CN111187799A - 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌，涉及生物技术领域，解决提高红藻糖苷转化率的问题，其技术方案要点是：包括如下步骤：以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，生产红藻糖苷；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

Description

一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域,更具体地说，它涉及一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌。

背景技术

红藻糖苷是藻类重要的光合产物，主要有三种构型，即红藻糖苷(α-D-galactopyransyl-(1-2)-glycerol)、D-异红藻糖苷和L-异红藻糖苷(α-D/L-galactopyranosyl-(1-1)-glycerol)。它是诸多藻类最主要的可溶性碳水化合物，同高等植物中的蔗糖具有同样的作用，一般占藻体干重的1.5%-8.0%。红藻糖苷在单细胞红藻中可直接作为合成细胞壁的前体物质，同时红藻糖苷参与渗透压的调节。近年来红藻糖苷在化妆品领域有着很好的应用，它不仅具有很好的保湿作用，还有显著的美白功效。

合成红藻糖苷的底物是半乳糖和甘油，合成场所是在大部分红藻的胞液内，合成后在细胞内短时间存在，在细胞新陈代谢的过程中可以被分解成为其他碳水化合物（如红藻淀粉和琼胶的前体）。

目前，红藻糖苷的生产方法主要是提取法（水-乙醇提取），然而目的产物的转化率低，使得红藻糖苷价格较高，没有在化妆品中得到广泛应用。

综上所述，本领域迫切需要开发一种新的高效生产红藻糖苷的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产红藻糖苷的方法，达到提高红藻糖苷转化率的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种生产红藻糖苷的方法，包括如下步骤：以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，生产红藻糖苷；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；

所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

本发明进一步设置为：反应温度为30℃-40℃、反应pH为4.0-6.0。

本发明进一步设置为：所述工程菌为进行诱导培养后的工程菌；所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。

本发明进一步设置为：所述出发菌为大肠杆菌。

本发明进一步设置为：所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。

本发明进一步设置为：所述出发载体为pBAD/HisB载体。

本发明的另一个目的是提供一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供上述重组菌在制备红藻糖苷中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述功能蛋白在制备重组菌中的应用；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供上述功能蛋白在制备红藻糖苷中的应用；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

综上所述，本发明具有以下有益效果：以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，生产红藻糖苷，使得红藻糖苷转化率提高，对于红藻糖苷生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

附图说明

图1为红藻糖苷的结构示意图；

图2为红藻糖苷、半乳糖和甘油的液相图谱；

图3为红藻糖苷质谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的乙酸盐缓冲液均为50mM的乙酸盐缓冲液。对于同一条件参数下的色谱图来说，待测样本中与标准品保留时间相同（±0.1min），的峰可认定为目标峰。

实施例1：一种生产红藻糖苷的方法，包括如下步骤：以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，反应温度为30℃-40℃，反应pH为4.0-6.0，具体为反应温度为37℃，反应pH为4.6，反应时间可为8-12小时，具体为10小时，生产红藻糖苷（如图1）；工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的，出发菌为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BW25113；

功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

功能基因为如下（b1）或（b2）或（b3）或（b4）：

（b1）编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

（b2）编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；

（b3）在严格条件下与（b1）或（b2）限定的DNA序列杂交且编码具有将甘油和半乳糖转化为红藻糖苷的能力的蛋白质的DNA分子；

（b4）与（b1）或（b2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有将甘油和半乳糖转化为红藻糖苷的能力的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

工程菌为进行诱导培养后的工程菌；诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。

功能基因通过重组质粒导入出发菌；重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。出发载体为pBAD/HisB载体，可为将DNA分子乙（DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成）插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。

生产红藻糖苷的方法：培养工程菌并在培养过程中进行L-阿拉伯糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体和底物（半乳糖和甘油），进行反应，得到红藻糖苷。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、半乳糖72g/L、甘油184g/L。菌体质量为湿重。缓冲体系为50mM的乙酸盐缓冲液。

具体包括如下步骤：在含50μg/mL链霉素的液体LB培养基中培养工程菌至OD600nm=0.6-0.8，然后加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、半乳糖和甘油，进行反应，得到红藻糖苷。各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、半乳糖72g/L、甘油184g/L。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的乙酸盐缓冲液。

生产红藻糖苷的方法还包括产物纯化步骤：取上述反应液5mL于锥形瓶中，用去离子水稀释10倍，加入10g活性炭，密封振荡1h后进行真空抽滤，弃去上清液，将吸附样品的活性炭用20%浓度的乙醇洗脱剂进行洗脱，密封振荡1h，再进行真空抽滤，取上清液旋蒸浓缩，后用2mL去离子水进行复溶（作为上样液）。经过活性炭吸附法分离纯化后的样品采用葡聚糖G-15层析柱（50cm×1.6cm）进一步纯化，上样量为2mL，以去离子水作为流动相，流速为0.5mL/min，每管收集5mL，弃去前50mL后开始收集，共收集20管。将收集的样品进行HPLC分析，将含有目的产物红藻糖苷的样品合并，进行旋蒸浓缩。

重组菌的构建：

步骤1、将DNA分子甲（DNA分子甲为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列2所示核苷酸组成）插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子甲。DNA分子甲与载体上的部分核苷酸形成融合基因甲，表达融合蛋白甲。融合基因甲的部分序列如序列表的序列2所示，融合蛋白甲的部分序列如序列表的序列1所示。

步骤2、将DNA分子乙（DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成）插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子乙。DNA分子乙与载体上的部分核苷酸形成融合基因乙，表达融合蛋白乙。融合基因乙如序列表的序列8所示，融合蛋白乙如序列表的序列7所示。

步骤3、将DNA分子丙（DNA分子丙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列6所示核苷酸组成）插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒丙。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子丙。DNA分子丙与载体上的部分核苷酸形成融合基因丙，表达融合蛋白丙。融合基因丙的部分序列如序列表的序列6所示，融合蛋白丙的部分序列如序列表的序列5所示。

步骤4、将步骤1得到的重组质粒甲导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅰ。

步骤5、将步骤2得到的重组质粒乙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅱ。

步骤6、将步骤3得到的重组质粒丙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅲ。

应用重组菌制备红藻糖苷：

试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ或重组菌Ⅲ。

1、取试验菌株的单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm=0.6～0.8。

2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时。

3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

4、制备红藻糖苷

反应体系的组成：步骤3得到的菌体沉淀、甘油、半乳糖和乙酸盐缓冲液。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体浓度10g(湿重)/L、半乳糖72g/L、甘油184g/L。

反应条件：37℃振荡反应12小时。

5、进行HPLC检测。

HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)；

流动相：硫酸溶液（5 mmol/L）。

流速：0.5 mL/min；

温度：30℃；

检测器：RID。

结果见表2

	反应结束后，反应体系中的红藻糖苷浓度	转化率(相对于半乳糖)
			重组菌Ⅰ	30g/L	6%
重组菌Ⅱ	80g/L	16%
			重组菌Ⅲ	75g/L	15%

表2

以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，生产红藻糖苷，使得红藻糖苷转化率提高，对于红藻糖苷生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

产物红藻糖苷的分离纯化：

1、取反应液5mL于锥形瓶中，用去离子水稀释10倍，加入10g活性炭，密封振荡1h后进行真空抽滤。

2、弃去上清液，将吸附样品的活性炭用20%浓度的乙醇洗脱剂进行洗脱，密封振荡1h，再进行真空抽滤，取上清液旋蒸浓缩，后用2mL去离子水进行复溶（作为上样液）。

3、将上述2mL样品采用葡聚糖G-15层析柱（50cm×1.6cm）进一步纯化，以去离子水作为流动相，流速为0.5mL/min，每管收集5mL，弃去前50mL后开始收集，共收集20管。

4、将收集的样品进行HPLC分析，将含有目的产物红藻糖苷的样品合并，进行旋蒸浓缩。

5、样品的液质连用检测分子量。 检测条件：氨基柱，流动相80%乙腈（含1‰氨水），流速0.5mL/min，柱温35℃，进样量1μL，分析时间30min。样品全扫描，选负离子检测（金属离子检测不到，即标准品GAG中的钠检测不到，且样品分子量会减一个H的量，即所买标品（含钠）的分子量在液质中显示为277-23-1=253，半乳糖分子量在液质中显示为180-1=179）。和标准品的一致，生成的产物为甘油半乳糖苷。

实施例2：一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；出发载体为pBAD/HisB载体；出发菌为大肠杆菌BW25113。重组质粒具体可为将DNA分子乙（DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成）插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的。

功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

实施例3：实施例2中的重组菌在制备红藻糖苷中的应用；

实施例4：实施例1或实施例2中功能蛋白在制备重组菌中的应用；

功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

实施例5：实施例1或实施例2中功能蛋白在制备红藻糖苷中的应用；功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列1、738aa，LpGLA（Lactobacillus plantarum）

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 1

Met Ala Val Thr Leu Gln Gln Thr Leu Ile Asp Ile Asp Glu Glu Gln

1 5 10 15

Leu Val Phe His Leu His Asn Asp Gln Ile Ser Tyr Ile Leu Gly Val

20 25 30

Glu Thr Gly Asn Val Leu Ala His Leu Tyr Phe Gly Pro Arg Val Arg

35 40 45

Gly Tyr His Gly Glu Arg Gln Tyr Pro Arg Ile Asp Arg Gly Phe Ser

50 55 60

Gly Asn Leu Pro Asn Thr Thr Asp Arg Ser Tyr Ser Lys Asp Asp Leu

65 70 75 80

Pro Gln Glu Tyr Gly Gly Asn Asn Thr Gly Asp Tyr Arg Gln Pro Ala

85 90 95

Ala Ile Ile Arg Ala Ala Asn Gly Ala Arg Thr Val Asp Phe Arg Tyr

100 105 110

Gln Asp Cys Arg Met Glu Ala Gly Lys Pro Glu Leu Lys Gly Leu Pro

115 120 125

Gln Thr Tyr Val Glu Asp Glu Asp Glu Ala Gln Thr Leu Ile Val Thr

130 135 140

Leu Arg Asp Ala Thr Leu Gly Val Thr Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Ile

145 150 155 160

Tyr Arg Asp Arg Pro Val Ile Thr Arg Ser Ala Arg Leu Ile Asn His

165 170 175

Ser Glu Gln Ala Val Asp Leu Glu Lys Val Ala Ser Met Gln Met Asp

180 185 190

Leu Pro Thr Gln Pro Leu Asp Ala Ile Ser Leu Pro Gly Ser Tyr Ala

195 200 205

Arg Glu Arg Gln Leu Ser Arg Glu Arg Leu His Arg Gly Val Thr Gln

210 215 220

Phe Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser Ser His His Met Asn Pro Phe Val

225 230 235 240

Ala Leu Ala Asp Pro Asn Thr Asn Glu Phe Gln Gly Asn Val Leu Gly

245 250 255

Ala Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Asn His Gln Ile Ser Leu Glu Arg Asp

260 265 270

Pro Ile Gly Gln Thr Arg Leu Thr Met Gly Ile Asn Glu Tyr Asn Phe

275 280 285

Asp Trp Arg Leu Ala Ala Gly Asp Ser Phe Gln Thr Pro Glu Val Ala

290 295 300

Met Val Tyr Ser Thr Thr Gly Leu Asn Gly Met Ser Gln Thr Tyr His

305 310 315 320

Asp Leu Leu Arg Asp Arg Val Ala Arg Ser Arg Tyr Lys His Asp Leu

325 330 335

Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asp

340 345 350

Ala Asp Lys Ile Gln Ser Ile Leu Asp Ala Ala Ala Pro Leu Gly Ile

355 360 365

Glu Met Phe Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly His Arg Asn Asp Asp

370 375 380

Asn Ser Ser Leu Gly Asp Trp Phe Val Asn Arg Asn Lys Leu Pro Gly

385 390 395 400

Gly Leu Ala Asp Ile Ser Lys Arg Thr His Asp Lys Gly Met Arg Phe

405 410 415

Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ala Asp Ser Asp Leu Tyr

420 425 430

Arg Ala His Pro Asp Trp Val Leu Gly Val Pro Asp Arg Gly Arg Thr

435 440 445

Leu Ser Arg Asn Glu Tyr Val Leu Asp Phe Ser Gln Pro Asp Val Val

450 455 460

Asp Asn Ile Phe Glu Gln Met Thr Ala Val Leu Asp Lys Val Pro Ile

465 470 475 480

Asp Tyr Ile Lys Trp Asp Met Asn Arg Asn Leu Thr Glu Val Tyr Ser

485 490 495

Pro His Ser Asp Ser Thr His Glu Gly Glu Thr Ser His Arg Phe Ile

500 505 510

Leu Gly Val Tyr Asp Leu Met Glu Arg Leu Thr Lys Arg Tyr Pro Gln

515 520 525

Ile Leu Phe Glu Gly Cys Ser Gly Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly

530 535 540

Leu Met Tyr Tyr Met Pro Gln Ser Trp Pro Ser Asp Asn Asn Asp Pro

545 550 555 560

Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Tyr Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile

565 570 575

Ser Ala Ile Thr Ala His Val Gly Thr Ser Pro Asp Glu Leu Leu Gly

580 585 590

Arg Ser Thr Ser Met Lys Met Arg Gly Ala Val Ala Met Ser Gly Thr

595 600 605

Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Ala Ala Gln Leu Ser Asp Ala Asp Lys Gln

610 615 620

Ala Val Lys Arg Gln Val Ala Phe Tyr Lys Gln His Arg Glu Leu Val

625 630 635 640

Gln Tyr Gly Thr Phe Tyr Arg Leu Glu Ser Pro Phe Glu Ser Asn Thr

645 650 655

Val Ala Trp Met Phe Val Ser Pro Asp Gln Lys Glu Ala Leu Leu Leu

660 665 670

Thr Phe Val Ile Leu Gly Ala Val Gln Pro Glu Pro His Ile Thr Lys

675 680 685

Leu Ala Gly Leu Asp Pro Gln Gln Thr Tyr Val Glu Thr Asp Thr Asn

690 695 700

Lys Met Tyr Gly Gly Asp Glu Leu Met Gln Leu Gly Leu Tyr Thr Thr

705 710 715 720

Pro Val Gln Thr Ser Asp Phe Thr Ala Gln Val His Tyr Phe Lys Ala

725 730 735

Lys Asp

序列2、2217bp，LpGLA（Lactobacillus plantarum）

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 2

<211> 2217

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 2

atggcagtaa cgttgcagca aactttaatt gacattgatg aagaacaact tgtctttcac 60

ctgcataacg atcaaatctc gtatattcta ggtgtggaga caggcaacgt gttggcccac 120

ttgtactttg gcccacgggt tcggggttat catggcgagc gtcagtatcc ccggattgat 180

cgggggttct caggaaattt accgaatacg actgatcgaa gctattccaa ggatgatttg 240

ccacaggaat acggtggcaa taataccggt gattatcggc aacccgccgc gattattcgc 300

gcggccaatg gtgctcgaac agttgatttt cgttatcaag actgccggat ggaagccggt 360

aagccggaac ttaagggctt gccacaaact tatgtcgaag atgaggatga agcccaaact 420

ttgattgtga cgttgcgaga tgccacatta ggcgtgacac tcgaattagc ctacacgatt 480

tatcgggatc ggccagttat cacgcgtagc gcccggttga ttaatcacag tgagcaagct 540

gtcgacttag aaaaagtggc ttcgatgcag atggacctgc caacccaacc attagatgcc 600

atttcgttac ctggaagcta tgcgcgtgag cgccagctta gtcgtgaacg gctccatcga 660

ggtgtaactc agtttgaaag tcgccggggt gctagttctc atcatatgaa tccttttgtg 720

gcgctagctg atccgaatac taatgaattt caaggcaatg tccttggtgc attgctaatt 780

tattcaggta accaccagat tagtttagaa cgggacccaa ttggtcagac acgcttgact 840

atgggaatca atgaatataa cttcgactgg cgattggcgg ccggtgatag tttccaaacg 900

cccgaggttg caatggtata ctcgacgacg gggcttaatg gtatgtcgca aacctaccat 960

gatttattgc gtgatcgcgt ggcgcgcagt cgttacaagc acgatctccg gccgatcttg 1020

atcaacaatt gggaagccac ttactttgac tttgatgcgg acaagattca atcaatcttg 1080

gatgctgcag caccactggg tatcgaaatg tttgtgctgg atgacggttg gttcggtcat 1140

cgaaatgatg ataatagttc gctaggtgac tggtttgtta atcggaacaa gttaccagga 1200

ggcttagcgg atattagcaa acggacccat gataaaggga tgcggttcgg actttggttc 1260

gagccagaaa atatttcagc cgattccgat ctttatcggg cccatcctga ttgggtgtta 1320

ggcgtaccag atcgtggccg aacgttatcg cggaacgaat acgtgcttga tttcagccag 1380

ccggatgttg tcgacaatat ttttgaacaa atgaccgcag ttcttgataa ggtgcccatt 1440

gattatatca agtgggatat gaaccgcaat ttaacggaag tctattcgcc acatagcgat 1500

tcaactcatg aaggtgagac tagccaccgc tttatcttag gtgtatatga cttgatggag 1560

cgtttaacaa aacgctatcc acagatctta tttgaaggct gctctggcgg tggtggccgc 1620

tttgatgctg gtttaatgta ttatatgcca cagagttggc catcagataa taatgacccg 1680

attgaacggc tcaaaattca atatgggact tcactcgttt atccaatttc tgcaattacc 1740

gcccatgttg ggacgagccc ggatgaattg ttaggacggt cgacgtcgat gaagatgcgt 1800

ggtgctgtgg caatgagtgg taccttgggc tatgaactgg acgcggccca actaagtgat 1860

gcggacaagc aggccgttaa aagacaggtt gccttctata agcagcaccg tgagttagtt 1920

caatacggga ccttttatcg attagagagc ccgtttgaat ctaatacggt ggcgtggatg 1980

tttgttagtc cggatcagaa agaagccttg ctgctcacct tcgttatttt aggtgcagtt 2040

caaccagaac cgcatattac gaagttagcg ggattagacc ctcagcagac ctacgttgag 2100

accgacacaa acaaaatgta cggtggcgat gaattgatgc aactaggact ctacacgact 2160

cccgttcaaa ctagtgactt tacggcgcag gtacattact tcaaggctaa ggactaa 2217

序列3、728aa，AhGLA（Alicyclobacillus hesperidum）

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 3

<211> 728

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus hesperidum

<400> 3

Met Thr Ile His Tyr Asp Glu Glu Arg Arg Ile Phe His Val Gln Ala

1 5 10 15

Lys Gly Thr Ser Tyr Val Met Ala Val Ser Ser Glu Gly Thr Leu Leu

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Gln Glu Ile Gln Asp Ala Gly Ala Leu Leu Gly

35 40 45

Leu Leu Gln Ile His Arg Gly Ser Pro Thr Gly Pro Val Gln Pro Ala

50 55 60

Asn Ala Asp Val Gly Thr Trp Pro His Glu Phe Pro Ala Phe Gly Met

65 70 75 80

Gly Asp His Arg Ser Pro Ala Tyr Val Val Gln Arg Phe Asp Gly Ser

85 90 95

Ile Ala Ser Cys Leu Thr Tyr Val Gly His Arg Ile Val Pro Gly Lys

100 105 110

Pro Lys Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Val Glu Ser Asp Glu Glu

115 120 125

Ala Glu Thr Leu Glu Ile Glu Leu Leu Asp Pro Val Leu Arg Leu Arg

130 135 140

Val Ile Leu Arg Tyr Thr Ala Phe Ala Gln His Ser Ala Ile Ala Arg

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Ser Ala Thr Phe Ile Asn Asn Ser Asp Glu Ser Phe Gln Leu Gln Arg

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Ala Leu Ser Ala Ser Ile Asp Met Ala Gly Ala Asp Tyr Ala Phe Leu

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Gln Leu Ser Gly Ala Trp Ile Arg Glu Arg Phe Val Glu Leu Arg Gln

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Leu Val Pro Gly Glu Gln Ser Val Tyr Ser Arg Ser Gly Met Ser Gly

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His Lys His Asn Pro Phe Ile Ala Leu Val Ala Pro Arg Ala Asp Glu

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Glu His Gly Asp Val Tyr Gly Phe Ser Leu Val Tyr Ser Gly Asn Phe

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Leu Ala Lys Ala Glu Val Glu Pro Met Arg Gln Ser Val Arg Val Gln

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Lys Ala Gly Ser Glu Leu Gly Val Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

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Val Glu Ala Cys Gly Met Gln Phe Gly Ile Trp Met Glu Pro Glu Met

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Val Ser Pro Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Gln His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Ala Glu Arg Pro Arg Ser Glu Arg Arg Asn Gln Leu Thr Leu

435 440 445

Asp Leu Ser Arg Pro Asp Val Cys Asp Phe Ile Val Glu Ala Val Ser

450 455 460

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465 470 475 480

Arg Pro Met Thr Glu Val Gly Ser Ala Thr Leu Pro Pro Glu Arg Gln

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Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Glu

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515 520 525

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Gly Thr Ser Ile Val Tyr Pro Ala Ser Ser Met Gly Ala His Val Ser

565 570 575

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Gly His Val Ala Met Ser Gly Asn Phe Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Ser

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Arg Phe Thr Ala Glu Glu Arg Glu Leu Ala Lys Gln Gln Val Ala Ala

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<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

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<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

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Leu Leu Pro Gly Gly Leu Ile Arg Gln Arg Ala Thr Leu Arg Asn Leu

165 170 175

Pro Ala Gly Asn Leu Leu Thr Gly Asp Leu Glu Val Gly Lys Val Glu

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Leu Gly Phe Pro Leu Pro Ala Leu Ala Thr Glu Ile Leu Thr Thr Thr

195 200 205

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Pro Arg Pro Val Ile Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Asp His

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675 680 685

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序列6、2280bp，BbGLA（Bifidobacterium bifidum）

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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序列7、764aa 融合蛋白乙

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 7

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

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1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

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35 40 45

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Val Pro Gly Lys Pro Lys Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Val Glu

145 150 155 160

Ser Asp Glu Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Glu Leu Leu Asp Pro Val

165 170 175

Leu Arg Leu Arg Val Ile Leu Arg Tyr Thr Ala Phe Ala Gln His Ser

180 185 190

Ala Ile Ala Arg Ser Ala Thr Phe Ile Asn Asn Ser Asp Glu Ser Phe

195 200 205

Gln Leu Gln Arg Ala Leu Ser Ala Ser Ile Asp Met Ala Gly Ala Asp

210 215 220

Tyr Ala Phe Leu Gln Leu Ser Gly Ala Trp Ile Arg Glu Arg Phe Val

225 230 235 240

Glu Leu Arg Gln Leu Val Pro Gly Glu Gln Ser Val Tyr Ser Arg Ser

245 250 255

Gly Met Ser Gly His Lys His Asn Pro Phe Ile Ala Leu Val Ala Pro

260 265 270

Arg Ala Asp Glu Glu His Gly Asp Val Tyr Gly Phe Ser Leu Val Tyr

275 280 285

Ser Gly Asn Phe Leu Ala Lys Ala Glu Val Glu Pro Met Arg Gln Ser

290 295 300

Val Arg Val Gln Ile Gly Ile His Pro Asp Asp Phe Ser Trp Leu Leu

305 310 315 320

Glu Pro Gly Ala Ser Phe Gln Ser Pro Glu Ala Val Leu Val Tyr Ser

325 330 335

Asp Arg Gly Ile Gly Glu Met Ser Arg Thr Tyr His Arg Leu Tyr Arg

340 345 350

Thr Arg Leu Ala Arg Gly Arg Tyr Arg Asp Glu Pro Arg Pro Val Leu

355 360 365

Val Asn Asn Trp Glu Ala Thr Tyr Phe Asn Phe Asp Ala Asp Lys Leu

370 375 380

Val Glu Ile Ala Lys Ala Gly Ser Glu Leu Gly Val Glu Leu Phe Val

385 390 395 400

Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Lys Arg Asp Ser Asp Asn Cys Ser Leu

405 410 415

Gly Asp Trp Tyr Pro Asp Pro Arg Lys Leu Pro Gly Gly Leu Ala Asp

420 425 430

Val Ala Lys Arg Val Glu Ala Cys Gly Met Gln Phe Gly Ile Trp Met

435 440 445

Glu Pro Glu Met Val Ser Pro Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Gln His Pro

450 455 460

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Gln Leu Thr Leu Asp Leu Ser Arg Pro Asp Val Cys Asp Phe Ile Val

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Asp Val Leu Glu Arg Ile Thr Thr Ala Phe Pro Asp Val Leu Phe Glu

545 550 555 560

Ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Met Leu Tyr Tyr

565 570 575

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580 585 590

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Leu Asp Leu Ser Arg Phe Thr Ala Glu Glu Arg Glu Leu Ala Lys Gln

645 650 655

Gln Val Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Arg Ser Leu Val Gln Phe Gly Asp

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675 680 685

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序列8、2295bp 融合基因乙

SEQUENCE LISTING

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 一种生产红藻糖苷的方法及其专用工程菌

<130> 2018.11.7

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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tcacctgcct acgtggtgca gcgttttgat ggtagcatcg ctagttgctt aacctatgtg 420

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tcggatgaag aagcggagac gctagaaatt gagttgctgg atccagtgtt gcgtttgcgt 540

gtcattctgc gctacacggc gtttgcacag cacagtgcta tagcgcggtc ggccactttc 600

atcaacaata gcgatgagtc atttcagctt cagcgcgcgc tttctgcctc cattgacatg 660

gcgggagccg attatgcgtt tttgcaactc tccggggcgt ggattcgcga gcgatttgtg 720

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cacaaacaca atccgtttat cgccttggtt gctccgagag cggacgaaga acatggcgat 840

gtgtatggat tcagcctcgt ctacagtggc aattttctcg cgaaggcaga agttgaaccg 900

atgcgccaga gcgtccgtgt acaaataggc atccatcccg atgatttttc atggttgctt 960

gaaccaggtg cgtcgtttca gtcacccgag gccgtgttgg tctattctga cagagggatc 1020

ggtgagatgt cgcggactta tcatcggttg taccgaacgc gccttgctcg tggtcgctat 1080

cgggacgaac cgagaccggt gcttgtgaac aattgggagg caacgtactt caactttgac 1140

gccgacaagc ttgtcgagat cgctaaggct ggcagtgaat tgggtgtgga actatttgtg 1200

ctcgatgacg ggtggtttgg caagcgtgac agcgacaact gttcgcttgg tgactggtat 1260

ccggatcctc gcaagttgcc tggaggactt gcagatgtcg ccaagcgcgt cgaggcttgt 1320

ggaatgcaat ttggcatctg gatggaaccc gaaatggtct ctccggacag cgacttgtat 1380

cgccaacacc cggactggtg cttacacgtc gcggagcggc cgcgctccga gcgccgcaac 1440

cagttgacct tggatctatc gcgtcccgac gtctgtgatt ttattgtcga ggcggtatcc 1500

aatgtgctcc atagcgcacc catccgctat gtgaagtggg acatgaacag gccgatgacc 1560

gaggttgggt cggctacctt gccaccggag cgtcagcgcg aaacggcaca tcgctatatg 1620

ctcgggttgt acgacgtact cgaacgcatc acaacggcgt tccccgacgt cttgtttgaa 1680

agttgtgcat caggtggcgg gcgatttgac cctggcatgc tgtactacat gccacagaca 1740

tggacgagcg acaacacgga tgcggtctcg cggctcaaaa ttcaatatgg gaccagcatt 1800

gtgtatccag cgagcagtat gggtgcgcac gtctctgccg tgccgaacca tcagatgcat 1860

cggctaacgc ctttatcgtt tcgcggtcat gttgctatgt ctgggaattt cggctacgaa 1920

ctcgatttgt ctaggttcac ggcggaagaa agggaattgg ccaaacagca agtggcagcc 1980

tacaagtcca tccgcagtct ggtgcagttt ggcgattttt atcgtctgct gagccctttt 2040

gaaggaaacg aaacggcgtg gatgttcgtc tctgcacagc aggacgaggc ttatatggcg 2100

tattttcgcg tgtttcccga tccgctgcag ccagtcaggc gcttgcgcct ccggggcctg 2160

cgggaatcga catactatcg aatcgaggag accggggaag tctatctagg agagttgctc 2220

atgcgtgttg gcatgaacat gcccttgatg gatggagatt atcagagtgt cacaatgagg 2280

ttgcgcaaag tttga 2295

Claims (10)

1.一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：以甘油和半乳糖为原料，在工程菌或者在功能蛋白的作用下，生产红藻糖苷；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；

所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，反应温度为30℃-40℃、反应pH为4.0-6.0。

3.根据权利要求1所述的一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，所述工程菌为进行诱导培养后的工程菌；所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，所述出发菌为大肠杆菌。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。

6.根据权利要求5所述的一种生产红藻糖苷的方法，其特征在于，所述出发载体为pBAD/HisB载体。

7.一种重组菌，其特征在于，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

8.权利要求7所述重组菌在制备红藻糖苷中的应用。

9.功能蛋白在制备重组菌中的应用；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

10.功能蛋白在制备红藻糖苷中的应用；所述功能蛋白为如下（a1）或（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列1、序列3、序列5所示的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

（a3）序列表的序列7所示的蛋白质。

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