，利用同源重组酶进行连接。连接产物经热激转化E.coli JM109感受态，含卡那霉素抗性的LB平板培养筛选转化子，并进行质粒提取和酶切、PCR和测序验证。验证正确，表明质粒pK18Δmrp1构建成功。
以钝齿棒杆菌SYPA5-5基因组为模板，利用引物对Δctap1-1/Δctap1-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.9/10所示)和Δctap1-3/Δctap1-4(核苷酸序列如SEQ ID NO.11/12所示)同样方法扩增出ctap1基因缺失片段。PCR产物和pK18mobSacB质粒纯化后利用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，纯化回收ctap1基因缺失片段和pK18mobSacB质粒酶切产物并进行过夜连接。用相同的方法进行转化、筛选、验证，成功获得质粒pK18Δctap1。
敲除质粒pK18Δmrp1电击转化至钝齿棒杆菌SYPA5-5菌株感受态细胞，培养2h后离心收集细胞涂布于含卡那霉素(15μg/L)抗性的LBG平板。30℃培养36-48h进行第一轮筛选，所长转化子即为发生第一次同源重组的菌株。挑取相应转化子菌落于无抗生素的LBG培养基中摇瓶培养12h，培养过程中极少数细胞发生第二次同源重组。吸取20-50μL培养液涂布于含有20％蔗糖无抗生素的LBG固体培养基，36-48h后进行第二轮筛选，随机对蔗糖平板上发生第二次同源重组的转化子进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌株即为5-5Δmrp1菌株。以5-5Δmrp1为宿主，同样的方法电转pK18Δctap1，最终获得突变株5-5Δmrp1Δctap1。
实施例2：过表达离子转运蛋白Mrp1A和CTAP1
以钝齿棒杆菌SYPA5-5基因组为模板，利用引物对10-mrp1ctap1-1/2(核苷酸序列如SEQ ID NO.13/14所示)和10-mrp1ctap1-3/4(核苷酸序列如SEQ ID NO.15/16所示)分别扩增出上游mrp1和下游ctap1基因片段。回收后，以上下游片段为模板，利用引物对10-mrp1ctap1-1/4融合PCR扩增出串联基因mrp1ctap1。纯化回收PCR产物获得mrp1ctap1基因片段，pDXW-10质粒酶切产物纯化回收，利用同源重组酶进行连接。连接产物经热激转化E.coli BL21感受态，卡那霉素抗性平板培养筛选转化子，并进行质粒提取和酶切、PCR和测序验证。验证正确，表明质粒pDXW-10-mrp1ctap1构建成功。再将过表达质粒pDXW-10-mrp1ctap1电击转化至钝齿棒杆菌SYPA5-5菌株感受态细胞，培养2h后离心收集细胞涂布于含卡那霉素(15μg/L)抗性的LBG平板。30℃培养36-48h，随机挑取LBG平板上的转化子进行PCR鉴定，鉴定正确的菌株即为5-5(mrp1ctap1)菌株。
实施例3：Mrp1A和CTAP1对胞内[Na+]和[K+]的影响
取1mL菌液，8000r/min，2min离心，弃上清，蒸馏水洗涤菌体3次，60℃烘干，称细胞干重，1OD562＝0.375g/L细胞干重。取1mL菌体，用1mL浓硝酸完全消化至澄清，再稀释100倍。将稀释后的液体经膜过滤，用ICP-MS法检测重组菌株[Na+]/[K+]的含量。用超纯水进行校准。
在pH 7.0时，与钝齿棒杆菌SYPA5-5相比，5-5Δmrp1Δctap1突变株的Na+浓度显著升高，而K+浓度较低。这是由于离子转运蛋白的缺失导致细胞内Na+无法运出细胞，胞内Na+积累导致浓度显著增加，细胞需要调节胞内离子强度，从而胞内K+浓度降低。5-5Δmrp1Δctap1胞内[Na+]较钝齿棒杆菌SYPA5-5和5-5(mrp1ctap1)急速增加，且随着发酵胞内[Na+]差异性越显著。在96h时，5-5Δmrp1Δctap1胞内[Na+]分别是钝齿棒杆菌SYPA5-5和5-5(mrp1ctap1)的2.48和2.35倍，胞内[K+]随着[Na+]的升高而降低。5-5(mrp1ctap1)胞内[K+]含量丰富，可调控并维持胞内外的[Na+]/[K+]梯度。
实施例4：重组菌5-5(mrp1ctap1)的发酵
(1)种子培养
平板活化钝齿棒杆菌5-5(mrp1ctap1)挑一环接入含15mL液体的LBG培养基中，30℃、180r/min回旋式摇床培养至OD600≈10.0。全部转接于150mL种子培养基中，将15mL种子液全部转接入1000mL带挡板含150mL发酵罐发酵种子培养基的摇瓶中，30℃、180r/min回旋式摇床培养至OD600≈25.0作为二级种子液。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为1.5L，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖7％，酵母浸粉0.8％，KH2PO4 0.25％，MgSO4·7H2O0.05％，(NH4)2SO4 2％，FeSO4·7H2O 0.002％，MnSO4·H2O 0.002％，去离子水配置。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在115℃下高温灭菌20min。
发酵条件：二级种子全部接入装有1.5L发酵罐发酵初始培养基的5L发酵罐中，30℃，通过自动添加50％氨水，pH值维持在7.0。搅拌速度控制在600r/min，空气流量保持在1vvm。当葡萄糖残留浓度小于10g/L时，补料。通过监测发酵液的残余葡萄糖浓度，控制进料速度，持续保持发酵液的残余葡萄糖浓度(10-15g/L)。
每6h取样一次，采用分光光度仪在562nm下测定细胞OD值，用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量，并采用HPLC测定L-精氨酸含量(赛默飞，美国)。结果表明，相比于出发菌株，重组菌生长情况更好，糖耗更快，发酵至96h，重组菌5-5(mrp1ctap1)的L-精氨酸产量达到65.3g/L。产率为0.395g/g，比钝齿棒杆菌SYPA5-5提高了39.1％，实现了L-精氨酸的高产(见图1)。
对比例1
过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp2C(编码Mrp2C的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示)以及阳离子转运ATP酶CTAP2(编码CTAP2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，其余条件同实施例。
结果显示，重组菌5-5(mrp2ctap2)的L-精氨酸产量达到59.5g/L。产率为0.368g/g，比钝齿棒杆菌SYPA5-5提高了29.8％。
对比例2
将发酵培养基中KH2PO4的浓度改为0.5g/L，其余条件同实施例。
结果显示，重组菌5-5(mrp1ctap1)的L-精氨酸产量达到61.4g/L。产率为0.383g/g。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcagatctgg actacgcccg ccgaagtggc ccactgccag caacgccaac ggttgaaccc 2820
gaaccagaag gcgatgaaga ctggcccgaa cccatcaacc ccgcaggcga taacaaagag 2880
gaggcaaacc gatga 2895
<210> 2
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgctggtca gggacatttt tatgggtgat aatggggtta tgaataaaaa acttaatacc 60
ccaaatccct ggatgttatt catccgctca tttgatggca tcatcactgt cgcagccctt 120
gttgccatcg caatacatct cattttatgg ctggctctag atctagatgg ccttgctaaa 180
aactggcctt taatagccat cgttatcgta ggtggcattc cgttgatgtg ggatgtgctg 240
aaatcagcca ttaaaactcg cggtggcgcg gatactttag cagcagtctc catcattact 300
tctgtgttgt taggggagtg gttggttgcc gcgatcatcg tgctcatgct ctctggtggt 360
gaagcgctag aagaggcagc atcacggcga gccagtggca ccttggacgc acttgcccgg 420
cgcgcaccaa gtacagctca ccgcctgttg ggtgcaacca ttcttgatgg aaccgaagag 480
atcgccgtgg aagagatcac ggttggtgat ttagtggcgg tgctcccgca tgaactttgt 540
cccgtggatg gtgaaatcgt ggcaggccac ggcaccatgg atgagtctta tctcacgggt 600
gagccctatg tggtgagtaa atctaaaggt tcgcaagcaa tgtcgggtgc agtcaatggt 660
gatactccgc tgacgattgt tgccacaaag cttgcccatg attccagata cgcccaaatt 720
gttggtgtac tccatgaagc agaaaacaac cgcccagaaa tgcgcaggat ggctgaccgt 780
cttggcgcgt ggtatacggt gattgcactt gccctcggtg gtcttggctg gattgtctcc 840
ggcgacccag tgaggttctt ggctgttgtc gttgtcgcca ccccatgtcc attgctcatt 900
gcagtgccag tggcgatcat cggtgcgatt tctcttgcgg ctcgtcgggg catcatcgtg 960
aagaaccctg gaatgctgga aaacgcttca ggagtaaaga cagtgatgtt cgataagact 1020
ggaacgctca cctatggcag gccagtgatt actgatatcc acactgctcc cggagttgag 1080
gaagatacag tcctagcttt ggctgcttca gtagagcgct actccagaca cccgttggct 1140
gacgcgattc gtgagggcgc aaaagccagg gaacttcatc tgcctgatgt agtggaagta 1200
tcggaacgtc caggacaggg actaaccggc acggtgggcg agcacctggt tcgaataacc 1260
aataggcgca gcacactaga aattgatcca gacagcaaga actacattcc ggtgacaagt 1320
tccggcatgg aatctgtggt gcttgttgat gataaatatg cagcactcat tcgcctccgg 1380
gatgaacctc gtgcatctgc cagtgagttc atcgcgcact tgcccaagaa gcacaaagtg 1440
gacaagctca tgattatctc tggtgatcgc gcatctgagg ttcgttacct tgcggacaag 1500
gttggcattg atgaggtaca cgcagaggcc tcaccggaag acaagctgaa cattgttaat 1560
cggcataatg agcacggcgc caccatgttc ttaggtgatg gaatcaacga tgcgccagcc 1620
atggccgttg ccaccgttgg tgtcgcgatg ggagcagact ccgatgtcac gtccgaagca 1680
gcagatgctg tgattttgga ttcttccctg gaacgtctcg acgatctgct ccacatcagt 1740
gcacggatgc gtcgaatagc gttgcaatct gcgggcggtg gcatggcgtt gagtgtcata 1800
ggaatgatcc tcgcggtatt tggattcttg acgccactga tgggtgcgat cttccaagag 1860
gtcattgacg tgctggctat cctcaattcc gctcgggtcg cactgccacg cggagcgatt 1920
agtgattttg atacgcaaga aaaagtttct tag 1953
<210> 3
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtagcca accttttcct gctcctagct gctggaactc tcatttctgc gggtgtgtat 60
ctgctgcttg atcgcgcgat gaccaaaatg atcatgggtc tcatgctgat cggcaacgga 120
gccaacctgc tgattttggt cgctggaggt tccgctggat cgccaccgat tctggggcgt 180
gaaagcgaaa tctacggcga caaaaccgct gatccgctag cccaagccat gatcctgacc 240
gccatcgtga tctcgatggc gctgaccgcg ttcatgctgt cgcttgccta ccgtcaatac 300
cgttaccgca ccgaggactt cattgaagat gacaccgagg acgttgcaat caccgtccgc 360
cccagttttg cgtctgctgc acctgaccac gatgcatctg acgacccaga aactggtcgc 420
atgacctcag acggcgacga tttcggccca gaatccttcg aagcaccact gaagggagat 480
aaggatgact ag 492
<210> 4
<211> 1878
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaaaacgt ggaagacctg gggggtcgtc ggagcttcag gcctcttgat tattttgtcg 60
tggttgagtt catcgagccc gatgctggca gatgcattca tgatcgcggc tgcaattgtt 120
gcaggttggc cgatcgcgca gtctgcatat caagcacttc gcattcgaat ggtgtcgatt 180
gacttactgg tcgttgtggc tgccgttggt gccatgttca tcaacaacta ttgggagtct 240
gcggcggtga cgttcctctt tgcccttggc aaggcactgg aacgcgcgac aatgaaccgc 300
acacgaaaag cactatcgga tctggtggat gcagctccag aaactgcaac aaggctcaac 360
gcggatgact caacagaggt agttgagctg tgggagcttg agcccggtga catcgtcttg 420
gtacgcaatg gcgaacaaat tcccgtcgat ggaaacgtga ttgcgggtgt cggtggaatt 480
gatgaatcca acatcacggg tgaatcaatg ccggctgaaa agggtcaagg ctctgatgtg 540
tatgcaggaa cctggctgcg atctggtgtt ttgagagtcg aggcaacagg aattggttca 600
gactcaactt tggcaaaaat cattcaccgc gttgaagacg cccaggatga caaagcccgc 660
acacaaacat tcttagagaa attctctaag tggtacaccc cgggcgtcat gatcgccgcc 720
gcagtggtgg gacttatcac ctgggacgta gaactagcac tgacgctctt agtgatcggc 780
tgccccggcg cgttggttat ctccatcccg gtgtccatcg tcgcaggcat cggccgtgct 840
gcacgcgatg gcgtgctgat caagggtgga gaatacctag aaaccgccgc gaaagtcgac 900
gtcgttgtcg tggacaaaac tggaacgctg accaccggcc gcccagaact cacagacgta 960
gaagtcatcg agcccgccta cagccagggc gaggtgctgg agctcgccgc gcgcgccgag 1020
acggcttcag aacatccgct tgccgacgcc atcatccgtg gtgcccagga tcgggggctg 1080
tccacaacat tggtggaagc agctgaaaac atcaccggcc gaggcattat cgcaaatgtt 1140
gatggacagg cagttgctgt tggatctgct gagttacttg atcatgaacc agactcgacc 1200
aggatcctgg agctaaatgc cgaaggaaag accgcgatgt ttgtcggagt gaacggacac 1260
gccattggaa tcgtggccgt cgccgacgcc gttcgttcag attctgcctc agcaatcgaa 1320
tcgctgcata aggcgggcat tcaagttgtc atggcgactg gcgacgctca ccgcgttgca 1380
caaaacgtgg cctccaagct gggagtggat gaagtctact cagagctact ccctgaacag 1440
aaattagaac tggtgcgtga tctgcaagct gccggcaaaa cggtcgcgat ggtgggtgac 1500
ggagtcaacg acaccccagc attggcagct gctgatatcg gagtagcgat gggcgtggca 1560
ggttcccctg cagccattga aaccgctgat atcgcactca tggcggatcg tctcccacgg 1620
ctggcacatg cagtgacctt ggcaaaacgc accgtaagaa ccatgcgcat caatattctg 1680
attgcgttgg ctaccgtgat ggtgttacta gctggcgtcc tatttggcgg agttaccatg 1740
tcggttggca tgctcgttca cgaagcaagc gtgctgcttg ttatcagcat cgccatgctg 1800
ttgctgcgtc caacacttaa agaagatgct gcgcaagcaa gtgatattaa acgctcggaa 1860
atacaacaga tcgcataa 1878
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
attcgagctc ggtacccggg gatcctgcac cgtcagccgc 40
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccatccact aaacttaaac agcattatcc ctaatcgccc at 42
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtttaagtt tagtggatgg gttctcgcac tgacagtcgc 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgacggccag tgccaagctt cgcgaaaggc acgatgatgt 40
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcggatccc caaatccctg gatgttattc 30
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttttgcgcc ctcacgaatc gcgtcacccg tgagataaga ctcatc 46
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacgcgattc gtgagggcgc aaaag 25
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cccaagcttt gcttcggacg tgacatcgga g 31
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gccaaaacag aagcttatga gtttgctatt tgttgtggcg 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aatgtccctg accagcattc atcggtttgc ctcctctttg 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caaagaggag gcaaaccgat gaatgctggt cagggacatt 40
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggtaccaga tctccgcggc taagaaactt tttcttgcgt atcaaaat 48
<210> 17
<211> 964
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Ser Leu Leu Phe Val Val Ala Leu Ala Val Ile Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ile Ser Val Lys Val Ile Asp Arg Lys Ala Gly Trp Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ile Phe Ala Val Ala Ala Tyr Phe Leu Val Arg Glu Ala Gly
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Gly Gln Ala Leu Thr Trp Asp Ile Thr Trp Val Arg
50 55 60
Asp Ile Leu Gly Ser Gly Val Asp Val Lys Phe Ala Leu Arg Ala Asp
65 70 75 80
Ala Leu Ser Leu Phe Phe Ala Leu Leu Ala Leu Val Ile Gly Ala Val
85 90 95
Val Phe Val Tyr Ser Ala Glu Tyr Leu Pro Arg Lys Lys Gly Asn Thr
100 105 110
Ser Phe Tyr Thr Ile Met Thr Ala Phe Thr Ala Ala Ile Leu Leu Leu
115 120 125
Val Leu Ala Asp Asp Val Phe Val Leu Phe Val Gly Trp Glu Leu Val
130 135 140
Ser Leu Ala Ser Phe Met Leu Ile Ala Arg Ser Gly Ser Ser Gly Glu
145 150 155 160
Ser Gly Ser Ile Arg Thr Leu Ile Leu Thr Phe Phe Gly Gly Leu Thr
165 170 175
Leu Leu Thr Ala Val Ala Ile Ala Ala Thr Gln Ala Gly Thr Thr Ser
180 185 190
Leu Asp Gly Ile Leu His Ser Asp Phe Trp Ala Glu Lys Pro Val Leu
195 200 205
Thr Gly Val Ile Ala Val Leu Ile Ala Met Ser Ala Phe Thr Lys Ser
210 215 220
Ala Gln Phe Pro Phe His Phe Trp Leu Pro Glu Ala Met Ala Ala Ala
225 230 235 240
Thr Pro Val Ser Ala Phe Leu His Ala Ala Ala Val Val Lys Ala Gly
245 250 255
Ile Tyr Leu Leu Leu Arg Phe Ser Ile Val Phe His Asp Val Ala Val
260 265 270
Trp Asn Trp Leu Leu Ile Ile Val Gly Met Gly Thr Ala Ile Met Ser
275 280 285
Ala Tyr Phe Ala Val Gln Lys Thr Asp Leu Lys Lys Leu Thr Ala Tyr
290 295 300
Ser Thr Val Ser His Leu Gly Trp Ile Val Ala Thr Ile Gly Val Gly
305 310 315 320
Thr Pro Phe Ala Leu Gly Ala Ala Ile Val His Thr Leu Ser His Ala
325 330 335
Leu Phe Lys Ser Ser Leu Phe Met Leu Ile Gly Val Ile Asp His Gln
340 345 350
Thr Gly Thr Arg Asp Ile Arg Arg Leu Gly Phe Leu Val Lys Lys Met
355 360 365
Pro Phe Thr Phe Val Ser Val Leu Ile Gly Ala Leu Ser Met Ala Ser
370 375 380
Val Pro Pro Leu Leu Gly Phe Val Ser Lys Glu Gly Met Ile Thr Ala
385 390 395 400
Phe Met Asp Ala Pro Ile Gly Asn Ser Tyr Val Val Leu Leu Leu Val
405 410 415
Gly Ala Ala Ile Gly Ala Val Leu Thr Phe Thr Tyr Ser Ala Lys Leu
420 425 430
Val Leu Gly Ala Phe Val Asp Gly Pro Arg Asp Met Ser His Val Lys
435 440 445
Glu Ala Pro Val Ser Leu Trp Leu Pro Ala Ala Leu Pro Gly Leu Met
450 455 460
Ser Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Ser Leu Phe Asp Ala Pro Val Ser
465 470 475 480
Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ala Gly Glu Ala Ala His Met His Leu Ala
485 490 495
Leu Trp His Gly Ile Asn Thr Pro Leu Leu Ile Ser Leu Gly Val Leu
500 505 510
Val Ala Gly Ile Leu Gly Val Leu Phe Arg Lys Glu Leu Trp Lys Ile
515 520 525
Ala Glu Thr Ser Pro Phe Pro Ile Ala Thr Gly Asn Asp Ile Leu Ser
530 535 540
Met Leu Val Tyr Arg Ala Asn Leu Leu Gly Lys Phe Phe Gly Arg Met
545 550 555 560
Ala Asp Ser Met Ser Pro Arg Arg His Leu Val Ser Leu Ile Val Leu
565 570 575
Leu Trp Ala Leu Ala Ala Phe Ala Thr Ile His Pro Ser Val Gln Leu
580 585 590
Ala Pro Lys Gln Pro Gly Ile Asp Arg Trp Ile Asp Leu Ile Pro Leu
595 600 605
Ala Ile Ile Ala Leu Ser Val Phe Gly Leu Leu Thr Thr Arg Asn Arg
610 615 620
Leu Ser Ala Ala Val Leu Val Gly Thr Val Gly Val Gly Val Ser Phe
625 630 635 640
Gln Met Leu Leu Leu Gly Ala Pro Asp Val Ala Leu Thr Gln Phe Leu
645 650 655
Val Glu Gly Leu Val Val Val Ile Ile Met Met Val Val Arg His Gln
660 665 670
Pro Ala Asn Phe Lys Arg Ile Lys Pro Ser Arg Arg Arg Ser Thr Val
675 680 685
Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Phe Ala Ala Phe Met Ala Val Trp Gly
690 695 700
Leu Leu Gly Arg His Glu Arg Ser Glu Leu Ala Met Trp Tyr Leu Asn
705 710 715 720
Gln Gly Pro Glu Ile Thr Ser Gly Ala Asn Val Val Asn Thr Ile Leu
725 730 735
Val Glu Phe Arg Ala Leu Asp Thr Leu Gly Glu Leu Ser Val Leu Gly
740 745 750
Met Ala Ala Val Val Ile Gly Ala Met Val Ala Ser Met Pro Arg His
755 760 765
Pro Phe Ala Lys Gly Thr His Pro Arg Pro Phe Gly Gln Ser Gln Leu
770 775 780
Asn Ser Ile Pro Leu Arg Met Leu Leu Lys Val Leu Val Pro Ala Leu
785 790 795 800
Cys Phe Leu Ser Phe Met Val Phe Met Arg Gly His Asn Asp Pro Gly
805 810 815
Gly Gly Phe Ile Ala Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ala Leu Met Leu Leu
820 825 830
Tyr Leu Ser Lys Ala Lys Asp Gly Arg Ile Phe Arg Pro Asn Val Pro
835 840 845
Phe Ile Leu Thr Gly Ala Gly Ile Leu Met Ala Val Phe Ser Gly Val
850 855 860
Leu Gly Leu Thr His Gly Ser Phe Leu Tyr Ala Ile His Phe Asn Phe
865 870 875 880
Val Gly Gln His Trp Thr Thr Ser Met Ile Phe Asp Leu Gly Val Tyr
885 890 895
Leu Ala Val Leu Gly Met Val Ser Met Ala Ile Asn Gly Leu Gly Gly
900 905 910
Tyr Leu Arg Pro Gly Thr Asp Ile Ala Asp Leu Asp Tyr Ala Arg Arg
915 920 925
Ser Gly Pro Leu Pro Ala Thr Pro Thr Val Glu Pro Glu Pro Glu Gly
930 935 940
Asp Glu Asp Trp Pro Glu Pro Ile Asn Pro Ala Gly Asp Asn Lys Glu
945 950 955 960
Glu Ala Asn Arg
<210> 18
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Leu Val Arg Asp Ile Phe Met Gly Asp Asn Gly Val Met Asn Lys
1 5 10 15
Lys Leu Asn Thr Pro Asn Pro Trp Met Leu Phe Ile Arg Ser Phe Asp
20 25 30
Gly Ile Ile Thr Val Ala Ala Leu Val Ala Ile Ala Ile His Leu Ile
35 40 45
Leu Trp Leu Ala Leu Asp Leu Asp Gly Leu Ala Lys Asn Trp Pro Leu
50 55 60
Ile Ala Ile Val Ile Val Gly Gly Ile Pro Leu Met Trp Asp Val Leu
65 70 75 80
Lys Ser Ala Ile Lys Thr Arg Gly Gly Ala Asp Thr Leu Ala Ala Val
85 90 95
Ser Ile Ile Thr Ser Val Leu Leu Gly Glu Trp Leu Val Ala Ala Ile
100 105 110
Ile Val Leu Met Leu Ser Gly Gly Glu Ala Leu Glu Glu Ala Ala Ser
115 120 125
Arg Arg Ala Ser Gly Thr Leu Asp Ala Leu Ala Arg Arg Ala Pro Ser
130 135 140
Thr Ala His Arg Leu Leu Gly Ala Thr Ile Leu Asp Gly Thr Glu Glu
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Glu Ile Thr Val Gly Asp Leu Val Ala Val Leu Pro
165 170 175
His Glu Leu Cys Pro Val Asp Gly Glu Ile Val Ala Gly His Gly Thr
180 185 190
Met Asp Glu Ser Tyr Leu Thr Gly Glu Pro Tyr Val Val Ser Lys Ser
195 200 205
Lys Gly Ser Gln Ala Met Ser Gly Ala Val Asn Gly Asp Thr Pro Leu
210 215 220
Thr Ile Val Ala Thr Lys Leu Ala His Asp Ser Arg Tyr Ala Gln Ile
225 230 235 240
Val Gly Val Leu His Glu Ala Glu Asn Asn Arg Pro Glu Met Arg Arg
245 250 255
Met Ala Asp Arg Leu Gly Ala Trp Tyr Thr Val Ile Ala Leu Ala Leu
260 265 270
Gly Gly Leu Gly Trp Ile Val Ser Gly Asp Pro Val Arg Phe Leu Ala
275 280 285
Val Val Val Val Ala Thr Pro Cys Pro Leu Leu Ile Ala Val Pro Val
290 295 300
Ala Ile Ile Gly Ala Ile Ser Leu Ala Ala Arg Arg Gly Ile Ile Val
305 310 315 320
Lys Asn Pro Gly Met Leu Glu Asn Ala Ser Gly Val Lys Thr Val Met
325 330 335
Phe Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Tyr Gly Arg Pro Val Ile Thr Asp
340 345 350
Ile His Thr Ala Pro Gly Val Glu Glu Asp Thr Val Leu Ala Leu Ala
355 360 365
Ala Ser Val Glu Arg Tyr Ser Arg His Pro Leu Ala Asp Ala Ile Arg
370 375 380
Glu Gly Ala Lys Ala Arg Glu Leu His Leu Pro Asp Val Val Glu Val
385 390 395 400
Ser Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Thr Gly Thr Val Gly Glu His Leu
405 410 415
Val Arg Ile Thr Asn Arg Arg Ser Thr Leu Glu Ile Asp Pro Asp Ser
420 425 430
Lys Asn Tyr Ile Pro Val Thr Ser Ser Gly Met Glu Ser Val Val Leu
435 440 445
Val Asp Asp Lys Tyr Ala Ala Leu Ile Arg Leu Arg Asp Glu Pro Arg
450 455 460
Ala Ser Ala Ser Glu Phe Ile Ala His Leu Pro Lys Lys His Lys Val
465 470 475 480
Asp Lys Leu Met Ile Ile Ser Gly Asp Arg Ala Ser Glu Val Arg Tyr
485 490 495
Leu Ala Asp Lys Val Gly Ile Asp Glu Val His Ala Glu Ala Ser Pro
500 505 510
Glu Asp Lys Leu Asn Ile Val Asn Arg His Asn Glu His Gly Ala Thr
515 520 525
Met Phe Leu Gly Asp Gly Ile Asn Asp Ala Pro Ala Met Ala Val Ala
530 535 540
Thr Val Gly Val Ala Met Gly Ala Asp Ser Asp Val Thr Ser Glu Ala
545 550 555 560
Ala Asp Ala Val Ile Leu Asp Ser Ser Leu Glu Arg Leu Asp Asp Leu
565 570 575
Leu His Ile Ser Ala Arg Met Arg Arg Ile Ala Leu Gln Ser Ala Gly
580 585 590
Gly Gly Met Ala Leu Ser Val Ile Gly Met Ile Leu Ala Val Phe Gly
595 600 605
Phe Leu Thr Pro Leu Met Gly Ala Ile Phe Gln Glu Val Ile Asp Val
610 615 620
Leu Ala Ile Leu Asn Ser Ala Arg Val Ala Leu Pro Arg Gly Ala Ile
625 630 635 640
Ser Asp Phe Asp Thr Gln Glu Lys Val Ser
645 650

Claims (10)

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌过表达了单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
2.如权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以pDXW-10作为表达载体。
3.如权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以菌株保藏编号为CGMCC NO.0890的钝齿棒杆菌作为宿主。
4.如权利要求1-3任一所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，编码所述Mrp1A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求1-3任一所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，编码所述CTAP1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种促进钝齿棒杆菌合成L-精氨酸的方法，其特征在于，所述方法是在钝齿棒杆菌中过表达单价阳离子/H+逆转运蛋白Mrp1A和阳离子转运ATP酶CTAP1；所述Mrp1A的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述CTAP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
7.一种生产L-精氨酸的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1-5任一所述的重组钝齿棒杆菌作为生产菌株发酵产L-精氨酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将OD600为20-30的重组钝齿棒杆菌接入发酵罐，发酵温度为28-32℃，pH值为6.5-7.5，搅拌速度为500-700r/min，空气流量为1-1.5vvm。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵罐的装液量为30％-40％。
10.权利要求1-5任一所述的重组钝齿棒杆菌在生产L-精氨酸或含L-精氨酸的产品中的应用。
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