CN116103360A - 一种酶法制备硒代氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种使用酶法合成L‑硒甲基硒代半胱氨酸的方法。以消旋的N‑乙酰基‑硒甲基硒代半胱氨酸为底物，通过立体选择性的N‑乙酰基‑L‑氨基酸酰化水解酶和N‑乙酰基‑氨基酸消旋酶两个酶的共同催化下，实现绿色高效、高收率酶法制备高手性纯度的L‑硒甲基硒代半胱氨酸。采用双酶法催化底物一锅法同步消旋和选择性水解，直至底物全部转化为L‑硒甲基硒代半胱氨酸，理论收率>99%；该方法可实现底物的完全转化，利于产物纯化，可获得更高手性纯度的产物，产物e.e>98%。

Description

一种酶法制备硒代氨基酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种使用酶法合成L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法。
背景技术
随着经济的发展和科学的进步，食品工业也得到了迅速的发展，随之而来的是消费者对食品产品更高的要求。为满足日益增长的需求，食品添加剂应运而生，并在提高食品品质，延长货期等方面发挥了长足的作用，如今已成为食品工艺不可分割的一部分。因此，研发更为安全，生产成本更加低廉的食品添加剂也吸引了国内广大研究者的目光。按中华人民共和国国家标准《GBI4880营养强化剂》的规定，L-硒甲基硒代半胱氨酸是一种新型的硒源类的食品营养强化剂，是唯一一个被批准成为食品添加剂的有机硒化合物。但是，（新型营养强化剂L-硒甲基硒代半胱氨酸的研究进展，中国食品添加剂，2010）化学合成途径主要有氯丙氨酸二硒化钠法、叔丁氧基酰基保护丝氨酸法、甲硒醇钠取代氯丙氨酸法等几种路线，但受制于苛刻的反应条件、高危险性的试剂和反应以及高昂的合成成本，目前国内难以展开大规模生产。
专利CN200710009544.4报道从N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸为底物，通过动物胰腺来源的立体选择性的N-乙酰基-L-氨基酸酰化水解酶进行手性拆分的方法受限于动物来源的酶的提取制备成本高昂，并且理论收率仅有50%，实际经过产物纯化后收率更低。因此，高效、安全、经济的生产方法成为了制备该产品的关键性技术瓶颈。
发明内容
本发明公开了一种使用大肠杆菌重组表达L-氨基酸酰化水解酶（AMH）和乙酰氨基酸消旋酶（NAAAR）双酶法合成L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法。以消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸为底物，通过立体选择性的N-乙酰基-L-氨基酸酰化水解酶和N-乙酰基-氨基酸消旋酶两个酶的共同催化下，实现绿色高效、高收率（>95%）酶法制备高手性纯度的L-硒甲基硒代半胱氨酸（e.e>98%）（反应路线见图1）。该方法使用的酶可通过大肠杆菌重组异源表达快速廉价获得，大幅降低酶的成本；采用双酶法催化底物一锅法同步消旋和选择性水解，直至底物全部转化为L-硒甲基硒代半胱氨酸，理论收率>99%；该方法可实现底物的完全转化，利于产物纯化，可获得更高手性纯度的产物，产物e.e>98%。
因此，本发明提供一种使用酶法合成L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法，其包括如下步骤：采用L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶两种酶作为催化酶，以消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸为底物，通过立体选择性的N-乙酰基-L-氨基酸酰化水解酶和N-乙酰基-氨基酸消旋酶两个酶的共同催化下反应，制备得到高手性纯度的L-硒甲基硒代半胱氨酸（优选地e.e>80%，>90%，>95%，或>98%）。
在本发明研究过程，采用的两个酶均是经过大量筛选才获得的针对硒氨基酸底物活性较好的酶。因为自然界存在可以催化氨基乙酰化天然氨基酸消旋化的酶，但这类酶的底物限制在一定范围内，仅对部分乙酰化的氨基酸如乙酰化L-丙氨酸、乙酰化L-甲硫氨酸等具有活性,对极微量的稀有氨基酸如硒代氨基酸的相关消旋酶的的活性研究还未见报道。并且，本发明采用的来源于耐辐射奇异球菌( Deinococcus radiodurans)乙酰氨基酸消旋酶DrNAAAR不仅要对底物乙酰化D-硒甲基半胱氨酸具有较好的消旋活性，同时对L-硒甲基半胱氨酸无活性或活性微弱，满足这一条件才能实现本专利所述的双酶催化的实施效果，同样也本发明经过大量筛选才能获得专的。
相应地，本发明方法中优选地，所述L-氨基酸酰化水解酶来源于茂源链霉菌（ Streptomyces mobaraensis）SmAMH；优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；更优选地，根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，优选地其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述乙酰氨基酸消旋酶来源于耐辐射奇异球菌( Deinococcus radiodurans)DrNAAAR，优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；更优选地，根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，优选地其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
来源于茂源链霉菌（ Streptomyces mobaraensis）的L-氨基酸酰化水解酶SmAMH的氨基酸如SEQ ID NO：1所示：
MAVDPRRGPCATAPGGEPRGGSVSAEHTTGAENEVVDICRDLIRIDTSNYGDHSGPGERAAAEYVAEKLAEVGLEPRIFESHPGRASTVARIEGEDPSRPALLIHGHTDVVPADAADWTHHPFAGEIADGCLWGRGAVDMKDMDAMTLAVVRDRMRTGRKPPRDVVLAFLADEEAGGTYGARYLVDKHPGLFEGVTEAISEVGGFSFTVNENLRLYLVETAQKGMHWMRLTVEGTAGHGSMTNTDNAITELCEAVGRLGRHQFPVRVTKTVRSFLDELSDALGTPLDPEDMEATLAKLGGIAKIIGATLRNTAAPTMLGAGYKVNVIPGQATAHVDGRFLPGYEEEFLADLDRILGPRVKREDVHADKALETGFDGDLVQAMQTALRAEDPIARAVPYMLSGGTDAKSFDDLGIRGFGFAPLKLPPELDFAGMFHGVDERVPVDGLTFGARVLDRFLDEC。
其优化的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
ATGGCAGTGGATCCGCGTCGTGGCCCGTGCGCTACCGCACCTGGTGGTGAACCGCGTGGCGGTAGTGTTAGCGCAGAACATACCACCGGCGCAGAAAATGAAGTTGTGGATATTTGTCGCGATCTGATTCGCATTGATACCAGCAATTATGGTGACCATAGCGGCCCGGGTGAACGCGCAGCAGCCGAATATGTGGCCGAAAAACTGGCCGAAGTGGGTCTGGAACCGCGTATTTTTGAAAGCCATCCGGGTCGTGCCAGCACCGTGGCCCGTATTGAAGGTGAAGATCCGAGTCGCCCGGCACTGCTGATTCATGGCCATACCGATGTTGTGCCGGCCGATGCAGCCGATTGGACCCATCATCCGTTTGCCGGCGAAATTGCAGATGGTTGCCTGTGGGGTCGCGGCGCAGTGGATATGAAAGATATGGATGCCATGACCCTGGCAGTTGTTCGCGATCGCATGCGTACCGGCCGTAAACCGCCGCGCGATGTGGTGCTGGCATTTCTGGCCGATGAAGAAGCCGGCGGTACCTATGGCGCCCGCTATCTGGTTGATAAACATCCGGGCCTGTTTGAAGGTGTGACCGAAGCCATTAGCGAAGTTGGTGGTTTTAGCTTTACCGTTAATGAAAATCTGCGCCTGTATCTGGTTGAAACCGCCCAGAAAGGTATGCATTGGATGCGTCTGACCGTGGAAGGTACCGCAGGTCATGGCAGCATGACCAATACCGATAATGCCATTACCGAACTGTGTGAAGCAGTTGGCCGTCTGGGCCGTCATCAGTTTCCGGTTCGTGTTACCAAAACCGTGCGTAGCTTTCTGGATGAACTGAGCGATGCACTGGGCACCCCGCTGGATCCGGAAGATATGGAAGCAACCCTGGCCAAACTGGGTGGTATTGCAAAAATTATTGGCGCAACCCTGCGTAATACCGCAGCACCGACCATGCTGGGTGCAGGCTATAAAGTTAATGTGATTCCGGGCCAGGCAACCGCCCATGTGGATGGTCGTTTTCTGCCGGGTTATGAAGAAGAATTTCTGGCAGATCTGGATCGTATTCTGGGCCCGCGCGTGAAACGTGAAGATGTTCATGCAGATAAAGCCCTGGAAACCGGTTTTGATGGTGACCTGGTGCAGGCAATGCAGACCGCACTGCGCGCCGAAGATCCGATTGCACGCGCCGTGCCGTATATGCTGAGCGGTGGTACCGATGCAAAAAGCTTTGATGATCTGGGCATTCGTGGCTTTGGCTTTGCACCGCTGAAACTGCCGCCGGAACTGGATTTTGCCGGCATGTTTCATGGCGTGGATGAACGCGTGCCGGTGGATGGTCTGACCTTTGGTGCACGCGTGCTGGATCGTTTTCTGGATGAGTGT。
来源于耐辐射奇异球菌( Deinococcus radiodurans)乙酰氨基酸消旋酶DrNAAAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
MAHTGRMFKIEAAEIVVARLPLKFRFETSFGVQTHKVVPLLILHGEGVQGVAEGTMEARPMYREETIAGALDLLRGTFLPAILGQTFANPEAVADALGSYRGNRMARAMVEMAAWDLWARTLGVPLGTLLGGHKEQVEVGVSLGIQAGEQATVDLVRKHVEQGYRRIKLKIKPGWDVQPVRATREAFPDIRLTVDANSAYTLADAGRLRQLDEYDLTYIEQPLAWDDLVDHAELARRIRTPLCLDESVASAADARKALALGAGGVINLKVARVGGHAESRRVHDVAQSFGAPVWCGGMLESGIGRAHNIHLSTLPNFRLPGDTSSASRYWERDLIQEPLEAVDGLMPVPQGPGTGVTLDREFLATVTEAQEEHRA。
其优化的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
ATGGCCCATACCGGTCGCATGTTCAAAATTGAAGCCGCAGAAATTGTGGTGGCCCGTCTGCCGCTGAAATTCCGCTTCGAAACCAGCTTCGGCGTTCAGACCCATAAAGTGGTTCCGCTGCTGATTCTGCATGGCGAAGGCGTGCAGGGCGTGGCAGAAGGCACCATGGAAGCACGTCCGATGTATCGCGAAGAAACCATTGCAGGTGCACTGGATCTGCTGCGTGGCACCTTCCTGCCGGCCATTCTGGGTCAGACCTTCGCAAATCCGGAAGCCGTTGCAGATGCACTGGGTAGCTATCGTGGTAATCGCATGGCACGTGCAATGGTGGAAATGGCAGCCTGGGATCTGTGGGCACGCACCCTGGGCGTTCCGCTGGGTACCCTGCTGGGCGGTCATAAAGAACAGGTGGAAGTTGGCGTTAGTCTGGGCATTCAGGCAGGTGAACAGGCCACCGTTGATCTGGTGCGCAAACATGTGGAACAGGGCTATCGTCGCATTAAACTGAAAATTAAACCGGGCTGGGATGTTCAGCCGGTTCGCGCCACCCGTGAAGCATTCCCGGATATTCGTCTGACCGTTGATGCCAATAGTGCATATACCCTGGCCGATGCAGGTCGCCTGCGTCAGCTGGATGAATATGATCTGACCTATATTGAACAGCCGCTGGCCTGGGATGATCTGGTTGATCATGCAGAACTGGCCCGTCGCATTCGCACCCCGCTGTGCCTGGATGAAAGTGTGGCAAGTGCAGCAGATGCACGCAAAGCCCTGGCACTGGGCGCAGGTGGCGTTATTAATCTGAAAGTGGCCCGTGTTGGTGGCCATGCAGAAAGCCGCCGTGTTCATGATGTTGCCCAGAGCTTCGGCGCCCCGGTGTGGTGTGGTGGCATGCTGGAAAGTGGTATTGGCCGCGCCCATAATATTCATCTGAGCACCCTGCCGAACTTCCGTCTGCCGGGCGATACCAGCAGTGCAAGTCGTTATTGGGAACGCGATCTGATTCAGGAACCGCTGGAAGCCGTGGATGGTCTGATGCCGGTTCCGCAGGGTCCGGGTACCGGCGTTACCCTGGATCGTGAATTCCTGGCCACCGTTACCGAAGCCCAGGAAGAACATCGTGCC。
在一个具体实施方式中所述L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶采用基因工程菌进行重组表达获得。
其中，所述反应的体系采用PH7-8，优选为PH7.5，50-150mM，优选为100mM磷酸缓冲液。优选地，所述L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸的用量比为1：1：6-10。
优选地反应条件为：反应的温度为35-40℃，优选为37℃，反应时间为24-48小时，优选为36小时。
在一个优选实施方式中，通过构建包含L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶的双酶表达载体的重组菌来获得所的L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶。由此构建双酶共表达菌可以将两个酶固定在同一个菌的细胞微环境中，更有利于高效的双酶催化体系，同时不存在因为底物和中间产物进出胞导致的酶级联反应效率降低；同时在工业应用中，只需要发酵表达一个菌即可获得两个酶，降低酶的制备成本。
进一步地，双酶表达载体的重组菌作为全细胞催化底物制备L-硒甲基硒代半胱氨酸。
在具体实施方式中，反应过程采用1M氢氧化钠溶液在线调节PH，保持PH7.5±0.1。
本发明通过采用双酶法催化底物一锅法同步消旋和选择性水解，可将底物全部转化为L-硒甲基硒代半胱氨酸，理论收率>99%；该方法可实现底物的完全转化，利于产物纯化，可获得更高手性纯度的产物，产物e.e>98%。
附图说明
图1、双酶法反应示意图。
图2、pet28a-SmAMH重组质粒图谱。
图3、重组SmAMH蛋白表达SDS-PAGE胶图。其中，从左至右依次为：1 Marker；2 细胞破碎上清；3 细胞破碎液。
图4、pet28a-DrNAAAR重组质粒图谱。
图5、重组DrNAAAR蛋白表达SDS-PAGE胶图。其中，从左至右依次为：1. Marker；2.破碎上清；3. 破碎沉淀；4. 穿刺液；5. 8% 洗杂；6. 60% 洗脱。
图6、petduet-SmAMH-DrNAAAR重组质粒图谱。
图7、SmAMH催化反应曲线。
图8、SmAMH-DrNAAAR双酶法转化曲线。
图9、SmAMH-DrNAAAR双酶共表达全细胞转化曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1.L-氨基酸酰化水解酶的蛋白、DNA序列以及重组表达菌的制备
本方法中的L-氨基酸酰化水解酶来源于茂源链霉菌（ Streptomyces  mobaraensis）SmAMH，其蛋白序列为SEQ ID NO：1所示。由通用基因公司进行基因合成，首先根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，获得其核苷酸序列（SEQ ID NO：2所示），经DNA合成仪对其进行合成基因，合成后的DNA基因序列插入到pET28a载体的NdeI和XhoI多克隆位点之间，并在N端添加His标签，得到含有His标签的重组表达质粒pet28a-SmAMH，质粒图谱见图2。
将获得重组质粒pET28a-SmAMH转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得SmAMH重组表达菌株。
2. SmAMH酶的重组表达
将SmAMH重组表达菌株在卡那霉素抗性（50ppm）的LB平板上划线，37℃培养12小时，挑取单克隆至5 mL LB培养基（试管）中，37℃旋摇（200rpm）培养6h，转接1mL作为种子液接入200 mL LB培养基（1L锥形瓶）。37℃旋摇（200rpm）培养2.5h至细胞密度OD600约为0.6，加入终浓度1 mMIPTG进行诱导，30℃旋摇（200rpm）培养过夜。
3. SmAMH粗酶制备
取所得发酵液，离心（6,000 g，15 min，4℃）收集菌体，菌体用25 mL缓冲溶液A（含50 mM 磷酸二氢钾、200 mM氯化钠和20 mM咪唑，pH=7.5）重悬，用超声破碎仪破碎后，离心（10,000 g，60 min，4℃）分离上清与沉淀，使用0.22μm滤膜过滤上清即为粗酶，采用蛋白核酸电泳检测蛋白表达情况（见图3）。
4. SmAMH粗酶拆分制备L-硒甲基硒代半胱氨酸
使用Sm-AMH粗酶催化拆分底物制备L-硒甲基硒代半胱氨酸。称取2 g消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸投入反应瓶中，粗酶液与PH7.5,100mM磷酸缓冲液按1：9混合后，向反应瓶中各加入100 mL酶溶液，开启搅拌并于37℃反应。反应转化曲线见图7。经测试，反应最终12h后停止，测得产物L-硒甲基硒代半胱氨酸浓度为41mM，转化率42%。
实施例2
1.乙酰氨基酸消旋酶的蛋白、DNA序列以及重组表达菌的制备
本方法中的乙酰氨基酸消旋酶来源于耐辐射奇异球菌( Deinococcus  radiodurans) DrNAAAR，其蛋白序列为SEQ ID NO：3所示。由通用基因公司进行基因合成，首先根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，获得其核苷酸序列（SEQ ID NO：4所示），经DNA合成仪对其进行合成基因，合成后的DNA基因序列插入到pET28a载体的NdeI和XhoI多克隆位点之间，并在N端添加His标签，得到含有His标签的重组表达质粒pet28a-DrNAAAR，质粒图谱见图4。
将获得重组质粒pet28a-DrNAAAR转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得DrNAAAR重组表达菌株。
2. DrNAAAR酶的重组表达和纯化
将DrNAAAR重组表达菌株在卡那霉素抗性（50ppm）的LB平板上划线，37℃培养12小时，挑取单克隆至5 mL LB培养基（试管）中，37℃旋摇（200rpm）培养6h，转接1mL作为种子液接入200 mL LB培养基（1L锥形瓶）。37℃旋摇（200rpm）培养2.5h至细胞密度OD600约为0.6，加入终浓度1 mMIPTG进行诱导，30℃旋摇（200rpm）培养过夜。
取所得发酵液，离心（6,000 g，15 min，4℃）收集菌体，菌体用25 mL溶液A（含50mM 磷酸二氢钾、200 mM氯化钠和20 mM咪唑，pH=7.5）重悬，用超声破碎仪破碎后，离心（10,000 g，60 min，4℃）分离上清与沉淀，使用0.22μm滤膜过滤上清即为粗酶。使用Bio-RadNGC Quest 10中高压层析系统进行纯化操作，将粗酶装载至5 mL镍柱（HisTrap HP，GEHealthcare公司），流速2.5 mL/min；之后用50 mL溶液B（含50 mM 磷酸二氢钾、200 mM氯化钠和40 mM咪唑，pH=7.5）洗去杂蛋白，流速3 mL/min；接着使用溶液C（含50 mM 磷酸二氢钾、200 mM氯化钠和200 mM咪唑，pH=7.5）将NAAAR从镍柱上洗脱，再使用10 kDa截流柱将洗脱液用溶液D（含50 mM 磷酸二氢钾，pH=7.5）置换缓冲液并浓缩后储存在-80℃冰箱备用，采用蛋白核酸电泳检测蛋白表达情况（见图5）。
3.双酶法制备L-硒甲基硒代半胱氨酸
使用Sm-AMH粗酶和DrNAAAR纯酶催化底物制备L-硒甲基硒代半胱氨酸。称取2 g消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸投入反应瓶中，Sm-AMH粗酶、DrNAAAR纯酶与PH7.5，100mM磷酸缓冲液按1：1：8混合后，向反应瓶中各加入100 mL酶溶液，开启搅拌并分别于37℃反应。反应转化曲线见图8。经测试，反应最终36h后停止，测得产物L-硒甲基硒代半胱氨酸浓度为87 mM，转化率93.6%。
实施例3
1. 双酶表达菌构建
分别设计引物，以pET28a-SmAMH、pet28a-DrNAAAR为模板克隆目的基因片段，以petDUET1载体为模板克隆载体骨架，采用无缝克隆方法将SmAMH核苷酸片段插入petDUET1的BamHI和HindIII酶切位点之间，将DrNAAAR核苷酸片段插入petDUET1的NdeI和PacI酶切位点之间，构建petDUET-SmAMH-DrNAAAR双酶共表达质粒（见图6）。
载体构建方法：
引物设计
编号 引物名称 引物序列
1 SmAMH-F TCACCACAGCCAGATGGCAGTGGATCCGCGTC
2 SmAMH-R TGCGGCCGCAAGCTTTAACACTCATCCAGAA
3 DrNAAAR-F ATGGCCCATACCGGTCGCATGTTCAAAATTGAA
4 DrNAAAR-R GCAGCCTAGGTTAGGCACGATGTTCTTCCTGG
5 载体-1-F GCCTAACCTAGGCTGCTGCCACCG
6 载体-1-R CATCTGGCTGTGGTGATGATGGTGATGGC
7 载体-2-F AAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAA
8 载体-2-R GACCGGTATGGGCCATTGTATATCTCCTTCTTATACTTA
克隆方法：
（1）扩增载体骨架
反应体系：聚合酶2× Prime StarMiX 25μl，上游引物和下游引物各2.5μl，反应模板1μl，加ddH2O 19μl。
反应程序：
。
（2）扩增目的片段
反应体系
聚合酶2× Prime StarMiX 25 μl
上游引物 2.5 μl
下游引物 2.5 μl
Template 1 μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 19 μl
程序
 。
（3）酶连接
采用2X Taq PCR master mix无缝克隆KIT，40℃，30分钟。连接体系为：载体骨架3μl，
目的片段2 μl和ddH2O 5 μl。
将获得重组质粒petDUET-SmAMH-DrNAAAR转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得SmAMH-DrNAAAR双酶共表达菌株。
2. SmAMH-DrNAAAR双酶共表达菌株的重组表达培养
将SmAMH-DrNAAAR双酶共表达菌株在氨苄青霉素抗性（50ppm）的LB平板上划线，37℃培养12小时，挑取单克隆至5 mL LB培养基（试管）中，37℃旋摇（200rpm）培养6h，转接1mL作为种子液接入1000 mL LB培养基（3L锥形瓶）。37℃旋摇（200rpm）培养2.5h至细胞密度OD600约为0.6，加入终浓度1 mMIPTG进行诱导，30℃旋摇（200rpm）培养过夜。取所得发酵液，离心（6,000 g，15 min，4℃）收集菌体，用于全细胞转化。
3. 双酶全细胞催化制备L-硒甲基硒代半胱氨酸
使用Sm-AMH-DrNAAAR双酶共表达菌全细胞催化底物制备L-硒甲基硒代半胱氨酸。称取10 g消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸投入2 L发酵反应罐中，称取10 g离心菌泥重悬于500 ml 纯化水中，向发酵罐中加入酶溶液，调节PH至7.5，开启搅拌并加热至37℃反应。反应过程采用1M氢氧化钠溶液在线调节PH，保持PH7.5±0.1。反应转化曲线见图9。经测试，反应最终24h后结束，测得产物L-硒甲基硒代半胱氨酸浓度为90mM，转化率98.9%。

Claims (10)

1.一种使用酶法合成L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法，其包括如下步骤：采用L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶两种酶作为催化酶，以消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸为底物，通过立体选择性的N-乙酰基-L-氨基酸酰化水解酶和N-乙酰基-氨基酸消旋酶两个酶的共同催化下反应，制备得到高手性纯度的L-硒甲基硒代半胱氨酸（优选地e.e>80%，>90%，>95%，或>98%）。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述L-氨基酸酰化水解酶来源于茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）SmAMH；优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；更优选地，根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，优选地其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰氨基酸消旋酶来源于耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans) DrNAAAR，优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；更优选地，根据大肠杆菌密码子偏好进行核苷酸密码子优化，优选地其核苷酸序列如SEQID NO：4所示。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶采用基因工程菌进行重组表达获得。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的体系采用PH7-8，优选为PH7.5，50-150mM，优选为100mM磷酸缓冲液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶消旋的N-乙酰基-硒甲基硒代半胱氨酸的用量比为1：1：6-10。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，反应的温度为35-40℃，优选为37℃，反应时间为24-48小时，优选为36小时。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，通过构建包含L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶的双酶表达载体的重组菌来获得所的L-氨基酸酰化水解酶和乙酰氨基酸消旋酶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，双酶表达载体的重组菌作为全细胞催化底物制备L-硒甲基硒代半胱氨酸。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，反应过程采用1M氢氧化钠溶液在线调节pH，保持pH7.5±0.1。
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