CN109628476B - 一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用全细胞转化生产4‑羟基异亮氨酸的方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了一段可用于编码L‑异亮氨酸羟化酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将此基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，可使枯草芽孢杆菌能够高效合成比酶活高且4‑羟基异亮氨酸转化率高的L‑异亮氨酸羟化酶；将本发明的枯草芽孢杆菌工程菌培养12～24h，即可使粗酶液中的L‑异亮氨酸羟化酶的酶活高达171.67U/mL；利用本发明的的枯草芽孢杆菌工程菌生产得到的L‑异亮氨酸羟化酶比酶活和4‑羟基异亮氨酸转化率均较高，其中，比酶活可达437.6U/mg，4‑羟基异亮氨酸转化率可达99.87％。

Description

一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine,4-HIL)最初是在一年生草本植物胡罗巴的种子中被发现的，它拥有80％的游离氨基酸，具有促胰岛素和抗肥胖的作用，可用于治疗糖尿病，并且，用4-羟基异亮氨酸治疗II型糖尿病可以避免很多不良反应和副作用，如治疗II型糖尿病时出现的低血糖现象。因此，4-羟基异亮氨酸是一种非常有前景的抗糖尿病药物。
此外，随着人们对4-羟基异亮氨酸研究的不断深入，有研究发现，4-羟基异亮氨酸在调节血脂、降低胆固醇水平、抗感染、抗氧化、抗衰老、保护心脏等方面也有很好的疗效，这意味着，4-羟基异亮氨酸可在包括糖尿病在内的多种慢性疾病的治疗方面都起到很好的作用。因此，人们对4-羟基异亮氨酸的需求越来越多，4-羟基异亮氨酸的市场也越来越大。
目前，4-羟基异亮氨酸的生产方法主要有以下3种：一是直接从胡罗巴中萃取分离；二是化学合成；三是酶法生物合成。
其中，萃取分离法是先用乙醇对胡罗巴进行处理以萃取原料中的氨基酸，然后用离子交换树脂对萃取物进一步洗脱纯化以得到目标产物4-羟基异亮氨酸，这种方法虽然实现了4-羟基异亮氨酸的生产，但是，却存在材料受限、工艺复杂、分离成本高、得率低和纯度较低等诸多缺点，总收率不足1％，因此，这种方法不适合4-羟基异亮氨酸的大规模生产。
化学合成法主要包括由Wang等提出的8步高效合成方法(具体可见文献：Wang Q,Ouazzani J,N.AndréSasaki,et al.A Practical Synthesis of(2S,3R,4S)ydroxyisoleucine,A Potent Insulinotropicα〢mino Acid from Fenugreek[J].European Journal of Organic Chemistry,2002,2002(5):834-839.)、Rolland等提出的六步化学合成法(具体可见文献：Valérie Rolland-Fulcrand,Rolland M,Roumestant ML,et al.Chemoenzymatic Synthesis of Enantiomerically Pure(2S,3R,4S)-4-Hydroxyisoleucine,an Insulinotropic Amino Acid Isolated from Fenugreek Seeds[J].European Journal of Organic Chemistry,2004,2004(4):873-877.)以及Smirnov等提出的的两步合成法(具体可见文献：Metabolic engineering of Escherichia coli toproduce(2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine.[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2010,88(3):719.)，但是，利用这些方法生产4-羟基异亮氨酸的产率也不够高，仅有40％左右，并且，利用这些方法生产得到的4-羟基异亮氨酸还含有其他非(2S,3R,4S)-4-HIL构型的异构体，不利于后期纯化，因此，这种方法也不适合4-羟基异亮氨酸的大规模生产。
酶法生物合成4-羟基异亮氨酸是通过将可产L-异亮氨酸羟化酶的菌株进行培养以获得L-异亮氨酸羟化酶，进而利用L-异亮氨酸羟化酶对底物进行转化以获得4-羟基异亮氨酸的，这种方法具有催化特异性强且简单高效的优势。现有的酶法生物合成主要有以下2种：一是利用L-异亮氨酸羟化酶生产菌株进行全细胞转化生成4-羟基异亮氨酸，二是以L-异亮氨酸产生菌进行改造并直接发酵来生产4-羟基异亮氨酸。其中，利用L-异亮氨酸羟化酶生产菌株进行全细胞转化生成4-羟基异亮氨酸的不足之处是需对L-异亮氨酸羟化酶进行诱导，添加诱导剂的用量和诱导时间不合适则可能形成大量包涵体，进而导致酶活低及4-羟基异亮氨酸的产量较低，例如，Sen H等(具体可见文献：Sen H,Feng S.Directedevolution and site-specific mutagenesis of l-isoleucine dioxygenase derivedfrom Bacillus weihenstephanensis[J].Biotechnology Letters,2018.)克隆了Bacillus weihenstephanensis来源的ido基因，得到了工程菌E coli BL21/pET28a-ido，利用此工程菌一次性投加底物100mM，转化24h，仅可使4-HIL的产量达26.09±1.85mM 4-HIL；Huang S等(具体可见文献：Huang S,Shi F.Directed evolution and site-specificmutagenesis of l-isoleucine dioxygenase derived from Bacillusweihenstephanensis[J].Biotechnology Letters,2018,40(19):1-9.)克隆了B.thuringiensis TCCC11826来源的ido，构建得到的工程菌E.coliΔsucAΔaceA/pWSK-ido，利用此工程菌一次性投加底物160mM，转化12h，仅可得到151.9mM 4-HIL；而以L-异亮氨酸产生菌进行改造并直接发酵来生产4-羟基异亮氨酸的不足之处是发酵时间较长且产量依旧不高，例如，卢正珂等在产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达B.thuringiensis YBT 1520来源的ido基因和mqo基因，发酵144h后，ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L(具体可见文献：卢正珂,史锋.过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响[J].食品与发酵工业,2017(10):35-40.)。因此，现有的酶法生物合成也难以实现4-羟基异亮氨酸的大规模工业生产。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可高产L-异亮氨酸羟化酶且产得的L-异亮氨酸羟化酶比酶活高、4-羟基异亮氨酸转化率高的重组菌，以提高酶法生物合成4-羟基异亮氨酸的产率。
[技术方案]
本发明提供了一段可用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体、pHT01载体、pHT43载体、pBesT502载体、pET28a载体、pXMJ19载体、pET24b载体或pDXW-10载体。
在本发明的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是通过将pMA5载体与上述一段可用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因经限制性内切酶Nde I和Mlu I酶切后连接获得的。
本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。
本发明还提供了一种生产L-异亮氨酸羟化酶的方法，所述方法为将上述宿主细胞在培养基中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基可为LB培养基、TY培养基或TB培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为25～37℃、时间为12～24h。
本发明还提供了一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，所述方法为将上述宿主细胞加入含有L-异亮氨酸的反应体系中进行转化反应。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为用缓冲液重悬权利要求4或5所述的宿主细胞至宿主细胞在缓冲液中的细胞湿重为100～200g/L，得到反应体系；在反应体系中加入细胞壁通透剂后，再加入L-异亮氨酸、α-酮戊二酸、FeSO4·7H2O以及抗坏血酸进行转化，得到4-羟基异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述转化的温度为25～40℃、pH为7～9、时间为12～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为HEPES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液或水。
在本发明的一种实施方式中，所述HEPES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液或Na2HPO4-柠檬酸缓冲液的浓度为50mmol/L、pH为7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞壁通透剂为曲拉通。
本发明还提供了上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产L-异亮氨酸羟化酶方面的应用。
本发明还提供了上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产4-羟基异亮氨酸方面的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了一段可用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)，将此基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，可使枯草芽孢杆菌能够高效合成比酶活高且4-羟基异亮氨酸转化率高的L-异亮氨酸羟化酶；
(2)将本发明的枯草芽孢杆菌工程菌培养12～24h，即可使粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶的酶活高达171.67U/mL；
(3)利用本发明的的枯草芽孢杆菌工程菌生产得到的L-异亮氨酸羟化酶比酶活和4-羟基异亮氨酸转化率均较高，其中，比酶活可达437.6U/mg，4-羟基异亮氨酸转化率可达99.87％；
(4)本发明提供了一种生产4-羟基异亮氨酸的方法，此方法为利用可表达编码L-异亮氨酸羟化酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸，利用此方法转化生产4-羟基异亮氨酸，具有转化率、产率以及产量高的优势；
(5)利用本发明的方法，结合一次性投加底物及辅因子的手段转化生产4-羟基异亮氨酸，转化21h，即可将反应体系中200mM的L-异亮氨酸转化为167.8mM的4-羟基异亮氨酸，底物剩余30.3mM，底物转化率高达84.85％，产率高达83.9％；利用本发明的方法，结合分批投加底物以及辅因子的手段转化生产4-羟基异亮氨酸，转化21h，即可将反应体系中210mM的L-异亮氨酸转化为188.9mM的4-羟基异亮氨酸，4-羟基异亮氨酸转化率高达99.87％、产率高达89.95％、产量高达27.8g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168、大肠杆菌E.coliJM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的表达载体pMA5购自优宝生物；下述实施例中涉及的HEPES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、曲拉通、L-异亮氨酸、α-酮戊二酸、FeSO4·7H2O以及抗坏血酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉2％(m/v)。
TY培养基：酵母提取物8g/L、胰蛋白胨12g/L、磷酸三钾4g/L、氯化钠3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、硫酸铵2.5g/L、硫酸镁0.24g/L。
TB培养基：蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4g/L、KH2PO4 2.31g/L、K2HPO42.54g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-异亮氨酸羟化酶酶活的检测方法：取1mL粗酶液加入含有30mM L-异亮氨酸、30mMα-酮戊二酸、1mM FeSO4·7H2O、5mM抗坏血酸和50mM pH7.0HEPES缓冲液的9mL反应体系中；于30℃下反应1h，沸水浴5～10min以终止反应；离心取上清液进行衍生化处理，HPLC 2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法测定4-HIL含量；
其中，样品衍生化处理方法：取100μL反应液加入1.5mL离心管中，之后再分别加入衍生缓冲液：0.5M pH 9.0的NaHCO3和衍生剂：1％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液(1％的FDBN)各100μL，混匀后，于60℃暗处理30min，冷水浴中冷却，最后加入1mL定容缓冲液：0.01MpH7.0的KH2PO4；
HPLC分析：2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法，用C18柱反相高效液相色谱测定；洗针：10％甲醇；洗针后进行自动进样，氨基酸洗脱方法为：流动相A(50mM NaAC，含1％N，N-二甲基甲酰胺，用HAC调pH至6.4)与流动相B(50％乙腈水溶液)梯度洗脱，0～13min,A70％～38％；13～21min,A38％～32％；21～23min,A32％～0％；23～25min,A0％～0％；25～26min,A0％～70％；26～30min,A70％～70％；T＝33℃；λ＝360nm；进样20μL；time:30min；V＝1mL/min；
L-异亮氨酸羟化酶酶活的定义：在25～40℃、pH 7～9的条件下，每min催化L-Ile反应生成1μM产物4-HIL所需的酶量为一个活力单位(U)。
L-异亮氨酸羟化酶比酶活的检测方法：取0.1mg纯酶加入含有30mM L-异亮氨酸、30mMα-酮戊二酸、1mM FeSO4·7H2O、5mM抗坏血酸和50mM pH7.0HEPES缓冲液的9mL反应体系中；于30℃下反应1h，沸水浴5～10min以终止反应；离心取上清液进行衍生化处理，HPLC 2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法测定4-HIL含量；
其中，L-异亮氨酸羟化酶比酶活的定义：每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位是U/mg。
4-羟基异亮氨酸转化率的检测方法：L-异亮氨酸转化率＝[L-异亮氨酸初始浓度(mM)－L-异亮氨酸剩余浓度(mM)]/L-异亮氨酸初始浓度(mM)×100％。
4-羟基异亮氨酸产率的检测方法：4-HIL产量(mM)/L-异亮氨酸初始浓度(mM)×100％。
4-羟基异亮氨酸产量的检测方法：将转化液进行适当浓度稀释后，采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法对4-HIL产量进行HPLC分析。
实施例1：来源于Bacillus cereus的可表达编码L-异亮氨酸羟化酶的基因的枯草芽孢杆菌工程菌的构建
具体步骤如下：
(1)从GENBANK获取来源于Bacillus cereus(GeneID:CP020804.1)的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)并通过人工合成得到此序列；将此序列以及表达质粒pMA5经限制性内切酶Nde I和Mlu I酶切后进行连接，得到重组质粒pMA5-ido-1；将重组质粒pMA5-ido-1转化至大肠杆菌E.coli JM109中，得到重组大肠杆菌E.coliJM109/pMA5-ido-1；
(2)从GENBANK获取来源于Bacillus cereus(GeneID:CP020804.1)的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)，对此核苷酸序列进行密码子优化后，得到经优化的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)；将经优化的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列以及表达质粒pMA5经限制性内切酶Nde I和Mlu I酶切后进行连接，得到重组质粒pMA5-ido-2；将重组质粒pMA5-ido-2转化至大肠杆菌E.coli JM109中，得到重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-2；
(3)将得到的重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-1以及重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-2涂布在含有浓度为50μg·mL-1的氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至10mL LB液体培养基中于温度37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌E.coliJM109/pMA5-ido-1以及重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-2。
(4)提取重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-1以及重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-2中的重组质粒pMA5-ido-1以及pMA5-ido-2；将重组质粒pMA5-ido-1以及pMA5-ido-2转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，得到重组菌BS168/pMA5-ido-1以及重组菌BS168/pMA5-ido-2；
(5)将得到的重组菌BS168/pMA5-ido-1以及重组菌BS168/pMA5-ido-2筛选阳性克隆并验证，即得到转化成功的重组菌BS168/pMA5-ido-1以及重组菌BS168/pMA5-ido-2涂布在含有浓度为50μg·mL-1的氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至10mL LB液体培养基中于温度37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌BS168/pMA5-ido-1以及重组菌BS168/pMA5-ido-2。
实施例2：其他来源的可表达编码L-异亮氨酸羟化酶的基因的枯草芽孢杆菌工程菌的构建
具体步骤如下：
(1)从GENBANK中获取来源于Bacillus thuringiensis strain TUST1L(GeneID:KC884243.1)的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.3所示)、来源于Bacillusmycoides strain Gnyt1的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO.4所示)以及来源于Bacillus bombysepticus str.Wang的L-异亮氨酸羟化酶的核苷酸序列(如SEQIDNO.5所示)并通过人工合成得到这些序列；将这些序列分别与表达质粒pMA5经限制性内切酶Nde I和Mlu I酶切后进行连接，得到重组质粒pMA5-ido-3、pMA5-ido-4以及pMA5-ido-5；将重组质粒pMA5-ido-3、pMA5-ido-4以及pMA5-ido-5分别转化至大肠杆菌E.coli JM109中，得到重组大肠杆菌E.coli JM109/pMA5-ido-3、E.coli JM109/pMA5-ido-4以及E.coliJM109/pMA5-ido-5；
(2)将得到的重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-3、E.coli JM109/pMA5-ido-4以及E.coliJM109/pMA5-ido-5涂布在含有浓度为50μg·mL-1的氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至10mL LB液体培养基中于温度37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-3、E.coli JM109/pMA5-ido-4以及E.coliJM109/pMA5-ido-5；
(3)提取重组菌E.coli JM109/pMA5-ido-3、E.coli JM109/pMA5-ido-4以及E.coliJM109/pMA5-ido-5中的重组质粒pMA5-ido-3、pMA5-ido-4以及pMA5-ido-5；将重组质粒pMA5-ido-3、pMA5-ido-4以及pMA5-ido-5转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，得到重组菌BS168/pMA5-ido-3、BS168/pMA5-ido-4以及BS168/pMA5-ido-5；
(4)将得到的重组菌BS168/pMA5-ido-3、BS168/pMA5-ido-4以及BS168/pMA5-ido-5筛选阳性克隆并验证，即得到转化成功的重组菌BS168/pMA5-ido-3、BS168/pMA5-ido-4以及BS168/pMA5-ido-5涂布在含有浓度为50μg·mL-1的氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至10mL LB液体培养基中于温度37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行单双酶切验证，得到转化成功的重组菌BS168/pMA5-ido-3、BS168/pMA5-ido-4以及BS168/pMA5-ido-5。
实施例3：不同来源的L-异亮氨酸羟化酶的表达
具体步骤如下：
(1)将质粒pMA5转化至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中表达，得到重组菌株BS168/pMA5作为空白对照；
(2)挑取实施例1获取的重组菌BS168/pMA5-ido-1、重组菌BS168/pMA5-ido-2以及实施例2得到的重组菌BS168/pMA5-ido-3、重组菌BS168/pMA5-ido-4以及重组菌BS168/pMA5-ido-5的单菌落分别接种至10mL LB液体培养基中，于温度37℃、120～180rpm的条件下培养8～12h，得到种子液；
(3)将种子液以1％的接种量接种至600mL LB液体培养基中，于温度25～37℃、120～180rpm的条件下培养12～24h，分别得到重组菌BS168/pMA5-ido-1、重组菌BS168/pMA5-ido-2、重组菌BS168/pMA5-ido-3、重组菌BS168/pMA5-ido-4以及重组菌BS168/pMA5-ido-5的培养液。
将培养液经细胞破碎仪破碎后于8000～10000rpm、4℃的条件下离心5～10min，分别得到培养重组菌BS168/pMA5-ido-1、重组菌BS168/pMA5-ido-2、重组菌BS168/pMA5-ido-3、重组菌BS168/pMA5-ido-4以及重组菌BS168/pMA5-ido-5获得的粗酶液，检测粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活。
检测结果如下：培养重组菌BS168/pMA5-ido-1获得的粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活为125U/mL、培养重组菌BS168/pMA5-ido-2获得的粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活为171.67U/mL、培养重组菌BS168/pMA5-ido-3获得的粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活为133.33U/mL、培养重组菌BS168/pMA5-ido-4获得的粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活为101.7U/mL、培养重组菌BS168/pMA5-ido-5获得的粗酶液中的L-异亮氨酸羟化酶酶活为96.7U/mL。
可见，来源于Bacillus cereus且经过密码子优化后的L-异亮氨酸羟化酶的酶活最高，高于其他来源及未经密码子优化过的L-异亮氨酸羟化酶，因此，应选择核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码L-异亮氨酸羟化酶的基因进行表达。
实施例4：不同来源的L-异亮氨酸羟化酶的酶学性质
具体步骤如下：
将实施例3得到的酶活相对较高的培养重组菌BS168/pMA5-ido-2和重组菌BS168/pMA5-ido-3获得的粗酶液分别经亲和层析柱进行纯化，得到纯酶IDO-2和IDO-3。
1、检测纯酶IDO-2和IDO-3的比酶活
检测结果为：IDO-2和IDO-3的比酶活分别为、、437.6U/mg和296.3U/mg，可见，来源于Bacillus cereus且经过密码子优化后的L-异亮氨酸羟化酶的比酶活是来源于Bacillusthuringiensis TUST1L的L-异亮氨酸羟化酶的1.48倍。
2、检测纯酶IDO-2和IDO-3的4-羟基异亮氨酸转化率
检测结果为：IDO-2和IDO-3的4-羟基异亮氨酸转化率分别为99.87％和75.6％，可见，来源于Bacillus cereus且经过密码子优化后的L-异亮氨酸羟化酶的转化率明显高于来源于Bacillus thuringiensis TUST1L的L-异亮氨酸羟化酶。
3、检测温度对纯酶IDO-2和IDO-3的影响
将1mL的反应体系加入含有30mM L-异亮氨酸、30mMα-KG、1mM FeSO4·7H2O、5mM抗坏血酸的pH为7.0的50mM HEPES缓冲液中，放在不同温度的水浴锅中，其温度范围为20～45℃，梯度间隔为5℃，然后分别加入50μL的IDO-2和IDO-3，反应30分钟后，沸水浴5min终止反应，离心取上清，HPLC测定上清液中的酶活。
检测结果为：IDO-2和IDO-3均在25℃的条件下酶活最高，可见，IDO-2和IDO-3的最适反应温度均为25℃。
4、检测pH对纯酶IDO-2和IDO-3的影响
参考3中的检测方法，采用1mL的反应体系，保持反应温度为25℃，将反应的HEPES缓冲液分别替换成不同pH的柠檬酸缓冲液(pH范围为3.0～5.5)、磷酸盐缓冲液(pH范围为5.5～8.0)和Tris-HCl缓冲液(pH范围为8.0～10.0)，梯度间隔为1，然后分别加入IDO-2和IDO-3反应30min，沸水浴5min终止反应，离心取上清，HPLC测定上清液中的酶活。
检测结果为：IDO-2在pH为5～8的范围内酶活均较高，基本无差别，而IDO-3仅在pH为7的条件下酶活较高，可见，IDO-2的pH适应范围较IDO-3的要宽。
实施例5：重组菌BS168/pMA5-ido-2的应用
具体步骤如下：
将实施例3获得的重组菌BS168/pMA5-ido-2的培养液于8000～10000rpm、4℃的条件下离心5～10min后收集菌体；用浓度为50mmol/L、pH为7.0的HEPES缓冲液重悬菌体至菌体在缓冲液中的细胞湿重为150g/L，得到反应体系；在反应体系中以1‰的添加量加入细胞壁通透剂曲拉通后，分别按照方案A和方案B的方法在反应体系中投加底物及辅因子，于温度为40℃、pH为9的条件下进行转化，得到反应液；
方案A：每3h分批投加底物及辅因子以使得反应体系中L-异亮氨酸的浓度保持在30mM、α-酮戊二酸的浓度保持在30mM、FeSO4·7H2O的浓度保持在1mM、抗坏血酸的浓度保持在5mM；
方案B：一次性在反应体系中投加200mM L-异亮氨酸、200mMα-酮戊二酸、1mMFeSO4·7H2O以及5mM抗坏血酸。
检测反应液中4-羟基异亮氨酸的转化率、产率以及产量，检测结果为：利用方案A的方法转化生产4-羟基异亮氨酸21h，可将反应体系中210mM的L-异亮氨酸转化为188.9mM的4-羟基异亮氨酸，4-羟基异亮氨酸转化率高达99.87％、产率高达89.95％、产量高达27.8g/L；利用方案B的方法转化21h后，可将反应体系中200mM的L-异亮氨酸转化为167.8mM的4-羟基异亮氨酸，底物剩余30.3mM，底物转化率为84.85％，产率为83.9％。
可见，利用此方法制备4-羟基异亮氨酸具有转化率、产率以及产量高的优势，极具大规模工业生产的前景，同时，枯草芽孢杆菌表达系统具有非致病性、细胞壁组成简单、重组表达的蛋白内毒素低、表达蛋白的可溶性高、生物活性较好等优势，而且，在枯草芽孢杆菌宿主中对L-异亮氨酸羟化酶进行表达时不用添加诱导剂，不用考虑因诱导过度形成大量包涵体而导致酶活低、转化率低和4-羟基异亮氨酸产量低等问题。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacctttg tgctgagcaa aatgaatggt tttagcattg aagaaaaagt gcatgaattt 60
gaaagtaagg gctttttaga gatcagcaac gagatctttt tacaagaaga agaaaaccat 120
cgtctgctga cccaagctca gctggactac tacaatctgg aagacgatgc ctatggcgaa 180
tgccgcgcac gcagctacag ccgctacatc aaatacgtgg acagcccgga ctacatttta 240
gataatagca atgattattt tcagagcaaa gaatacaatt atgatgatgg cggcaaggtg 300
cgccagttca acagcattaa tgatagcttt ctgtgcaacc cgctgatcca gaatatcgtg 360
cgcttcgaca ccgagtttgc ctttaaaaca aatattattg ataccagcaa agatttaatt 420
atcggtttac atcaagttcg ctataaagcc accaaagaac gcccgagctt cagcagccct 480
atctggctgc acaaagatga tgaaccggtg gtgtttttac atttaatgaa tttaagcaac 540
acagccattg gcggcgataa tttaatcgcc aacagtccgc gcgagatcaa tcagttcatc 600
tctttaaagg agccgctgga aactttagtt tttggccaga aagtgttcca cgccgtgacc 660
ccgctgggta ccgaatgcag caccgaagca tttcgtgaca ttttactggt gaccttcagc 720
tacaaagaaa ccaaataa 738
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacgtttg ttcttagtaa aatgaatggg tttagcatag aagaaaaggt acatgaattt 60
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ccacttggaa cagaatgtag tacggaggct tttcgtgata ttttattagt aacattttct 720
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<210> 3
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaatga gtggctttag catagaagaa aaggtacatg aatttgaatc taagggattc 60
cttgaaatct caaatgaaat ctttttacaa gaggaagaga atcatcgttt attaacacaa 120
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tgtagtactg aagcttttcg tgatatttta ttagtaacat tttcttataa ggagacaaaa 720
taa 723
<210> 4
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgctaacaa cagtttctaa taagacaagc agttttgacg tagaacaaaa ggtacatgaa 60
ttcgaatcaa atggatacat tcaaatctct aatgatattt ttttacaaga tcaagaagat 120
caagcattac taacgaaagc acagttagac tactacagct tacaaaacga cgcatatggc 180
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attagcttga aggatcccct agaaacttta gtatttggac aaaaggtatt ccacgctgta 660
acaccactag gaacagagtg taatacagaa gccttacgtg acattttatt agtaacgttt 720
tcttataagg agccaaaata a 741
<210> 5
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgacgtttg ttcttagtaa aatgagtggc tttagcatag aagaaaaggt acatgaattt 60
gaatctaaag gattccttga aatctcaaat gaaatctttt tacaagagga agagaatcat 120
cgtttattaa cacaagcaca gttagattat tataatttgg aagatgatgc atacggtgaa 180
tgccgtgcta gatcttattc aaggtatata aagtatgttg attcaccaga ttatatttta 240
gataatagta atgattactt ccaatctaaa gaatataact atgacgatgg cgggaaagtt 300
agacagttca atagcataaa tgatagcttt ttatgtaatc ctttaattca aaatatcgtg 360
cgcttcgata ctgaatttgc atttaaaaca aatataatag atacaagtaa agacttaatt 420
ataggtttac atcaagtaag atataaagct actaaagaaa gaccatcttt tagttcacct 480
atttggttac ataaagatga tgaaccagta gtgtttttac accttatgaa tttaagtaat 540
acagctattg gtggagataa tttaatagct aattctcctc gggaaattaa tcagtttata 600
agtttgaagg agcctttaga aactttagta tttggacaaa aggtcttcca tgccgtaacg 660
ccacttggaa cagaatgtag tacggaggct tttcgtgata ttttattagt aacattttct 720
tataaggaga caaaataa 738

Claims (10)

1.一段用于编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，含有pMA5载体、pHT01载体、pHT43载体、pBesT502载体、pET28a载体、pXMJ19载体、pET24b载体或pDXW-10载体与权利要求1所述基因。
4.携带权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组质粒的宿主细胞。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
6.一种生产L-异亮氨酸羟化酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4或5所述的宿主细胞在培养基中进行培养。
7.一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4或5所述的宿主细胞作为催化剂加入到含有底物L-异亮氨酸的反应体系中进行将L-异亮氨酸转化为4-羟基异亮氨酸的反应。
8.如权利要求7所述的一种利用全细胞转化生产4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法为用缓冲液重悬权利要求4或5所述的宿主细胞至宿主细胞在缓冲液中的细胞湿重为100～200g/L，再加入细胞壁通透剂，再加入L-异亮氨酸、α-酮戊二酸、FeSO4·7H2O以及抗坏血酸进行转化，得到4-羟基异亮氨酸。
9.权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组质粒或权利要求4或5所述宿主细胞或权利要求6所述方法在生产L-异亮氨酸羟化酶方面的应用。
10.权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组质粒或权利要求4或5所述宿主细胞或权利要求7或8所述方法在生产4-羟基异亮氨酸方面的应用。
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