CN109852644B

CN109852644B - 一种制备布瓦西坦中间体的方法

Info

Publication number: CN109852644B
Application number: CN201811347071.3A
Authority: CN
Inventors: 孙传民
Original assignee: Ecolab Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109852644A

Abstract

本发明提供了一种制备布瓦西坦中间体的方法，具体地，本发明公开了部分醇脱氢酶可以用于布瓦西坦中间体的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体的制备方法。

Description

一种制备布瓦西坦中间体的方法

技术领域

本申请属于生物酶催化领域，具体涉及一种酶催化制备布瓦西坦中间体中的方法。

背景技术

布瓦西坦Brivaracetam是比利时UCB公司开发的一种新型抗癫痫药，其中(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮是其重要的中间体。

(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮有多种制备方法，如WO2016191435以(R)-环氧氯丙烷为原料，经三步反应制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮再进一步制得布瓦西坦。

CN106588741A以(R)-3-甲氧基羰基己酸为原料，经环化制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮再经开环，取代，环化可制得布瓦西坦。

但以上都是化学方法，且都采用手性原料，成本较高。另外因为酶催化的专一性，高催化效率，酶催化制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮也得到了青睐，Org.ProcessRes.Dev,2016,20,1566-1575报道了利用脂肪酶和蛋白酶制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，但是其转化率为50％，ee值为96％。

综上，我们需要寻找一种转化率更高，ee值更高的更好的方法来催化制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种醇脱氢酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用，其中，所述醇脱氢酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述催化活性指所述醇脱氢酶可催化作为底物的化合物2反应得到化合物1，其反应式如下：

本发明的第二方面，提供了一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括作为底物的化合物2、和醇脱氢酶；以化合物2为底物，在醇脱氢酶作用下，得到化合物1，化合物1即为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；

其反应式如下：

在另一优选例中，所述醇脱氢酶选自下组：

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括辅酶；优选地，化合物2和辅酶的质量比为1000～10000:1；更优选地，所述辅酶为NADH或NADPH。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括葡萄糖、和葡萄糖脱氢酶；优选地，所述化合物2和葡萄糖的摩尔比为1:1-1:5；更优选地，所述化合物2和葡萄糖的摩尔比为1:1-1:3。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为8.0-10.0，优选为8.5-9.5。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为30-40℃。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(2)，纯化所述化合物1。

本发明的第三方面，提供了一种制备布瓦西坦的方法，其包括下述步骤：

(1)按照本发明第二方面所述的方法，制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；

(2)将步骤(1)制得的(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮作为中间体进行反应，得到布瓦西坦。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现部分醇脱氢酶可以用于布瓦西坦中间体的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的布瓦西坦中间体的制备方法。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

醇脱氢酶

本发明提供了醇脱氢酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用。本发明的醇脱氢酶应当具有催化作为底物的化合物2反应得到化合物1的活性，其反应式如下：

在本发明的一个优选地实施方式中，在辅酶NADH或NADPH、醇脱氢酶存在下，将5-羟基-4-丙基二氢呋喃-2(3H)-酮进行还原催化，制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述醇脱氢酶选自下组：

SEQ ID NO.:1：

1 mravrlveig kplslqeigv pkpkgpqvli kveaagvchs dvhmrqgrfg nlrivedlgv

61 klpvtlghei agkieevgde vvgyskgdlv avnpwqgegn cyycrigeeh lcdsprwlgi

121 nfdgayaeyv ivphykymyk lrrlnaveaa pltcsgitty ravrkasldp tktllvvgag

181 gglgtmavqi akavsgatii gvdvreeave aakragadyv inasmqdpla eirriteskg

241 vdavidlnns ektlsvypka lakqgkyvmv glfgadlhyh aplitlseiq fvgslvgnqs

301 dflgimrlae agkvkpmitk tmkleeanea idnlenfkai grqvlip

SEQ ID NO.:2：

1 msipttqkav ifyenggple ykdipvptpk pneiliniky sgvchtdlha wkgdwplatk

61l plvgghega gvvvakgsnv tnfeigdyag ikklngscms ceycqqgaep ncpdadlsgy

121 thdgsfqqya tadavqaaki pkdcdlatia pilcagvtvy kalktadlrp gqwvcisgag

181 gglgslaiqy atamglrvia idggdekatf ckslgaetfv dftktkdmvk aiqeatnggp

241 hgvinvsvsd aaisqsveyv rplgkvvlvg lpahsvvksp vfehvvksie irgsyvgnrl

301 dtaeaidffs rglvkatiki iglselpkvy elmeqgaiig ryvvdttk

SEQ ID NO.:3：

1 mgeiesycnk elgplptkap tlsknvldlf slkgkvasvt gssggigwav aeayaqagad

61 vaiwynshpa dekaehlqkt ygvhskaykc nisdpksvee tisqqekdfg tidvfvanag

121 vtwtqgpeid vdnydswnki isvdlngvyy cshnigkifk kngkgsliit ssisgkivni

181 pqlqapynta kaacthlaks laiewapfar vntispgyid tditdfaskd mkakwwqltp

241 lgregltqel vggylylasn astfttgsdv vidggytcp

葡萄糖脱氢酶

本发明根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，全合成葡萄糖脱氢酶基因，并进行了重组表达，从而制备了葡萄糖脱氢酶。

在本发明的一个优选地实施方式中，在反应体系中添加葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，从而实现NADH和/或NADPH的再生，为生物催化还原反应提供还原力氢。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的醇脱氢酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的醇脱氢酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得醇脱氢酶。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明醇脱氢酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28a。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，醇脱氢酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的蛋白醇脱氢酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TMHeparinHPColumns。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供了醇脱氢酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用，并经过大量实验、筛选获得了具有较高转化率和ee值的较佳醇脱氢酶；

(2)提供了一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，该方法使用醇脱氢酶进行催化，反应条件温和。

(3)本发明筛选到了具有较高活性的醇脱氢酶用于制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，实验结果表明获得的目标产物ee值可达99％，转化率可达90％。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1化合物3的合成

30g(1.09eq)吗啉溶于90mL正庚烷中，降温至5℃，滴加50％的乙醛酸水溶液(46g，1.0eq)控制温度不要超过40℃，滴完后控温25-30℃反应2h。慢慢滴加29g正戊醛，控制温度不高于40℃，滴完后控温40℃反应16h。降温至20℃，加入浓盐酸50mL，正庚烷萃取，氢氧化钠水溶液调pH 1.0，甲叔醚萃取三次后合并有机相减压浓缩得化合物3(43g，收率96％)。(参考专利WO2005028435A1)

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ6.00(s,1H),5.84(t,J＝1.8Hz,1H),4.65(bs,1H,exchange with D₂O),2.25–2.52(m,2H),1.52–1.77(m,2H),1.00(t,J＝7.6Hz,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.3,170.3,117.2,99.4,29.6,19.9,13.7.Anal.calcd.for C₇H₁₀O₃:C,59.14；H,7.09.Found:C,58.98；H,7.13.

实施例2化合物2的合成

化合物3(14.2g)溶于70mL乙醇中，加入0.7g钯碳(10％Pd)置换氮气后，通入氢气(1大气压)，室温反应6h，GC检测反应完全。过滤除去钯碳，减压浓缩除去乙醇，得化合物2(14g，收率100％)。

实施例3醇脱氢酶的制备

3.1酶基因的获取

从NCBI检索到下表中醇脱氢酶(ADH)，根据酶基因序列，全合成酶基因。

表1酶

3.2酶基因的表达

将酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞；菌种接种LB培养基于37℃下，200rpm摇床，待OD600至0.8左右时，取菌液加入终浓度为25％的无菌甘油，编号后，置于-80℃低温冰箱保藏备用。

3.3酶菌株的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用；

将含有酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，降温至30℃，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，诱导培养16h，培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。

3.4粗酶液的制备以及酶活的测定

将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mL pH8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到粗酶液。

酶活测定方法：

酶活定义：30℃，pH7.0条件下，1mL反应体系中，每分钟消耗1μmol NAD(P)H所需的酶量。

1mL反应体系，先加980μL pH7.0 50mM磷酸盐缓冲液(含50mM底物化合物2)，再加10μL NAD(P)H，最后加10μL待测酶液，检测分析波长340nm处的酶反应动力学，计算酶活。

实施例4葡萄糖脱氢酶的制备

根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，全合成葡萄糖脱氢酶基因。

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

葡萄糖脱氢酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌株。将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

以上收集的菌体，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组葡萄糖脱氢酶粗酶液。

酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加980μL的pH 7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含葡萄糖400mM)，再加10μL NADP⁺(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。

单位酶活定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟产生1μmol NADPH所需要的酶量。

以下实施例中所用到的葡萄糖脱氢酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。

实施例5化合物1的合成

称量10g化合物2溶于80mL水中，加10mg NAD+，37g葡萄糖，调pH 9.0，最后加15mLADH酶液(酶1，酶2或酶3)，加5mL葡萄糖脱氢酶酶液，控温35℃，控pH 9.0，反应3h，GC检测反应完全。调pH至7.0，EA萃取三次，减压浓缩除去溶剂，得化合物1。

反应原理是化合物2先水解为偕二醇，偕二醇不稳定转变为醛(醛可以消旋化)，醛经醇脱氢酶催化得到手性醇(R)-3-(羟甲基)己酸，手性醇(R)-3-(羟甲基)己酸再酯化为内脂化合物1。

酶编号	转化率	ee值
			1	85％	98％
2	82％	95％
			3	90％	99％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 一种制备布瓦西坦中间体的方法

<130> 000006

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 1

Met Arg Ala Val Arg Leu Val Glu Ile Gly Lys Pro Leu Ser Leu Gln

1 5 10 15

Glu Ile Gly Val Pro Lys Pro Lys Gly Pro Gln Val Leu Ile Lys Val

20 25 30

Glu Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Val His Met Arg Gln Gly Arg

35 40 45

Phe Gly Asn Leu Arg Ile Val Glu Asp Leu Gly Val Lys Leu Pro Val

50 55 60

Thr Leu Gly His Glu Ile Ala Gly Lys Ile Glu Glu Val Gly Asp Glu

65 70 75 80

Val Val Gly Tyr Ser Lys Gly Asp Leu Val Ala Val Asn Pro Trp Gln

85 90 95

Gly Glu Gly Asn Cys Tyr Tyr Cys Arg Ile Gly Glu Glu His Leu Cys

100 105 110

Asp Ser Pro Arg Trp Leu Gly Ile Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Ala Glu

115 120 125

Tyr Val Ile Val Pro His Tyr Lys Tyr Met Tyr Lys Leu Arg Arg Leu

130 135 140

Asn Ala Val Glu Ala Ala Pro Leu Thr Cys Ser Gly Ile Thr Thr Tyr

145 150 155 160

Arg Ala Val Arg Lys Ala Ser Leu Asp Pro Thr Lys Thr Leu Leu Val

165 170 175

Val Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Met Ala Val Gln Ile Ala Lys

180 185 190

Ala Val Ser Gly Ala Thr Ile Ile Gly Val Asp Val Arg Glu Glu Ala

195 200 205

Val Glu Ala Ala Lys Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Val Ile Asn Ala Ser

210 215 220

Met Gln Asp Pro Leu Ala Glu Ile Arg Arg Ile Thr Glu Ser Lys Gly

225 230 235 240

Val Asp Ala Val Ile Asp Leu Asn Asn Ser Glu Lys Thr Leu Ser Val

245 250 255

Tyr Pro Lys Ala Leu Ala Lys Gln Gly Lys Tyr Val Met Val Gly Leu

260 265 270

Phe Gly Ala Asp Leu His Tyr His Ala Pro Leu Ile Thr Leu Ser Glu

275 280 285

Ile Gln Phe Val Gly Ser Leu Val Gly Asn Gln Ser Asp Phe Leu Gly

290 295 300

Ile Met Arg Leu Ala Glu Ala Gly Lys Val Lys Pro Met Ile Thr Lys

305 310 315 320

Thr Met Lys Leu Glu Glu Ala Asn Glu Ala Ile Asp Asn Leu Glu Asn

325 330 335

Phe Lys Ala Ile Gly Arg Gln Val Leu Ile Pro

340 345

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 2

Met Ser Ile Pro Thr Thr Gln Lys Ala Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly

1 5 10 15

Gly Pro Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Thr Pro Lys Pro Asn

20 25 30

Glu Ile Leu Ile Asn Ile Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu

35 40 45

His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Ala Thr Lys Leu Pro Leu Val

50 55 60

Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Lys Gly Ser Asn Val

65 70 75 80

Thr Asn Phe Glu Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Lys Leu Asn Gly

85 90 95

Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Glu Pro Asn Cys

100 105 110

Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln

115 120 125

Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Lys Asp Cys

130 135 140

Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr

145 150 155 160

Lys Ala Leu Lys Thr Ala Asp Leu Arg Pro Gly Gln Trp Val Cys Ile

165 170 175

Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala Thr

180 185 190

Ala Met Gly Leu Arg Val Ile Ala Ile Asp Gly Gly Asp Glu Lys Ala

195 200 205

Thr Phe Cys Lys Ser Leu Gly Ala Glu Thr Phe Val Asp Phe Thr Lys

210 215 220

Thr Lys Asp Met Val Lys Ala Ile Gln Glu Ala Thr Asn Gly Gly Pro

225 230 235 240

His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Asp Ala Ala Ile Ser Gln Ser

245 250 255

Val Glu Tyr Val Arg Pro Leu Gly Lys Val Val Leu Val Gly Leu Pro

260 265 270

Ala His Ser Val Val Lys Ser Pro Val Phe Glu His Val Val Lys Ser

275 280 285

Ile Glu Ile Arg Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Leu Asp Thr Ala Glu

290 295 300

Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Thr Ile Lys Ile

305 310 315 320

Ile Gly Leu Ser Glu Leu Pro Lys Val Tyr Glu Leu Met Glu Gln Gly

325 330 335

Ala Ile Ile Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Thr Lys

340 345

<210> 3

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 3

Met Gly Glu Ile Glu Ser Tyr Cys Asn Lys Glu Leu Gly Pro Leu Pro

1 5 10 15

Thr Lys Ala Pro Thr Leu Ser Lys Asn Val Leu Asp Leu Phe Ser Leu

20 25 30

Lys Gly Lys Val Ala Ser Val Thr Gly Ser Ser Gly Gly Ile Gly Trp

35 40 45

Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp

50 55 60

Tyr Asn Ser His Pro Ala Asp Glu Lys Ala Glu His Leu Gln Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Gly Val His Ser Lys Ala Tyr Lys Cys Asn Ile Ser Asp Pro Lys

85 90 95

Ser Val Glu Glu Thr Ile Ser Gln Gln Glu Lys Asp Phe Gly Thr Ile

100 105 110

Asp Val Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Thr Trp Thr Gln Gly Pro Glu

115 120 125

Ile Asp Val Asp Asn Tyr Asp Ser Trp Asn Lys Ile Ile Ser Val Asp

130 135 140

Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Cys Ser His Asn Ile Gly Lys Ile Phe Lys

145 150 155 160

Lys Asn Gly Lys Gly Ser Leu Ile Ile Thr Ser Ser Ile Ser Gly Lys

165 170 175

Ile Val Asn Ile Pro Gln Leu Gln Ala Pro Tyr Asn Thr Ala Lys Ala

180 185 190

Ala Cys Thr His Leu Ala Lys Ser Leu Ala Ile Glu Trp Ala Pro Phe

195 200 205

Ala Arg Val Asn Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Asp Thr Asp Ile Thr

210 215 220

Asp Phe Ala Ser Lys Asp Met Lys Ala Lys Trp Trp Gln Leu Thr Pro

225 230 235 240

Leu Gly Arg Glu Gly Leu Thr Gln Glu Leu Val Gly Gly Tyr Leu Tyr

245 250 255

Leu Ala Ser Asn Ala Ser Thr Phe Thr Thr Gly Ser Asp Val Val Ile

260 265 270

Asp Gly Gly Tyr Thr Cys Pro

275

Claims

1.一种醇脱氢酶在制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮中的应用，其中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述醇脱氢酶催化作为底物的化合物2反应得到化合物1，化合物1即为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，其反应式如下：

并且，所述应用中所述醇脱氢酶催化的反应体系包括：作为底物的化合物2、所述醇脱氢酶和辅酶，所述辅酶为NADH或NADPH。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系还包括葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，反应过程中在葡萄糖脱氢酶以及葡萄糖的存在下实现所述辅酶的再生。

3.一种制备(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括：作为底物的化合物2、醇脱氢酶和辅酶；以化合物2为底物，在醇脱氢酶作用下，得到化合物1，化合物1即为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；

其反应式如下：

其中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述辅酶为NADH或NADPH。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，反应过程中在葡萄糖脱氢酶以及葡萄糖的存在下实现所述辅酶的再生。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述化合物2和辅酶的质量比为1000～10000:1。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述化合物2和葡萄糖的摩尔比为1:1-1:5。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述化合物2和葡萄糖的摩尔比为1:1-1:3。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为8.0-10.0。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为8.5-9.5。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为30-40℃。

11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(2)，纯化所述化合物1。

12.一种制备布瓦西坦的方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)按照权利要求3至权利要求11任一所述的方法，制得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮；