JP2005198655A - セファロスポリンcアシラーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】セファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素、それを調製するための組換えDNA方法、前記酵素をコードしているヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換させた細胞、および前記酵素によって7−アミノ−セファロスポラニン酸を調製する方法を提供すること。
【解決手段】大腸菌内での発現に最適化されたネイティブ配列部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または「部位飽和」突然変異誘発によって得られた、セファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素。
【選択図】図1
【解決手段】大腸菌内での発現に最適化されたネイティブ配列部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または「部位飽和」突然変異誘発によって得られた、セファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素。
【選択図】図1
Description
本発明は、セファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素、それを調製するための組換えDNA方法、前記酵素をコードしているヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換させた細胞、および前記酵素によって7−アミノ−セファロスポラン酸を調製する方法に関する。
セファロスポリンCアシラーゼとは、セファロスポリンCを、多くの半合成セファロスポリンを調製するための中間体である7−アミノ−セファロスポラン酸(7−ACA)へと変換する酵素である。
化学合成によって7−ACAをセファロスポリンCから得ることができたとしても、酵素的方法の方がより環境にやさしくコストが低いので、これが好ましい。
セファロスポリンCを7−ACAへと変換するための従来の酵素的手順では2種の異なる酵素、すなわちD−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)およびグルタリルアシラーゼが必要である。DAAOは、セファロスポリンCをα−ケト−アジポイル−7ACAへと変換すると同時に過酸化水素を生成する。その後、α−ケトアジポイル−7ACAを過酸化水素(酸化的脱アミノ化によって生成されるかつ/または反応媒体に加える)で酸化しグルタリル−7−ACAへとし、その後、グルタリルアシラーゼによってグルタリル−7−ACAを7−ACAへと加水分解する。従来方法では2つの個別の酵素反応器が必要であり、過酸化水素が存在することまたはそれを加えることによって固定化した酵素が失活する可能性があり、これはプラントに障害を与えてコストを増大させる。
セファロスポリンCを7−ACAへと直接加水分解する能力を有する酵素を開発する試みがなされてきた。シュードモナス(Pseudomonas)株から単離したSE83、N176およびV22と呼ばれる3種の既知の酵素がこの能力を有しているが(Journal of Fermentation and Bioengineering、第72巻(4)、232〜243、1991)、それらはセファロスポリンCに対するよりもグルタリル−7−ACAに対してアシラーゼ活性が高い。
これら酵素の特徴、特に特異性、安定性および活性を向上させるために、突然変異体やそれらを調製するための組換えDNA方法が開示されている(例えば特許文献1〜4参照。)。
米国特許第5320948号
欧州特許第475652号
欧州特許第558241号
米国特許第5804429号
しかし、動力学、安定性、活性および特異性に関してセファロスポリンCアシラーゼ活性が向上しており、大量に発現させることができる酵素が依然として必要とされている。
シュードモナスN176由来の既知のアシラーゼの配列に基づいて、セファロスポリンアシラーゼ活性を有する酵素をコードしている遺伝子が設計されている(Aramori I他、(1991)、Cloning and Nucleotide Sequencing of New Glutaryl 7-ACA and Cephalosporin C Acylase Genes from Pseudomonas Strains、Journal of Fermentation and Bioengineering、第72巻(4)、232〜243)。このアシラーゼは、グルタリル−7ACAに対しても、より低い程度にではあるがセファロスポリンCに対しても活性があることが報告されている。
開始遺伝子(野生型HisVACと命名)を設計する際に、様々な変異体を挿入した:
−位置270におけるフェニルアラニンの導入;この突然変異(文献から知られている)によりセファロスポリンCに対する活性が上昇する(Ishii Y.他、(1995)、high-level production,chemical modification and site-directed mutagenesis of a cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain N176、Eur.J.Biochem、230、773〜778)。
−位置270におけるフェニルアラニンの導入;この突然変異(文献から知られている)によりセファロスポリンCに対する活性が上昇する(Ishii Y.他、(1995)、high-level production,chemical modification and site-directed mutagenesis of a cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain N176、Eur.J.Biochem、230、773〜778)。
−活性部位領域(βサブユニットの最初のアミノ酸が触媒作用に関与している)が妨害されないようにした、C末端における追加の配列(アミノ酸LEHHHHHHからなる)の導入。前記配列は、pET24プラスミドをクローニングおよび発現のベクターとして使用して、続くクロマトグラフィーによる精製を容易にするために導入した。このプラスミドはカナマイシンに耐性があり、タンパク質のC末端に「His−タグ配列」を、N末端に「T7−タグ配列」を挿入することができる。プラスミド内へのクローニングを容易にするために、pET24のポリリンカーによってEcoRI、XhoIおよびNdeIの制限部位を含む領域を遺伝子の末端に加えた。
−対応するアミノ酸配列内に望ましくない変更が導入されないように、すなわち大腸菌(E.coli)のコドン使用頻度を用いた、一部の塩基の置換による遺伝子内の一部の制限部位(BamHIおよびNheI)の除去。
−最も翻訳されているコドンを使用した(具体的にはタンパク質のN末端の位置をコードしている配列を著しく改変した)、ヌクレオチド配列の大腸菌コドン使用頻度への最適化。主な突然変異は以下のとおりである:
1.大腸菌でほとんど使用されないグリシンのGGAコドンで置換;
2.大腸菌でほとんど使用されないアルギニンのAGGおよびCGAコドンで置換;
3.大腸菌でほとんど使用されないイソロイシンのATAコドンで置換;
4.大腸菌でほとんど使用されないプロリンのCCCコドンで置換;
5.大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミン酸のGAGおよびGAAコドンの使用のバランス;
6.大腸菌内でのその頻度に応じた、フェニルアラニンのTTTおよびTTCコドンの使用のバランス;
7.大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミンのCAGおよびCAAコドンの使用のバランス;
8.大腸菌内でのその頻度に応じた、ヒスチジンのCATおよびCACコドンの使用のバランス。
1.大腸菌でほとんど使用されないグリシンのGGAコドンで置換;
2.大腸菌でほとんど使用されないアルギニンのAGGおよびCGAコドンで置換;
3.大腸菌でほとんど使用されないイソロイシンのATAコドンで置換;
4.大腸菌でほとんど使用されないプロリンのCCCコドンで置換;
5.大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミン酸のGAGおよびGAAコドンの使用のバランス;
6.大腸菌内でのその頻度に応じた、フェニルアラニンのTTTおよびTTCコドンの使用のバランス;
7.大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミンのCAGおよびCAAコドンの使用のバランス;
8.大腸菌内でのその頻度に応じた、ヒスチジンのCATおよびCACコドンの使用のバランス。
この結果生じたcDNAは、ネイティブN176遺伝子に63.7%の配列同一性を有する。
その後、HisVACをコードしているcDNAが化学合成によって得られた(Itakura K、Rossi JJ、Wallace RB、Synthesis and use of synthetic oligonucleotides、Annu Rev Biochem.、1984、53:323〜56)。
今回、一部の特異的突然変異によって「野生型」酵素(本明細書中では以降HisVACと呼ぶ)の特性が著しく向上されることが判明した。
具体的には、本発明は、図1(配列番号1)に報告したアミノ酸配列を有する、以下の突然変異のうち1つまたは複数を挿入したセファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素を提供する:
−アラニン215をTyr、Phe、GluまたはValで置換;
−ヒスチジン296をAsn、Ser、Thr、Pheで置換;
−アスパラギン酸416およびヒスチジン417を任意の他のアミノ酸で置換;
−位置261、271、294、297、307、308および309のアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換。
−アラニン215をTyr、Phe、GluまたはValで置換;
−ヒスチジン296をAsn、Ser、Thr、Pheで置換;
−アスパラギン酸416およびヒスチジン417を任意の他のアミノ酸で置換;
−位置261、271、294、297、307、308および309のアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換。
特に好ましいのは以下の酵素である:
−アラニン215がTyrで置換されている;
−アラニン215がPheで置換されている;
−アラニン215がGluで置換されている;
−アラニン215がValで置換されている;
−ヒスチジン296がAsnで置換されている;
−ヒスチジン296がSerで置換されている;
−ヒスチジン296がThrで置換されている;
−ヒスチジン296がPheで置換されている;
−アラニン215がTyrで置換されており、ヒスチジン296がSerで置換されている。
−アラニン215がTyrで置換されている;
−アラニン215がPheで置換されている;
−アラニン215がGluで置換されている;
−アラニン215がValで置換されている;
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−ヒスチジン296がSerで置換されている;
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−アラニン215がTyrで置換されており、ヒスチジン296がSerで置換されている。
「野生型」酵素のアルギニン263は置換されていてはならない。
本発明の酵素は、以下を含む方法を用いて調製することができる:
−配列番号2(図2)のヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または完全突然変異誘発によって得ることができるDNA配列を細菌または真核細胞用の発現ベクター内に挿入すること;
−前記ベクターを用いて細菌細胞または真核細胞を形質転換させること;
−形質転換させた細胞を培養し、発現産物を抽出および回収すること。
−配列番号2(図2)のヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または完全突然変異誘発によって得ることができるDNA配列を細菌または真核細胞用の発現ベクター内に挿入すること;
−前記ベクターを用いて細菌細胞または真核細胞を形質転換させること;
−形質転換させた細胞を培養し、発現産物を抽出および回収すること。
その後、本発明の突然変異させた配列を従来方法を用いてプラスミド発現ベクター内に挿入することができ、これを用いて、酵素を産生する能力を有する大腸菌コンピテント細胞を形質転換させることができる。
想定される工業的使用では、酵素を、セファロスポリンCを7−アミノ−セファロスポラニン酸へと酵素的に変換させる際に使用する水性媒体に不溶性の合成ポリマーなどの固体担体に結合させることができる。アシラーゼの固定化に適した樹脂は、アクリル型の構造を有する樹脂、セパビーズ(Sepabeads)EC−EP(Resindion srl−Mitsubishi Chemical Corporation)やオイパーギット(Eupergit)C(Rohm-Degussa)などエポキシ官能基を有する樹脂、またはセパビーズEC−hasやEC−EA(Resindion srl−Mitsubishi Chemical Corporation)など第一級アミノ基を有する樹脂である。いずれにせよ、酵素をマトリックスに結合させるために、酵素を樹脂と接触させ、官能基(エポキシド)の高い反応性によって、またはグルタールアルデヒドなどの二官能性試薬を用いて樹脂を活性化させることによって固定化させる。アシラーゼの固定化に適した他の樹脂は、ポリスチレン樹脂、高度架橋樹脂およびセパビーズEC−Q1Aなど塩基性官能基を有する樹脂である。酵素は樹脂上に吸着され、その後二官能性試薬(グルタールアルデヒド)と架橋結合することによって安定化される。
(実施例1)
微生物の培養および発酵
寒天プレートから単離した単一のコロニーを培養し、HisVACの発現プラスミドを含む大腸菌株を維持する。すべての株が様々な寒天培地、特にpH7.0であり以下の組成を有するLB培地およびLBミラー培地(1%のグルコース含むものおよび含まないもの)中で十分な増殖率を示す:
LB=10g/lのトリプトン(カゼインの膵液消化物);5g/lの酵母抽出液;5g/lのNaCl;
LBミラー=10g/lのトリプトン(カゼインの膵液消化物);5g/lの酵母抽出液;10g/lのNaCl。
微生物の培養および発酵
寒天プレートから単離した単一のコロニーを培養し、HisVACの発現プラスミドを含む大腸菌株を維持する。すべての株が様々な寒天培地、特にpH7.0であり以下の組成を有するLB培地およびLBミラー培地(1%のグルコース含むものおよび含まないもの)中で十分な増殖率を示す:
LB=10g/lのトリプトン(カゼインの膵液消化物);5g/lの酵母抽出液;5g/lのNaCl;
LBミラー=10g/lのトリプトン(カゼインの膵液消化物);5g/lの酵母抽出液;10g/lのNaCl。
寒天プレートを37℃で1日間インキュベートし、その後細胞を剥す。プレートを4℃で数週間維持することでコロニーは生存し続ける。
細胞を滅菌溶液中に懸濁させ、懸濁液(OD600=4まで増殖させた)を34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含むLBミラー培地を入れたフラスコ(または発酵槽、フラスコ内で増殖期(vegetative phase)を完了させた後)に移す。培養物を37℃、200rpmで3時間、OD600=0.8(指数増殖期)まで増殖させる。増殖期(productive phase)後、0.6mMのIPTGを加えることによって誘導を行い、その後、細胞を21℃または25℃で3〜5時間増殖させる。
野生型HisVACアシラーゼの抽出および精製
HisVACとは細胞内アシラーゼである。発酵後、培養物のブロスを遠心分離し、化学的(洗剤または水酸化ナトリウムを数秒間加える)または物理的(プレスまたはガラスビーズによる粉砕)処理によって細胞膜の溶解を行う。好ましい方法はリン酸またはピロリン酸緩衝液(pH7.5〜8)などの緩衝溶液中への細胞ペーストの再懸濁、次いでフレンチプレスまたはラニー(Rannie)ホモジナイザーによる600〜800バールでの溶解である。細胞溶解液を、任意選択で高分子電解質の存在下で遠心分離または精密濾過(カットオフ0.45μm)によって清澄にした。粗酵素を含む清澄にした溶液をクロマトグラフィーによって精製した。好ましい手順は、ヒスチジンでタグしたタンパク質を選択的に吸着する能力を有する、金属イオン(たとえば亜鉛やニッケル)に結合するイミン二酢酸基を有するキレート化樹脂を含むカラムによる精製である。適切なクロマトグラフィー用樹脂はHiTrap Chelating(Amersham Biosciences)およびセパビーズFP−IDA(Resindion srl-Mitsubishi Chemical Corporation)である。高純度のHisVACアシラーゼは、イミダゾール濃度を増加させながらまたはpHを変化させながら溶出させることによって得ることができる。
HisVACとは細胞内アシラーゼである。発酵後、培養物のブロスを遠心分離し、化学的(洗剤または水酸化ナトリウムを数秒間加える)または物理的(プレスまたはガラスビーズによる粉砕)処理によって細胞膜の溶解を行う。好ましい方法はリン酸またはピロリン酸緩衝液(pH7.5〜8)などの緩衝溶液中への細胞ペーストの再懸濁、次いでフレンチプレスまたはラニー(Rannie)ホモジナイザーによる600〜800バールでの溶解である。細胞溶解液を、任意選択で高分子電解質の存在下で遠心分離または精密濾過(カットオフ0.45μm)によって清澄にした。粗酵素を含む清澄にした溶液をクロマトグラフィーによって精製した。好ましい手順は、ヒスチジンでタグしたタンパク質を選択的に吸着する能力を有する、金属イオン(たとえば亜鉛やニッケル)に結合するイミン二酢酸基を有するキレート化樹脂を含むカラムによる精製である。適切なクロマトグラフィー用樹脂はHiTrap Chelating(Amersham Biosciences)およびセパビーズFP−IDA(Resindion srl-Mitsubishi Chemical Corporation)である。高純度のHisVACアシラーゼは、イミダゾール濃度を増加させながらまたはpHを変化させながら溶出させることによって得ることができる。
精製したHisVACは、pH5〜9の範囲で120分間インキュベートした後に安定である。酵素活性は5〜10の範囲の反応溶液のpHの関数として増大し、30分間の反応後に40℃で最高値に達する。
pET24Δ−HisVACプラスミドで形質転換させた大腸菌BL21(DE3)pLysSの培養によるHisVACアシラーゼの産生
1)微生物の調製
HisVACをコードしているcDNA(野生型および突然変異体、2322bp)を制限酵素NdeIおよびBamHIで消化する。このcDNAをNdeI−BamHIで消化したpET24Δ(BglII−Tth111I)−HisVAC発現プラスミドに相当する3.6kbの断片内に連結させる。このプラスミドは、制限酵素BglIIおよびTth111Iによる7.6kbのpET24−HisVACプラスミド(制限酵素XhoI/NdeIで処理した全VAC cDNA(2.3kb)をXhoI/NdeIで消化したpET24プラスミドの5.3kb断片内にクローニングすることによって得られた)の切断、4984bp断片の回収、クレノウ(Klenow)酵素による粘着末端の平滑化およびライゲーションによって得られた。この結果生じたpETΔ−HisVACを用いてBL21(DE3)pLysS大腸菌細胞を形質転換させる。形質転換させた細胞を34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含むLB−寒天プレートに移し、37℃で24時間インキュベートする。個々のコロニーをプレートから選択し、34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む750mlの液体LBミラー培地中で培養する。細胞内にpET24Δ−HisVACプラスミドが存在するかどうかは、回収したプラスミドDNAの制限分析によって確認する。
1)微生物の調製
HisVACをコードしているcDNA(野生型および突然変異体、2322bp)を制限酵素NdeIおよびBamHIで消化する。このcDNAをNdeI−BamHIで消化したpET24Δ(BglII−Tth111I)−HisVAC発現プラスミドに相当する3.6kbの断片内に連結させる。このプラスミドは、制限酵素BglIIおよびTth111Iによる7.6kbのpET24−HisVACプラスミド(制限酵素XhoI/NdeIで処理した全VAC cDNA(2.3kb)をXhoI/NdeIで消化したpET24プラスミドの5.3kb断片内にクローニングすることによって得られた)の切断、4984bp断片の回収、クレノウ(Klenow)酵素による粘着末端の平滑化およびライゲーションによって得られた。この結果生じたpETΔ−HisVACを用いてBL21(DE3)pLysS大腸菌細胞を形質転換させる。形質転換させた細胞を34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含むLB−寒天プレートに移し、37℃で24時間インキュベートする。個々のコロニーをプレートから選択し、34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む750mlの液体LBミラー培地中で培養する。細胞内にpET24Δ−HisVACプラスミドが存在するかどうかは、回収したプラスミドDNAの制限分析によって確認する。
2)発酵
a)増殖期
pET24Δ−HisVACプラスミドで形質転換させたBL21(DE3)pLysS大腸菌細胞を37℃で24時間、34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む固体LB−寒天培地中で発酵させる。細胞を100mlの滅菌溶液中に再懸濁させ、懸濁液(OD600=4まで増殖させた)15mlを34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む750mlのLBミラー培地を入れた2lフラスコ(または発酵槽、増殖期が完了するまでフラスコ内で増殖させた後)に移す。培養物を37℃、200rpmで3時間、OD600=0.8(指数増殖期)まで増殖させる。
a)増殖期
pET24Δ−HisVACプラスミドで形質転換させたBL21(DE3)pLysS大腸菌細胞を37℃で24時間、34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む固体LB−寒天培地中で発酵させる。細胞を100mlの滅菌溶液中に再懸濁させ、懸濁液(OD600=4まで増殖させた)15mlを34μg/mlのクロラムフェニコールおよび30μg/mlのカナマイシンを含む750mlのLBミラー培地を入れた2lフラスコ(または発酵槽、増殖期が完了するまでフラスコ内で増殖させた後)に移す。培養物を37℃、200rpmで3時間、OD600=0.8(指数増殖期)まで増殖させる。
b)誘導期
増殖期の後、0.6mMのIPTGを加えることによって誘導を行う。誘導後、細胞を21℃または25℃で増殖させる。3〜5時間後に最も高い酵素産生が達成される。
増殖期の後、0.6mMのIPTGを加えることによって誘導を行う。誘導後、細胞を21℃または25℃で増殖させる。3〜5時間後に最も高い酵素産生が達成される。
(実施例2)
野生型HisVACアシラーゼの抽出および精製
実施例1に記載のように4.5リットルのブロスから得た細胞ペースト(13g、90UのHisVACアシラーゼに相当する)を、0.7μg/mlのペプスタチンを含む39mlの50mMリン酸緩衝液、pH7.5中に再懸濁させる。懸濁液を4℃に冷却し、フレンチプレスに通す。39000gで60分間遠心分離することによって溶解液を清澄にする。総ユニット数90に相当する1.8U/mlのHisVACアシラーゼ活性を有する50mlの清澄にした溶液が得られる。この粗試料を、事前にニッケルイオンを載せて50mMのピロリン酸ナトリウム緩衝液、1MのNaClおよび20mMのイミダゾール緩衝液、pH7.2で平衡化した5mlのHiTrap Chelatingカラム(Amersham Biosciences)に載せる。HisVACアシラーゼを6mlの50mMのピロリン酸ナトリウム緩衝液、500mMのイミダゾール、10%のグリセロール、pH7.2で溶出させる。精製した酵素は12U/ml(総ユニット数72)の活性を有しており、グルタリル−7ACAを基質として、タンパク質1mgあたり6.5Uの特異的活性を有している。
野生型HisVACアシラーゼの抽出および精製
実施例1に記載のように4.5リットルのブロスから得た細胞ペースト(13g、90UのHisVACアシラーゼに相当する)を、0.7μg/mlのペプスタチンを含む39mlの50mMリン酸緩衝液、pH7.5中に再懸濁させる。懸濁液を4℃に冷却し、フレンチプレスに通す。39000gで60分間遠心分離することによって溶解液を清澄にする。総ユニット数90に相当する1.8U/mlのHisVACアシラーゼ活性を有する50mlの清澄にした溶液が得られる。この粗試料を、事前にニッケルイオンを載せて50mMのピロリン酸ナトリウム緩衝液、1MのNaClおよび20mMのイミダゾール緩衝液、pH7.2で平衡化した5mlのHiTrap Chelatingカラム(Amersham Biosciences)に載せる。HisVACアシラーゼを6mlの50mMのピロリン酸ナトリウム緩衝液、500mMのイミダゾール、10%のグリセロール、pH7.2で溶出させる。精製した酵素は12U/ml(総ユニット数72)の活性を有しており、グルタリル−7ACAを基質として、タンパク質1mgあたり6.5Uの特異的活性を有している。
(実施例3)
HisVACアシラーゼのEC−EPセパビーズへの固定化
1gのEC−EPセパビーズを、100ユニットのアシラーゼを含む20℃の10mlの1Mリン酸カリウム緩衝液、pH8.0に加える。混合物を12時間、20℃で穏やかに攪拌し続け、その後、さらに12時間、20℃で静置する。濾過により樹脂を回収し、25mMのリン酸カリウム緩衝液、pH8.0で洗浄する。この結果生じた生体触媒は、グルタリル−7ACAを基質として35〜40U/gの固定化した際の活性を有する。
HisVACアシラーゼのEC−EPセパビーズへの固定化
1gのEC−EPセパビーズを、100ユニットのアシラーゼを含む20℃の10mlの1Mリン酸カリウム緩衝液、pH8.0に加える。混合物を12時間、20℃で穏やかに攪拌し続け、その後、さらに12時間、20℃で静置する。濾過により樹脂を回収し、25mMのリン酸カリウム緩衝液、pH8.0で洗浄する。この結果生じた生体触媒は、グルタリル−7ACAを基質として35〜40U/gの固定化した際の活性を有する。
(実施例4)
溶液中における、HisVACアシラーゼによるセファロスポリンCの変換
0.053gのセファロスポリンC、ナトリウム塩二水和物(純度86%)を20mlの100mMリン酸カリウム緩衝液、pH8(2.27g/l、純度100%と仮定する)に溶かし、6.4mlの精製したアシラーゼ(総ユニット数167.2)に加える。混合物を攪拌下、20℃でインキュベートし、この間希水酸化ナトリウムを加えることによってpHを8に保つ。150分間に7−ACAへの最大の変換率が得られる(92.8%変換、HPLC)。
溶液中における、HisVACアシラーゼによるセファロスポリンCの変換
0.053gのセファロスポリンC、ナトリウム塩二水和物(純度86%)を20mlの100mMリン酸カリウム緩衝液、pH8(2.27g/l、純度100%と仮定する)に溶かし、6.4mlの精製したアシラーゼ(総ユニット数167.2)に加える。混合物を攪拌下、20℃でインキュベートし、この間希水酸化ナトリウムを加えることによってpHを8に保つ。150分間に7−ACAへの最大の変換率が得られる(92.8%変換、HPLC)。
(実施例5)
突然変異体の調製
1.部位特異的突然変異誘発
二本鎖DNAの特異的部位に突然変異を導入することを可能にする「QuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット」(STRATAGENE)を用いて、ヌクレオチドの突然変異を導入する。目的遺伝子を含む二本鎖pET24Δ−HisVACおよび所望の突然変異を含む2つのプライマーを使用する。それぞれが対応するベクター鎖に相補的なプライマーは、高い厳密性で両プラスミド鎖を複製するPfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼを用いて伸長させる。PCR後、混合物をDpnI(親DNAを消化するために用いる、メチル化DNAに特異的なエンドヌクレアーゼDNA)で処理し、生成物を用いてXL1−Blueスーパーコンピテント細胞を形質転換させ、これからDNAを抽出して大腸菌発現株BL21(DE3)pLysSを形質転換させる。
突然変異体の調製
1.部位特異的突然変異誘発
二本鎖DNAの特異的部位に突然変異を導入することを可能にする「QuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット」(STRATAGENE)を用いて、ヌクレオチドの突然変異を導入する。目的遺伝子を含む二本鎖pET24Δ−HisVACおよび所望の突然変異を含む2つのプライマーを使用する。それぞれが対応するベクター鎖に相補的なプライマーは、高い厳密性で両プラスミド鎖を複製するPfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼを用いて伸長させる。PCR後、混合物をDpnI(親DNAを消化するために用いる、メチル化DNAに特異的なエンドヌクレアーゼDNA)で処理し、生成物を用いてXL1−Blueスーパーコンピテント細胞を形質転換させ、これからDNAを抽出して大腸菌発現株BL21(DE3)pLysSを形質転換させる。
約50ngの鋳型DNA(pET24Δ−HisVAC)、それぞれ125ngのプライマー、2.5UのPfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼを使用し、以下のPCRプログラムを実行する:
部位特異的突然変異誘発によって得た突然変異したタンパク質は、実施例2に記載のように精製した。
2.部位飽和突然変異誘発
ランダム組換えHisVAC突然変異体のライブラリーを得るために、部位飽和(または完全)突然変異誘発を使用し、これは、20種のアミノ酸の任意の1種をタンパク質の同じ位置に挿入することを可能にするので使用する。この技術は特定の標的コドン中に様々な突然変異を導入するために変性オリゴヌクレオチドを使用することからなる。オリゴヌクレオチドは「飽和」する位置に対応する等モルのヌクレオシド混合物(dA、dC、dG、dT)を用いて合成する。これにより生じる突然変異遺伝子の集合体は、ランダムコドンを有する同一の遺伝子からなる。様々なクローン内で、このコドンは任意のアミノ酸をコードすることができ、したがって、1つの特定標的残基における可能なすべてのアミノ酸置換を有する突然変異体のライブラリーが得られる。pET24Δ−AcyHis発現プラスミドをDNA鋳型として使用し、特定の残基(たとえば位置215および296のアミノ酸)をコードしているコドンの3つの塩基すべてが変性したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
ランダム組換えHisVAC突然変異体のライブラリーを得るために、部位飽和(または完全)突然変異誘発を使用し、これは、20種のアミノ酸の任意の1種をタンパク質の同じ位置に挿入することを可能にするので使用する。この技術は特定の標的コドン中に様々な突然変異を導入するために変性オリゴヌクレオチドを使用することからなる。オリゴヌクレオチドは「飽和」する位置に対応する等モルのヌクレオシド混合物(dA、dC、dG、dT)を用いて合成する。これにより生じる突然変異遺伝子の集合体は、ランダムコドンを有する同一の遺伝子からなる。様々なクローン内で、このコドンは任意のアミノ酸をコードすることができ、したがって、1つの特定標的残基における可能なすべてのアミノ酸置換を有する突然変異体のライブラリーが得られる。pET24Δ−AcyHis発現プラスミドをDNA鋳型として使用し、特定の残基(たとえば位置215および296のアミノ酸)をコードしているコドンの3つの塩基すべてが変性したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
部位特異的突然変異誘発にも使用される「QuikChange部位特異的突然変異誘発キット」(STRATAGENE)を使用して突然変異を導入した。変異したDNAを使用して発現株BL21(DE3)pLysSを形質転換させる。その後、変異したクローンをスクリーニングに供し、実施例2に記載のように精製した。
3.ランダム突然変異誘発
変異性PCRで目的遺伝子を増幅することによって組換えHisVAC酵素突然変異体のライブラリーを調製した。増幅は、様々な突然変異誘発条件下で実施した:
a.10%のDMSO、1mMの2−メルカプトエタノール、および多数回のサイクル;
b.[Mn++]=0.5mM、[Mg++]=0.25mM、[dGTP]および[dATP]=0.2mM、[dCTP]および[dTTP]=1mM。
変異性PCRで目的遺伝子を増幅することによって組換えHisVAC酵素突然変異体のライブラリーを調製した。増幅は、様々な突然変異誘発条件下で実施した:
a.10%のDMSO、1mMの2−メルカプトエタノール、および多数回のサイクル;
b.[Mn++]=0.5mM、[Mg++]=0.25mM、[dGTP]および[dATP]=0.2mM、[dCTP]および[dTTP]=1mM。
pET24Δ−AcyHis発現プラスミド(以下参照)をDNA鋳型として使用し、2つの指定したオリゴヌクレオチド、すなわちRND−ACY−EXT(5'−CGAGATCTCGATCCCGCGAAA−3')およびRND−ACY−UP(5'−AACCAACCGTTTCATGATGCTTCGGC−3')をプライマーとして使用した。これらのプライマーは以下のスキームに示すように制限酵素NdeIおよびBamHIの部位に隣接するベクター領域にアニーリングさせる。
増幅されたバンド(約1.6kb)をDNA鋳型(7.6kb)から単離するために、PCR産物をプールし、アガロースゲルで分離する。その後、増幅したDNAをゲル精製し、制限酵素NdeIおよびBamHIを用いた予備消化に供する。消化混合物をアガロースゲルに載せ、目的断片(約1.4kb)を回収してゲル精製した。抽出したDNAを制限酵素NdeIおよびBamHIを用いたO.N.消化に供し、3.6kbおよび1.4kbの2つの断片が得られた。目的断片(3.6kb)を回収し、ゲル精製した。突然変異誘発条件下で増幅し、消化および精製した、AcyHis酵素をコードしているDNAを発現ベクターpET24Δ(BglII−Tth111)−AcyHis内に連結させる。このライゲーション混合物を用いて大腸菌株JM109を形質転換させる。
「突然変異体ライブラリー」を大腸菌BL21(DE3)pLysS(発現株)内に移すために、細胞を、得られたすべての突然変異体を含むプラスミドDNAのプールで形質転換させる。この目的のために、ライゲーション産物を用いたJM109細胞の形質転換によって得られたすべてのコロニーを選択培地中に再懸濁させ、全プラスミドDNAを抽出する。このDNAは、BL21(DE3)pLysS発現株を形質転換させるために使用する。
(実施例6)
突然変異誘発によって得られた突然変異体の特徴
突然変異体およびHisVACアシラーゼの動力学的パラメータは、37℃における0.1Mのリン酸緩衝溶液、pH8.0中でのセファロスポリンCまたはグルタリル7−ACAの加水分解率を測定して決定した(その後、25℃におけるユニットに換算変換した)。7−ACAの量は、標準曲線を使用し、改変したBulasingham法(Biochem.Biophys.Acta、276、250、1972)を用いてp−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応によって生じる415nmにおける黄色強度(シッフ塩基)を測定する分光光度法によって決定する。
突然変異誘発によって得られた突然変異体の特徴
突然変異体およびHisVACアシラーゼの動力学的パラメータは、37℃における0.1Mのリン酸緩衝溶液、pH8.0中でのセファロスポリンCまたはグルタリル7−ACAの加水分解率を測定して決定した(その後、25℃におけるユニットに換算変換した)。7−ACAの量は、標準曲線を使用し、改変したBulasingham法(Biochem.Biophys.Acta、276、250、1972)を用いてp−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応によって生じる415nmにおける黄色強度(シッフ塩基)を測定する分光光度法によって決定する。
1ユニットのアシラーゼとは、アッセイ条件下で1分間に1マイクロモルの7−ACAを生じる(溶液中のまたは固定化した)酵素の量である。
以下の表に報告するデータによると、本発明の突然変異体は野生型HisVACアシラーゼと比較して、グルタリル−7−ACAに対するよりもセファロスポリンCに対して良好な動力学特性を有する。
さらに、突然変異体A215Yは25℃より高い温度でより安定である。
産物−阻害のデータを以下の表に報告する。このデータは、野生型HisVACに対して、変異アシラーゼの産物の阻害において有意な変化を示している。
Claims (15)
- 配列番号1のアミノ酸配列を有する、以下の突然変異のうち1つまたは複数が導入されたセファロスポリンCアシラーゼ活性を有する酵素
アラニン215がTyr、Phe、GluまたはValで置換されている;
ヒスチジン296がAsn、Ser、ThrまたはPheで置換されている;
アスパラギン酸416およびヒスチジン417が任意の他のアミノ酸で置換されている;
アミノ酸261、271、294、297、307、308および309が任意の他のアミノ酸で置換されている。 - アラニン215がTyrで置換されている、請求項1に記載の酵素。
- アラニン215がPheで置換されている、請求項1に記載の酵素。
- アラニン215がGluで置換されている、請求項1に記載の酵素。
- アラニン215がValで置換されている、請求項1に記載の酵素。
- ヒスチジン296がAsnで置換されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵素。
- ヒスチジン296がSerで置換されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵素。
- ヒスチジン296がThrで置換されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵素。
- ヒスチジン296がPheで置換されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の酵素。
- アラニン215がTyrで置換されており、ヒスチジン296がSerで置換されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の酵素。
- 配列番号2のヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または完全突然変異誘発によって得ることができるDNA配列を細菌または真核細胞用の発現ベクター内に挿入すること;
前記ベクターを用いて細菌細胞または真核細胞を形質転換させること;
形質転換させた細胞を培養し、発現産物を抽出および回収すること
を含む、請求項1から10のいずれかに記載の酵素を調製する方法。 - 適切なアシル化剤の存在下で、請求項1から10のいずれかに記載の酵素を用いてセファロスポリンCを加水分解およびアシル化することを含む、セファロスポリンを調製する方法。
- 請求項1から10のいずれかに記載の酵素をコードしているヌクレオチド配列。
- 請求項13に記載の配列を含む発現ベクター。
- 請求項14に記載のベクターで形質転換させた細胞。
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