CN108424859B

CN108424859B - 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用

Info

Publication number: CN108424859B
Application number: CN201711180707.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 任燕娜; 周祥山; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN108424859A

Abstract

本发明涉及生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。通过基因重组技术在酵母工程菌中引入了外源的HNM1、CKI和CCT基因，获得可生产胞磷胆碱的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可利用氯化胆碱或磷酸胆碱发酵生产胞磷胆碱等特征，为工业化生产胞磷胆碱提供了新思路。

Description

生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。

背景技术

胞苷二磷酸胆碱(Cytidine Diphosphate Choline，别名胞磷胆碱或CDPC)是卵磷脂生物合成的重要中间产物。卵磷脂是细胞膜的重要组成成分，它的代谢正常与否直接影响细胞的通透性、能量代谢以及蛋白质生物合成等许多生物学功能。胞磷胆碱是一种重要的核酸类药物，它是治疗脑病的首选药物。胞磷胆碱具有神经修复，神经保护，促进神经递质释放等作用，目前一直用于脑卒中、帕金森氏病、阿尔茨海默病和血管性痴呆等疾病的治疗。因此，胞磷胆碱是一种具有重要药用作用的化合物。

目前胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学方法主要见于早期工业路线，但是此法使用多种工业有毒有机试剂，转化率低，不适于大规模的生产。日本协和发酵株式会社开发了双菌发酵法，利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌发酵生产胞磷胆碱，但是发酵工艺较为复杂。目前工业上利用啤酒泥通过添加胞嘧啶核苷酸(CMP)和磷酸胆碱作为底物生产胞磷胆碱(酶转化法)，但是底物价格较为昂贵，且酿酒酵母的发酵密度较低，难以提高生产效率。

由于CDPC的广泛应用，其市场需求量正逐步扩大，有着极大的需求缺口。如何高效率、高质量、低成本的生产CDPC是急需解决的问题。因此，本领域还需要进一步地研究和开发胞磷胆碱的其它生产方法，以期简化生产工艺，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供利用氯化胆碱或磷酸胆碱作为底物发酵生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用。

在本发明的第一方面，提供一种生产胞磷胆碱的方法，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组基因的表达盒：

HNM1(hyper-resistance to nitrogen mustard)；

CCT(磷酸胆碱二胞苷酰转移酶)或CKI(胆碱激酶，choline kinase)之一或两者；

(2)培养(1)的酵母工程菌，添加氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP作为底物，从而生成胞磷胆碱产物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1和CKI基因的表达盒，以CMP和氯化胆碱为底物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1和CCT基因的表达盒，以CMP和磷酸胆碱为底物。

在另一优选例中，所述酵母工程菌中转化有HNM1，CCT和CKI基因的表达盒，以CMP和氯化胆碱为底物。

在一个优选例中，所述的CCT基因来源于毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的CKI和HNM1来源于酿酒酵母BY4742。

在另一优选例中，所述的CCT基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CKI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的HNM1基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的培养酵母工程菌所用的培养基包括(但不限于)：YPD、YPG、YPM培养基。

在另一优选例中，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或甲醇诱导型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括(但不限于)GAP启动子；较佳地，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)：AOX1启动。

在本发明的另一方面，提供一种利用氯化胆碱或磷酸胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CCT，CKI，HNM1。

在本发明的另一方面，提供一种利用氯化胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CKI，HNM1。

在本发明的另一方面，提供一种利用磷酸胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CCT，HNM1。

在一个优选例中，所述的酵母工程菌是毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产胞磷胆碱的重组表达载体(或表达构建物)，所述的重组表达载体中包含以下基因的表达盒：CCT，CKI，HNM1。

在本发明的另一方面，提供一种基因组合的用途，所述的基因组合包括下组基因：CCT，CKI，HNM1，该基因组合用于制备胞磷胆碱。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产胞磷胆碱的试剂盒，所述的试剂盒中包含所述的酵母工程菌。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、胞磷胆碱高效液相检测图。

A为胞磷胆碱标品的峰；

B为Gs115菌株在添加氯化胆碱和CMP为底物的条件下48h发酵液上清的液相图；

C为Gs115-CKI-HNM1菌株在添加氯化胆碱和CMP为底物的条件下48h发酵液上清的液相图。

图2、不同的工程菌株在不同底物的条件下的胞磷胆碱检测。Gs115、Gs115-CKI、Gs115-HNM1、Gs115-CKI-HNM1、Gs115-CKI-CCT-HNM1五个菌株分别在添加CMP为底物、同时添加CMP和氯化胆碱为底物的条件下，在发酵48h后检测发酵液中的胞磷胆碱的结果。

图3、不同的工程菌株在不同底物的条件下的胞磷胆碱检测。Gs115、Gs115-CCT、Gs115-HNM1、Gs115-CCT-HNM1四个菌株分别在添加CMP为底物、同时添加CMP和磷酸胆碱为底物的条件下，在发酵48h后检测发酵液中的胞磷胆碱的结果。

图4、不同的工程菌株在添加氯化胆碱和CMP为底物的条件下不同发酵时间的胞磷胆碱检测。Gs115、Gs115-CKI、Gs115-HNM1、Gs115-CKI-HNM1、Gs115-CKI-CCT、Gs115-CKI-CCT-HNM1六个菌株在添加氯化胆碱和CMP为底物的条件下不同发酵时间的胞磷胆碱浓度的检测结果。每组柱形图中，从左至右的柱依次为12、24、36、48、60、72、96、120、144小时(h)。

图5、利用酵母表达宿主合成生产胞磷胆碱过程的示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术在酵母工程菌株中引入了一系列外源基因，获得可利用氯化胆碱为底物发酵生产胞磷胆碱的酵母工程菌。本发明的方法获得的酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离且副产物少等特征，为工业化生产胞磷胆碱药物提供了新思路。

术语

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

基因及其表达系统

本发明中，通过在酵母工程菌中转化入两基因组合或三基因组合来实现利用氯化胆碱或磷酸胆碱在酵母工程菌中高效生产胞磷胆碱。所述的两基因组合包括如下基因：CKI，HNM1或CCT，HNM1；所述的三基因组合包括如下基因：CCT，CKI和HNM1。

在本发明中，上述的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。

上述的基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1～3所示的序列(依次对应CCT、CKI、HNM1)相同，也可以是它们的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与选自SEQ ID NO:1～3所示的序列有差别的核酸序列。

所述的基因可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及所述的基因的变异体，其编码的多肽与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与相应的野生型多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的各基因优选获自酿酒酵母和毕赤酵母，但是获自其它微生物的与酿酒酵母和毕赤酵母中相应的基因高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的各基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，各基因的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

各基因的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。

表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

作为本发明的优选方式，提供了一种表达载体(表达构建物，)其包括以下基因的表达盒：CCT；还提供了一种表达载体(表达构建物，)其包括以下基因的表达盒：CKI基因；并且还提供了一种表达载体(表达构建物，)其包括以下基因的表达盒：HNM1基因。

表达载体(表达构建物)的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需选择的基因之后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后其编码的多肽能够被有效地表达和发挥活性即可。作为本发明的优选方式，所述的表达载体是pPIC Z，pPIC 3.5K和pAG32。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞优选的是酵母工程菌，更优选的是毕赤酵母，如毕赤酵母GS115。毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母虽然都是常用的基因工程菌株，但是相对于酿酒酵母，毕赤酵母拥有高密度发酵，表达量高，调控严格的优点，巴斯德毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一，该表达系统兼有原核表达系统和真核表达系统的优点，易于操作培养、快速生长、表达量高，同时又能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后加工与修饰，并且含有高效的AOX1(Alcohol oxidase1，醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源蛋白的表达。因此使用毕赤酵母表达胞磷胆碱合成过程中的关键酶用于提高胞磷胆碱合成是可行的。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，培养中所用的培养基可以是本领域熟知的酵母培养基。在适于酵母细胞生长的条件下进行培养。

本发明通过基因重组技术获得的重组毕赤酵母菌株具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离且副产物少等特征，将在很大程度上解决传统生物、化学方法合成存在的问题，为工业化生产胞磷胆碱药物提供新思路。

合成胞磷胆碱的方法

胞磷胆碱的结构式如下式(I)所示：

本发明公开一种利用毕赤酵母合成生产胞磷胆碱的方法。所述方法包括：将两种基因(CKI，HNM1)转化酵母工程菌，从而利用氯化胆碱为底物生产胞磷胆碱；或者，将三种基因(CCT，CKI，HNM1)转化酵母工程菌，从而生产胞磷胆碱；或者将两种基因(CCT，HNM1)转化酵母工程菌，从而利用磷酸胆碱为底物生产胞磷胆碱。

CKI可以催化氯化胆碱合成磷酸胆碱，而HNM1可以促进氯化胆碱转运到毕赤酵母细胞内，CCT在镁离子的参与下可以进一步催化磷酸胆碱和CMP合成胞磷胆碱。在本发明之前，人们并没有发现在基因工程宿主里过表达HNM1可以促进氯化胆碱的转运进而促进胞磷胆碱的合成。因此，本发明人首次发现HNM1可以促进氯化胆碱转运到毕赤酵母细胞内。

具体的利用毕赤酵母合成生产胞磷胆碱的方法如图5所示，CMP经CMPK、CDPK的催化合成CTP；氯化胆碱经CKI的催化合成磷酸胆碱，氯化胆碱转运到毕赤酵母细胞内的能力有限，而HNM1可以促进氯化胆碱的转运；磷酸胆碱和CTP在CCT的催化下进一步合成胞磷胆碱。本发明人发现，尽管酵母内源的CCT可以催化磷酸胆碱和CTP合成胞磷胆碱，但是催化效率较低，过表达之后可以提高产物的合成。

重组酵母工程菌的发酵培养可以采用本领域已知的酵母发酵方法，一种较为优选的方法是：于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体1OD接种至含有氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP的YPD培养基，于30℃、转速200r/min培养48-96h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％的葡萄糖。

在获得了发酵产物后，从发酵产物中提取胞磷胆碱可以采用本发明已知的技术。可以采用高效液相色谱来对产物进行分析检测，以确定获得了所需的化合物及产物的量。

本发明运用重组毕赤酵母生产胞磷胆碱，不仅解决了生物发酵法中天然产生菌——酿酒酵母底物氯化胆碱难以转运到细胞内，酶法不稳定等问题，也避免了化学合成法中副产物多、纯化困难、环境污染大等不利因素，并且能够促进磷酸胆碱转运到细胞内，为工业生产胞磷胆碱开辟了新途径。因此，本发明的重组毕赤酵母菌株具备工业化生产胞磷胆碱的潜力。

本发明实现了利用重组酵母菌以氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP为底物进行全细胞生物合成胞磷胆碱的技术突破，为生产胞磷胆碱提供了新途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

质粒构建方法应用诺唯赞生物科技公司的无缝克隆试剂盒。

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pGAPZB、质粒pPIC3.5k、质粒pAG32、大肠杆菌Top10、毕赤酵母菌株GS115，均购自Invitrogen公司。

培养基

YPD液体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

YPD固体培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20g/L；

YPM液体培养基：甲醇10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L；

MGY培养基：10.0g/L甘油，0.67％YNB，琼脂20g/L。

配制以上培养基时，葡萄糖115℃高压灭菌20min，甲醇在使用时添加。其它成分121℃高压灭菌20min。

基因序列

CCT(SEQ ID NO:1)：

ATGGCTTCCAGAAAGTCTCCAAGAAAAAGGGTACGAGATCAAGAAGAAAGTGATAACTCTTCGGTCCAGACAATTAAGGTAGTTAGTGACGTACCTACTAAGCGGCCTAAACTTTCCCGTAAGACAAGCGACGAATTGGCGTTTGCGGAAAATGAACGAAAACTCGACGAACAACTTCCTGCTGATCTTCGAAAATTCAGGCCGACAGGCTTTAAGTTCAACTTGCCTCCAGAAGGACGCTCAATTCGTATTTATGCAGACGGAGTCTTCGACTTGTTTCATTTAGGTCACATGAAACAATTGGAACAATGTAAGAAAGCTTTCCCCAATGTTACCTTGGTTTGTGGAATTCCTAATGATAAAGAAACACACAAACGTAAGGGATTGACGGTCCTTACAGATAAGCAACGCTATGAGACTATTAAACATTGCCGTTGGGTGGATGAGGTGATTCCTGATGCTCCTTGGGTAGTTGATGTGGGTTTTCTTGAGAAACACAAAATTGACTATGTTGCACATGATGACCTTCCATACGCCTCGTCTGGTTCCGATGATATATACAGACCTATCAAGGAAATCGGAATGTTTTTAGTGACACAAAGGACAGAAGGTGTTTCTACCTCTGACATAATCACTAAAGTAATTAGGGATTACGACAAATACCTGATGCGAAACTTCGCACGGGGAGCAACTAGGAAAGAGTTAAACGTCAGTTGGTTGAAAAAAAATGAATTGGATTTGAAGAAACATATCAACGATTTTCGTAGCTATTTTAAGAAAGCTAACATCAATCTCAATGCTTCGTCCAAGGACCTATACTTTGAGGTTAGGGAATATCTAAGAGGAAACAACAACTCCAATGGGAACGAAAGTAGCCCCAACAAGTCTGATTCCGACTCTAATTCTGTGAATAGTAGCACTGCAAGCACTAGTGGCACAATGGATGATTTGATGAATATAGTACAATCTCGATCTCCCGCAACAGACTTTGCTGCAAAATATAACAGCAATGAAAATCTGAAGAGAAATCGATCATTCATCAACAATTTGAAAGACTACTGGAAAAGAAGATCCGAATCCGGTGAAGAGAACCAAAGTAACTGA

CKI(SEQ ID NO:2)：

ATGGTACAAGAATCACGTCCAGGGAGTGTAAGAAGTTACTCGGTCGGTTACCAAGCAAGGTCCAGATCGAGTTCTCAAAGAAGACATTCGTTAACACGCCAACGTTCCTCGCAAAGACTGATTAGAACCATCAGTATCGAGTCTGATGTGTCTAATATTACTGACGATGACGATTTGAGAGCTGTCAATGAGGGAGTAGCGGGTGTGCAACTGGACGTCTCTGAAACCGCAAATAAGGGACCAAGAAGAGCATCAGCAACTGATGTCACAGATAGTTTGGGTTCGACTTCGTCGGAATATATTGAGATTCCCTTTGTTAAGGAAACATTGGATGCAAGTTTACCTTCGGATTATCTGAAGCAGGACATATTAAATCTCATTCAGAGTTTGAAGATATCCAAATGGTATAACAACAAGAAAATCCAACCGGTAGCACAAGATATGAACTTAGTCAAGATCTCTGGTGCGATGACAAACGCAATTTTCAAAGTTGAATACCCTAAGTTACCATCGTTGCTATTGAGAATATACGGACCGAATATTGATAATATCATTGACAGGGAATATGAATTGCAGATTTTGGCTAGGCTTTCATTGAAAAATATAGGTCCTTCCCTTTACGGCTGTTTTGTAAACGGTAGATTTGAGCAGTTTCTGGAGAATTCTAAGACTTTAACAAAAGACGACATTAGAAACTGGAAGAACTCTCAAAGGATTGCAAGGAGAATGAAGGAGTTACATGTAGGTGTTCCTCTCTTGAGTTCAGAAAGGAAGAACGGGTCGGCTTGTTGGCAAAAGATTAACCAGTGGTTGCGCACGATTGAGAAAGTCGACCAATGGGTGGGGGATCCTAAAAACATTGAAAACTCTTTATTATGTGAGAATTGGTCCAAGTTTATGGATATTGTCGATAGATATCACAAGTGGCTTATTTCTCAAGAACAGGGTATAGAGCAAGTCAACAAAAATCTTATATTCTGCCATAATGATGCCCAATACGGCAATTTACTTTTCACTGCTCCTGTGATGAACACACCGAGCCTATACACTGCACCTTCGTCTACATCATTGACTTCCCAATCAAGTTCCTTATTTCCTTCGAGCTCCAATGTCATTGTAGATGATATAATCAACCCGCCAAAGCAGGAGCAAAGCCAAGATTCCAAATTGGTCGTCATTGATTTTGAATATGCAGGTGCCAATCCCGCCGCATATGATTTAGCGAATCATCTTTCCGAGTGGATGTATGATTACAACAATGCTAAGGCCCCACATCAGTGCCACGCTGATAGATATCCCGATAAAGAACAGGTTTTGAATTTCTTATACTCTTATGTTTCGCATCTAAGGGGTGGTGCTAAGGAACCCATAGATGAAGAGGTTCAAAGACTCTATAAGTCAATCATTCAATGGAGACCCACTGTACAACTATTTTGGTCGCTCTGGGCCATCCTACAAAGTGGTAAATTAGAGAAAAAAGAAGCCTCCACTGCCATCACTAGAGAAGAAATTGGACCCAATGGAAAAAAATATATCATCAAGACTGAACCCGAATCCCCTGAAGAAGACTTTGTTGAAAATGACGACGAGCCTGAAGCTGGCGTCAGCATTGACACGTTCGATTATATGGCTTATGGTCGTGACAAGATTGCGGTCTTTTGGGGCGACCTCATTGGCTTAGGCATAATCACCGAAGAAGAATGCAAAAATTTCAGCTCTTTCAAGTTCCTCGATACTAGTTATTTGTAA

HNM1(SEQ ID NO:3)：

ATGAGTATTCGGAATGATAATGCTTCCGGTGGCTATATGCAGCCGGATCAATCTTCGAACGCTTCTATGCACAAAAGAGACTTAAGAGTTGAGGAGGAAATAAAGCCATTGGATGATATGGATAGCAAGGGTGCTGTAGCAGCAGATGGTGAAGTTCATCTAAGAAAGTCATTTTCGTTGTGGTCAATTCTTGGTGTTGGATTCGGTTTGACTAATTCCTGGTTCGGTATTTCTACATCGATGGTTGCAGGTATATCTTCTGGTGGACCCATGATGATTGTTTACGGTATAATTATTGTTGCCCTGATTTCTATTTGCATTGGTACCTCGTTGGGTGAATTATCTTCCGCATATCCGCACGCCGGTGGTCAGTTTTGGTGGTCTTTGAAGCTTGCCCCTCCTAAGTACAAAAGATTTGCGGCCTACATGTGCGGTTCATTTGCTTACGCAGGATCCGTGTTCACAAGTGCTTCAACTACGTTATCCGTTGCTACCGAAGTGGTTGGTATGTACGCTCTGACGCACCCTGAATTCATCCCAAAGAGATGGCATATATTCGTTTGCTTTGAATTGTTGCATTTGTTCTTGATGTTTTTCAACTGTTACGGTAAATCCTTACCTATCATTTCATCTTCCTCTCTATACATTTCCCTACTATCCTTTTTCACAATTACAATTACTGTATTGGCATGTTCTCATGGAAAGTTCAACGATGCAAAGTTTGTTTTTGCCACATTTAATAATGAAACAGGTTGGAAGAACGGCGGTATCGCCTTTATTGTCGGTTTGATTAACCCAGCTTGGTCATTTTCGTGCCTTGACTGTGCAACCCATATGGCGTTTGAAGTTGAAAAACCAGAAAGAGTTATTCCCATTGCTATCATGGGAACAGTCGCCATTGGGTTTGTCACTTCCTTTTGTTATGTTATCGCTATGTTCTTCTCTATACAAGATCTGGACGCTGTCTTGTCTTCTACAACAGGCGCCCCAATCTTGGACATTTATAATCAGGCATTGGGTAATAAATCAGGTGCGATTTTCCTGGGTTGCTTGATTCTATTTACCTCTTTTGGTTGCGTCATTGCTTGTCACACTTGGCAGGCAAGGTTATGTTGGTCATTTGCCAGGGACAATGGTCTTCCATTATCCCGTTTATGGTCGCAAGTTAACCCACACACTGGTGTACCTTTGAACGCTCATTTAATGTCATGCGCTTGGATAACCCTCATTGGCCTACTTTATTTGGCTTCCAGTACGGCTTTTCAGTCCTTAATTACAGGTTGTATTGCATTTTTATTGTTATCCTACATCATTCCGGTTATATGTTTACTTGCTAAAAAGCGTAACATAGCTCATGGTCCATTCTGGCTTGGAAAATTTGGATTTTTTTCAAACATTGTTCTTTTGGGTTGGACTGTCTTTTCTGTGGTCTTTTTTTCCTTTCCACCAGTTTTACCTGTGACAAAGGATAACATGAACTATGTTTGTGTAGTTATTGTTGGTTATACTGCGTATTCGATTCTTTACTGGAAATACAAGGGTAAGAAGGAATTCCACGCTTTAGAAGAATCTGAGAACGAACAGGCTGAATATAGTAATAACTTCGATACCATTGAAGATAGTCGAGAATTTTCCGTTGCGGCCTCTGACGTTGAACTCGAAAATGAACACGTACCGTGGGGAAAGAAGTGA

实施例1、表达质粒的构建

1、CCT基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

分别以pAG32-CCT F(SEQ ID NO:4)和pGG R(SEQ ID NO:5)为引物从pGAPZB质粒(获自Invitrogen公司)上扩增GAP启动子。

以CCT F(SEQ ID NO:6)和CCT R(SEQ ID NO:7)为引物，通过PCR的方法，从毕赤酵母基因组上扩增CCT基因(即SEQ ID NO:1)。

以pGG F(SEQ ID NO:8)和pAG32-CCT R(SEQ ID NO:9)为引物从pGAPZB质粒上扩增AOX1TT终止子。

以SalI和BglII酶切pAG32质粒，通过无缝克隆试剂盒将四条片段(GAP启动子、CCT基因、AOX1TT终止子、载体片段)进行组装，得到的重组质粒为pAG32-GAP-CCT。

以pAG32-AOX1-CCT F(SEQ ID NO:10)和pAG32-AOX1-CCT R(SEQ ID NO:11)为引物，从质粒pPIC 3.5K上扩增AOXI启动子。

以SalI酶切pAG32-GAP-CCT质粒，通过无缝克隆试剂盒将两条片段进行组装，得到的重组质粒为pAG32-AOX1-GAP-CCT。

pAG32-CCT F(SEQ ID NO:4)：

TTCGTACGCTGCAGGTCGACAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTG

pGG R(SEQ ID NO:5)：

GGTGGATCCATAGTTGTTCAATTG

CCT F(SEQ ID NO:6)：

TGAACAACTATGGATCCACCATGGCTTCCAGAAAGTCTCCAAG

CCT R(SEQ ID NO:7)：

GTCATGTCTAAGGCTAAAACTCAGTTACTTTGGTTCTCTTCACCG

pGG F(SEQ ID NO:8)：

GTTTTAGCCTTAGACATGACTGTTC

pAG32-CCT R(SEQ ID NO:9)：

AAGGCAAGCTAAACAGATCTTCTCACTTAATCTTCTGTACTCTG

pAG32-AOX1-CCT F(SEQ ID NO:10)：

TTCGTACGCTGCAGGTCGACAGATCTAACATCCAAAGACGAAAG

pAG32-AOX1-CCT R(SEQ ID NO:11)：

TACAAAAAAGATCTGTCGACTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGA

2、CKI基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以pGAPZB-CKI F(SEQ ID NO:12)和pGAPZB-CKI R(SEQ ID NO:13)为引物，从酿酒酵母基因组上扩增CKI基因(即SEQ ID NO:2)，以EcoRI和XhoI酶切pGAPZB质粒，通过无缝克隆试剂盒将两条片段进行组装，得到的重组质粒为pGAPZB-CKI。

pGAPZB-CKI F(SEQ ID NO:12)：

TATTTCGAAACGAGGAATTCATGGTACAAGAATCACGT

pGAPZB-CKI R(SEQ ID NO:13)：

GGCGGCCGCCGCGGCTCGAGTTACAAATAACTAGTATCGAGG

3、HNM1基因整合入GAP启动子表达质粒的构建

以3.5K-GAP F(SEQ ID NO:14)和pGG R(SEQ ID NO:5)为引物从pGAPZB质粒上扩增GAP启动子。

以pPIC 3.5K-HNM1F(SEQ ID NO:15)和pPIC 3.5K-HNM1R(SEQ ID NO:16)为引物，以pPIC 3.5K质粒为模板扩增载体片段。

以GAP-HNM1F(SEQ ID NO:17)和GAP-HNM1R(SEQ ID NO:18)为引物从酿酒酵母基因组上扩增HNM1基因(即SEQ ID NO:3)。

通过无缝克隆试剂盒将三条片段(GAP启动子、载体片段、HNM1基因)进行组装，得到的重组质粒为pPIC 3.5K-GAP-HNM1。

3.5K-GAP F(SEQ ID NO:14)：

AAAATAACAGTTATTATTCGAGATCTTTTTTGTAGAAATGTCT

pPIC 3.5K-HNM1F(SEQ ID NO:15)：

GAATTCCCTAGGGCGGCCGC

pPIC 3.5K-HNM1R(SEQ ID NO:16)：

CGAATAATAACTGTTATTTTTCAGT

GAP-HNM1F(SEQ ID NO:17)：

TGAACAACTATGGATCCACCATGAGTATTCGGAATGATAATGC

GAP-HNM1R(SEQ ID NO:18)：

GCGGCCGCCCTAGGGAATTCTCACTTCTTTCCCCACGGTA

实施例2、电转毕赤酵母及菌株的筛选

电转毕赤酵母以及菌株筛选的方法如下：

1、将pAG32-GAP-CCT酶切线性化后电转入毕赤酵母野生型感受态，复苏后涂布加入潮霉素的YPD固体平板，筛选得到Gs115-CCT菌株。

2、将pGAPZB-CKI酶切线性化后电转入毕赤酵母野生型感受态，复苏后涂布加入博来霉素的YPD固体平板，筛选得到Gs115-CKI菌株。

3、将pPIC 3.5K-GAP-HNM1酶切线性化后电转入毕赤酵母野生型感受态和Gs115-CKI菌株感受态，复苏后涂布加入MGY固体平板，分别筛选得到Gs115-HNM1菌株和Gs115-CKI-HNM1菌株。

4、将pAG32-AOX1-GAP-CCT酶切线性化后分别电转入Gs115-CKI菌株感受态、Gs115-CKI-HNM1菌株感受态及Gs115-HNM1菌株感受态，复苏后涂布加入潮霉素的YPD固体平板，筛选得到Gs115-CKI-CCT菌株、Gs115-CKI-CCT-HNM1菌株及Gs115-CCT-HNM1菌株。

实施例3、重组工程菌摇瓶发酵工艺及产物定量分析

于30℃、转速200r/min的液体YPD培养中，将重组菌培养至对数期，收集菌体重悬后1OD/mL接种至装有100mL YPD液体培养基(添加氯化胆碱12g/L或磷酸胆碱5g/L、CMP10g/L、硫酸镁6g/L并调节pH至6.5)的250mL锥形瓶中(OD值为酵母菌浓单位，1OD约为5x10⁷个酵母细胞。OD值由紫外分光光度计于600nm波长测得)，于30℃、转速200r/min培养48-96h。发酵过程中每24h向液体培养基中添加2％(m/v)的葡萄糖。

实施例4、重组菌株发酵产物的鉴定

将Gs115菌株和Gs115-CKI-HNM1菌株按照实施例3进行发酵培养后的发酵液，取1mL发酵液12000rpm离心5min，取上清并用0.22μm的滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC)分析。

高效液相色谱法分析，由反向高效液相色谱Agilent 1100完成，色谱柱使用C18柱；柱温：25℃；流动相：磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节至pH 4.5)等量混合]-甲醇(95：5)；流速：1.0mL/min；检测波长：276nm；进样量：10μL。

结果如图1，由该图可知，Gs115-CKI-HNM1菌株中检测到了胞磷胆碱的峰。

实施例5、工程菌株以氯化胆碱为底物发酵生产的产物产量

将Gs115、Gs115-CKI、Gs115-HNM1、Gs115-CKI-HNM1、Gs115-CKI-CCT-HNM1五个工程菌株根据实施例3的方法进行发酵。结果如图2。

由图2可知，Gs115-CKI菌株相对于Gs115菌株在添氯化胆碱做底物时产量明显增加，可知在Gs115菌株中过表达CKI可以促进氯化胆碱向产物的转化。而Gs115-CKI-HNM1菌株相对于Gs115-CKI菌株在添加氯化胆碱为底物时产量提升了3倍，也证明了在Gs115-CKI菌株中过表达HNM1促进了氯化胆碱向细胞内的转运。

由图2还可见，Gs115-CKI-CCT-HNM1有很高的胞磷胆碱产量，且可以在不含氯化胆碱的情况下产生一定量的胞磷胆碱。

实施例6、工程菌株以磷酸胆碱为底物发酵生产的产物产量

Gs115、Gs115-CCT、Gs115-HNM1、Gs115-CCT-HNM1四个菌株根据实施例3的方法进行发酵。

由图3可知，Gs115-CCT-HNM1菌株相对于Gs115、Gs115-CCT、Gs115-HNM1菌株在添加磷酸胆碱为底物时产量明显增加，可知在Gs115菌株中过表达CCT和HNM1可以促进磷酸胆碱向胞磷胆碱的转化，而过表达HNM1可以促进磷酸胆碱向细胞内的转运。

实施例7、工程菌株发酵生产培养时间的优化

Gs115、Gs115-CKI、Gs115-HNM1、Gs115-CKI-HNM1、Gs115-CKI-CCT、Gs115-CKI-CCT-HNM1六个菌株根据实施例3的方法进行发酵。

结果如图4。由该图可知，在添加氯化胆碱和CMP为底物时，随着发酵时间的增加，胞磷胆碱的产量不断积累，最优时间为96h。96h后，产量在相对较长的一段时间内基本维持不变。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用

<130> 178687

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> 毕赤酵母(Pichia pastoris)

<400> 1

atggcttcca gaaagtctcc aagaaaaagg gtacgagatc aagaagaaag tgataactct 60

tcggtccaga caattaaggt agttagtgac gtacctacta agcggcctaa actttcccgt 120

aagacaagcg acgaattggc gtttgcggaa aatgaacgaa aactcgacga acaacttcct 180

gctgatcttc gaaaattcag gccgacaggc tttaagttca acttgcctcc agaaggacgc 240

tcaattcgta tttatgcaga cggagtcttc gacttgtttc atttaggtca catgaaacaa 300

ttggaacaat gtaagaaagc tttccccaat gttaccttgg tttgtggaat tcctaatgat 360

aaagaaacac acaaacgtaa gggattgacg gtccttacag ataagcaacg ctatgagact 420

attaaacatt gccgttgggt ggatgaggtg attcctgatg ctccttgggt agttgatgtg 480

ggttttcttg agaaacacaa aattgactat gttgcacatg atgaccttcc atacgcctcg 540

tctggttccg atgatatata cagacctatc aaggaaatcg gaatgttttt agtgacacaa 600

aggacagaag gtgtttctac ctctgacata atcactaaag taattaggga ttacgacaaa 660

tacctgatgc gaaacttcgc acggggagca actaggaaag agttaaacgt cagttggttg 720

aaaaaaaatg aattggattt gaagaaacat atcaacgatt ttcgtagcta ttttaagaaa 780

gctaacatca atctcaatgc ttcgtccaag gacctatact ttgaggttag ggaatatcta 840

agaggaaaca acaactccaa tgggaacgaa agtagcccca acaagtctga ttccgactct 900

aattctgtga atagtagcac tgcaagcact agtggcacaa tggatgattt gatgaatata 960

gtacaatctc gatctcccgc aacagacttt gctgcaaaat ataacagcaa tgaaaatctg 1020

aagagaaatc gatcattcat caacaatttg aaagactact ggaaaagaag atccgaatcc 1080

ggtgaagaga accaaagtaa ctga 1104

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

atggtacaag aatcacgtcc agggagtgta agaagttact cggtcggtta ccaagcaagg 60

tccagatcga gttctcaaag aagacattcg ttaacacgcc aacgttcctc gcaaagactg 120

attagaacca tcagtatcga gtctgatgtg tctaatatta ctgacgatga cgatttgaga 180

gctgtcaatg agggagtagc gggtgtgcaa ctggacgtct ctgaaaccgc aaataaggga 240

ccaagaagag catcagcaac tgatgtcaca gatagtttgg gttcgacttc gtcggaatat 300

attgagattc cctttgttaa ggaaacattg gatgcaagtt taccttcgga ttatctgaag 360

caggacatat taaatctcat tcagagtttg aagatatcca aatggtataa caacaagaaa 420

atccaaccgg tagcacaaga tatgaactta gtcaagatct ctggtgcgat gacaaacgca 480

attttcaaag ttgaataccc taagttacca tcgttgctat tgagaatata cggaccgaat 540

attgataata tcattgacag ggaatatgaa ttgcagattt tggctaggct ttcattgaaa 600

aatataggtc cttcccttta cggctgtttt gtaaacggta gatttgagca gtttctggag 660

aattctaaga ctttaacaaa agacgacatt agaaactgga agaactctca aaggattgca 720

aggagaatga aggagttaca tgtaggtgtt cctctcttga gttcagaaag gaagaacggg 780

tcggcttgtt ggcaaaagat taaccagtgg ttgcgcacga ttgagaaagt cgaccaatgg 840

gtgggggatc ctaaaaacat tgaaaactct ttattatgtg agaattggtc caagtttatg 900

gatattgtcg atagatatca caagtggctt atttctcaag aacagggtat agagcaagtc 960

aacaaaaatc ttatattctg ccataatgat gcccaatacg gcaatttact tttcactgct 1020

cctgtgatga acacaccgag cctatacact gcaccttcgt ctacatcatt gacttcccaa 1080

tcaagttcct tatttccttc gagctccaat gtcattgtag atgatataat caacccgcca 1140

aagcaggagc aaagccaaga ttccaaattg gtcgtcattg attttgaata tgcaggtgcc 1200

aatcccgccg catatgattt agcgaatcat ctttccgagt ggatgtatga ttacaacaat 1260

gctaaggccc cacatcagtg ccacgctgat agatatcccg ataaagaaca ggttttgaat 1320

ttcttatact cttatgtttc gcatctaagg ggtggtgcta aggaacccat agatgaagag 1380

gttcaaagac tctataagtc aatcattcaa tggagaccca ctgtacaact attttggtcg 1440

ctctgggcca tcctacaaag tggtaaatta gagaaaaaag aagcctccac tgccatcact 1500

agagaagaaa ttggacccaa tggaaaaaaa tatatcatca agactgaacc cgaatcccct 1560

gaagaagact ttgttgaaaa tgacgacgag cctgaagctg gcgtcagcat tgacacgttc 1620

gattatatgg cttatggtcg tgacaagatt gcggtctttt ggggcgacct cattggctta 1680

ggcataatca ccgaagaaga atgcaaaaat ttcagctctt tcaagttcct cgatactagt 1740

tatttgtaa 1749

<210> 3

<211> 1692

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

atgagtattc ggaatgataa tgcttccggt ggctatatgc agccggatca atcttcgaac 60

gcttctatgc acaaaagaga cttaagagtt gaggaggaaa taaagccatt ggatgatatg 120

gatagcaagg gtgctgtagc agcagatggt gaagttcatc taagaaagtc attttcgttg 180

tggtcaattc ttggtgttgg attcggtttg actaattcct ggttcggtat ttctacatcg 240

atggttgcag gtatatcttc tggtggaccc atgatgattg tttacggtat aattattgtt 300

gccctgattt ctatttgcat tggtacctcg ttgggtgaat tatcttccgc atatccgcac 360

gccggtggtc agttttggtg gtctttgaag cttgcccctc ctaagtacaa aagatttgcg 420

gcctacatgt gcggttcatt tgcttacgca ggatccgtgt tcacaagtgc ttcaactacg 480

ttatccgttg ctaccgaagt ggttggtatg tacgctctga cgcaccctga attcatccca 540

aagagatggc atatattcgt ttgctttgaa ttgttgcatt tgttcttgat gtttttcaac 600

tgttacggta aatccttacc tatcatttca tcttcctctc tatacatttc cctactatcc 660

tttttcacaa ttacaattac tgtattggca tgttctcatg gaaagttcaa cgatgcaaag 720

tttgtttttg ccacatttaa taatgaaaca ggttggaaga acggcggtat cgcctttatt 780

gtcggtttga ttaacccagc ttggtcattt tcgtgccttg actgtgcaac ccatatggcg 840

tttgaagttg aaaaaccaga aagagttatt cccattgcta tcatgggaac agtcgccatt 900

gggtttgtca cttccttttg ttatgttatc gctatgttct tctctataca agatctggac 960

gctgtcttgt cttctacaac aggcgcccca atcttggaca tttataatca ggcattgggt 1020

aataaatcag gtgcgatttt cctgggttgc ttgattctat ttacctcttt tggttgcgtc 1080

attgcttgtc acacttggca ggcaaggtta tgttggtcat ttgccaggga caatggtctt 1140

ccattatccc gtttatggtc gcaagttaac ccacacactg gtgtaccttt gaacgctcat 1200

ttaatgtcat gcgcttggat aaccctcatt ggcctacttt atttggcttc cagtacggct 1260

tttcagtcct taattacagg ttgtattgca tttttattgt tatcctacat cattccggtt 1320

atatgtttac ttgctaaaaa gcgtaacata gctcatggtc cattctggct tggaaaattt 1380

ggattttttt caaacattgt tcttttgggt tggactgtct tttctgtggt ctttttttcc 1440

tttccaccag ttttacctgt gacaaaggat aacatgaact atgtttgtgt agttattgtt 1500

ggttatactg cgtattcgat tctttactgg aaatacaagg gtaagaagga attccacgct 1560

ttagaagaat ctgagaacga acaggctgaa tatagtaata acttcgatac cattgaagat 1620

agtcgagaat tttccgttgc ggcctctgac gttgaactcg aaaatgaaca cgtaccgtgg 1680

ggaaagaagt ga 1692

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

ttcgtacgct gcaggtcgac agatcttttt tgtagaaatg tcttg 45

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ggtggatcca tagttgttca attg 24

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

tgaacaacta tggatccacc atggcttcca gaaagtctcc aag 43

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gtcatgtcta aggctaaaac tcagttactt tggttctctt caccg 45

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

gttttagcct tagacatgac tgttc 25

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

aaggcaagct aaacagatct tctcacttaa tcttctgtac tctg 44

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

ttcgtacgct gcaggtcgac agatctaaca tccaaagacg aaag 44

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

tacaaaaaag atctgtcgac ttcgaataat tagttgtttt ttga 44

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tatttcgaaa cgaggaattc atggtacaag aatcacgt 38

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ggcggccgcc gcggctcgag ttacaaataa ctagtatcga gg 42

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

aaaataacag ttattattcg agatcttttt tgtagaaatg tct 43

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

gaattcccta gggcggccgc 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

cgaataataa ctgttatttt tcagt 25

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

tgaacaacta tggatccacc atgagtattc ggaatgataa tgc 43

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gcggccgccc tagggaattc tcacttcttt ccccacggta 40

Claims

1.一种生产胞磷胆碱的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有下组基因的表达盒：

HNM1；以及

CCT，CKI之一或两者；

(2) 培养(1)的酵母工程菌，添加氯化胆碱或磷酸胆碱和CMP作为底物，从而生成胞磷胆碱产物；其中，转化HNM1及CCT基因的表达盒的酵母工程菌以CMP和磷酸胆碱为底物生产胞磷胆碱；转化CKI及HNM1基因的表达盒的酵母工程菌以CMP和氯化胆碱为底物生产胞磷胆碱；转化CCT，CKI及HNM1基因的表达盒的酵母工程菌以CMP和氯化胆碱为底物生产胞磷胆碱；

所述CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示或其简并序列，所述CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养酵母工程菌所用的培养基包括：YPD培养基、YPG培养基或YPM培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或甲醇诱导型启动子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的组成型启动子包括：GAP启动子。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的甲醇诱导型启动子包括：AOX1启动子。

6.一种利用氯化胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CCT，CKI和HNM1；所述CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示或其简并序列，所述CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

7.一种利用氯化胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CKI和HNM1；所述CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

8.一种利用磷酸胆碱生产胞磷胆碱的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含下组基因的表达盒：CCT和HNM1；所述CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

9.如权利要求6、7或8所述的酵母工程菌，其特征在于，所述的酵母工程菌是毕赤酵母。

10.一种用于生产胞磷胆碱的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中包含以下基因的表达盒：CCT，CKI和HNM1；所述CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示或其简并序列，所述CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

11.一种基因组合的用途，所述的基因组合包括下组基因：CCT，CKI和HNM1，该基因组合用于制备胞磷胆碱；所述CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示或其简并序列，所述CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示或其简并序列，所述HNM1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示或其简并序列。

12.一种用于生产胞磷胆碱的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含权利要求6、7和/或8所述的酵母工程菌。