CN111363775B

CN111363775B - 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用

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Publication number: CN111363775B
Application number: CN202010191945.1A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 曹成浩; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: WO2021184883A1; WO2021184883A9; US20230111631A1; CN111363775A

Abstract

本发明公开了一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用。一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，以D,L‑草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L‑草铵膦中的D‑草铵膦催化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D‑氨基酸氧化酶、以及用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L‑草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。本发明草铵膦脱氢酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L‑草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。

Description

一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用。

背景技术

草铵膦，又名草丁膦，英文名为Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦由两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。

化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：

(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。

(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。

除了这两种传统的生物催化法，以D,L-草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L-草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L-草铵膦为原料，简单易得，成本较低，较好对接现有草铵膦工业生产体系。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种草铵膦脱氢酶突变体，具有较高的催化活性，并将其应用在一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法。

一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，

所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。草铵膦脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，基因序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。D-氨基酸氧化酶的基因序列如SEQ ID No.10所示。

所述酶催化体系还包括用于去除副产物过氧化氢的过氧化氢酶。副产物过氧化氢的积累会对生物催化剂有毒害作用。过氧化氢酶来源于Parageobacillus，过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，基因序列如SEQ ID No.8所示。

所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：

(1)甲酸脱氢酶辅酶循环系统：包括甲酸脱氢酶，甲酸盐和辅酶；

(2)葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统：包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和辅酶；

(3)乙醇脱氢酶辅酶循环系统：包括乙醇脱氢酶，异丙醇和辅酶。

上述各脱氢酶辅酶循环系统中使用的辅酶为NADPH与NADP之间的循环再生，或者为NADH与NAD之间的循环再生。由于反应过程中辅酶是循环再生的，所以初始添加时，可以添加NADPH/NADH或者NADP/NAD中的一类，或者两类都添加。

所述甲酸脱氢酶来源于乳杆菌属Lactobacillus buchneri，氨基酸序列如SEQ IDNo.13所示；所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌属Exiguobacterium sibiricum，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述乙醇脱氢酶来源于乳杆菌属Lactobacillus brevis，氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。

本申请生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，各种酶添加到反应体系中时，可以使用基因工程菌表达后的粗酶，也可以使用纯化后的酶，或者也可以直接向反应体系中加入表达各种酶的基因工程菌表达产生各酶，各酶可以是使用能够单独表达一种酶的多种基因工程菌，也可以将各酶的基因克隆到同一种基因工程菌中，使用能够表达多种酶的一种基因工程菌。

本发明又提供了一种草铵膦脱氢酶突变体，由野生菌Thiopseudomonasdenitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S。

本发明又提供了编码所述草铵膦脱氢酶突变体的基因，核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明又提供了包含所述基因的基因工程菌。

本发明还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体、所述基因或所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明草铵膦脱氢酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。

(2)本发明以外消旋D,L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶、去过氧化氢系统、草铵膦脱氢酶突变体和辅酶循环系统将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸又可以被继续催化还原为L-草铵膦，进而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化。

(3)本发明能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。

附图说明

图1去消旋合成L-草铵膦的反应式(葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统)。

图2去消旋合成L-草铵膦的反应式(甲酸脱氢酶辅酶循环系统)。

图3去消旋合成L-草铵膦的反应式(乙醇脱氢酶辅酶循环系统)。

具体实施方式

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；一步克隆试剂盒购自诺唯赞有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-24a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)为实验室合成；D,L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

本发明通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对PPO进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/30℃；流速/1mL/min；检测波长/205nm；流动相：50mM(NH₄)₂HPO₄，加入1％的10％的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调pH至3.8，加入12％的乙腈。

通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量，手性HPLC分析方法为：色谱柱/Pntulips QS-C18；流动相/50mM乙酸铵溶液：甲醇＝9∶1；检测波长/338nm；流速/1mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12gN-乙酰-L-半胱氨酸，用10ml乙醇助溶，在加入40ml 0.1M硼酸缓冲液(pH)9.8。振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过3天)。衍生化反应与测定：取200μL样品加入400μL衍生化试剂，混匀至30℃保温5min，加入400μL超纯水混合，进样10μL进行分析。

实施例1

一、工程菌菌体的培养

将工程菌经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。

二、粗酶液的制备

将培养结束后收集的菌体用pH 8的磷酸盐缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液)洗涤两次，之后，将菌体加入pH＝8的磷酸盐缓冲液(50mM)重悬细胞，在超声破碎30次，破碎条件：功率为400W，破碎2s，间歇5s。将此细胞破碎液于4℃8000rpm离心10min，去除沉淀，得到的上清即为重组草铵膦脱氢酶的粗酶液。

三、草铵膦脱氢酶的纯化

将粗酶液与经上样缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含500mM NaCl、20mM咪唑)平衡过的Ni亲和层析树脂结合后，再用冲洗缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含50mM咪唑、500mM NaCl)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含200mM咪唑、500mM NaCl)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液)透析24h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.7mg/mL，将酶液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃，即获得重组草铵膦脱氢酶纯酶。

草铵膦脱氢酶突变体、其他酶和共表达菌株也按上述方法制备。

实施例2

草铵膦脱氢酶及其突变体比酶活的测定。

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.4条件下，每分钟每生成1μmol的L-草铵膦所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：100mM 2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸，10mM NADPH，适量酶液，30℃、pH 7.4，600转/分钟条件下反应10分钟，样品处理并进行HPLC检测分析。蛋白浓度用BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。

实施例3

草铵膦脱氢酶突变体文库的构建及筛选。

一、基因工程菌的构建

将来源于混养反硝化硫细菌(Thiopseudomonas denitrificans)的草铵膦脱氢酶(GenBank号：WP_101496154)的基因序列经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pETduet-1上，构建得到质粒pETduet-1-GluDH。重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，用于后续重组草铵膦脱氢酶的表达。密码子优化后的草铵膦脱氢酶基因序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

二、草铵膦脱氢酶突变体库的构建

第一步通过易错PCR的方法构建草铵膦脱氢酶突变文库，将来源于混养反硝化硫细菌(Thiopseudomonas denitrificans)的草铵膦脱氢酶的质粒为模版，利用T7 promoter和T7terminator为引物(表1)进行PCR扩增，随机引入突变。PCR反应体系(50μL)：模版0.5～20ng，1×Taq Buffer(不含Mg²⁺)，0.2mM dNTP，0.3mM MnCl₂，2mM MgCl₂，引物T7promoter与T7 terminator各0.2μM，Taq DNA聚合酶5U。PCR条件(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性50s；(3)55℃退火60s；(4)72℃延伸120s，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物经内切酶DpnI 37℃消化3h后经过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收。将回收的PCR产物通过T4连接酶连接到pET-28b(+)载体，酶切位点为XbaI和XhoI。连接后的产物转化导入E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。

挑取单菌落至96深孔板中培养，每个孔板加入1000μL LB液体培养基(含有终浓度50μg/mL卡那霉素，终浓度1mM IPTG)，37℃培养18h。将96深孔板的菌体离心30min(3000rpm，4℃)，弃上清后，用1.5mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(200mM，pH 7.0)重悬菌体。取出500μL菌悬液于新的96深孔板中，各孔中加入底物反应液，反应体系为PPO100mM,辅酶NADPH 1mM,通过酶标仪进行筛选，初筛方法衍生化方法(Process Biochemistry.2019,76,136-141)，筛选试剂为：邻苯二甲醛0.013g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8的硼酸缓冲液溶解定容到50mL，将筛选试剂与反应液1:1混合，反应30s，在发射波长340nm，激发波长455nm下筛选荧光值高于原始菌株的菌株。将筛选得到的突变株用手性HPLC分析方法检查草铵膦，并送测序，验证得到突变株pETduet-1-GluDHV377S，比酶活为84.69U/mg，而草铵膦脱氢酶野生型比酶活为0.78U/mg。

突变株V377S的草铵膦脱氢酶突变体基因序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

表1引物设计表

引物名称	引物序列(5’to 3’)
		T7 promoter	TAATACGACTCACTATAGGG
T7 terminator	TGCTAGTTATTGCTCAGCGG

实施例4

多种基因工程菌的构建。

一、过氧化氢酶基因工程菌的构建

将一株来源于Parageobacillus，注释为过氧化氢酶(CAT)的序列，经过密码子优化后进行全基因合成，表达质粒为pET-28b。插入序列得到pET28b-CAT(氨基酸序列为SEQID NO.7所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。

二、D氨基酸氧化酶基因工程菌的构建

氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。将来源于红酵母(Rhodotorula taiwanensis)的D氨基酸氧化酶经点突变获得重组D氨基酸氧化酶突变株(DAAO-M213S-N54V-F58E-D207A-S60T)，经过密码子优化后进行全基因合成，构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAAO-M213S-N54V-F58E-D207A-S60T，突变株氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，突变株核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示。

三、葡萄糖脱氢酶基因工程菌的构建

将一株来源于微小杆菌属(Exiguobacterium sibiricum)重组葡萄糖脱氢酶菌株(GDH)，经过密码子优化后进行全基因合成，构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-GDH，氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示。

四、甲酸脱氢酶基因工程菌的构建

将一株来源于Lactobacillus buchneri的甲酸脱氢酶(FDH)，经过密码子优化后进行全基因合成，表达质粒为pET-28b，构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-FDH，氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示。

五、乙醇脱氢酶基因工程菌的构建

将一株来源于Lactobacillus brevis的乙醇脱氢酶(ADH)，经过密码子优化后进行全基因合成，表达质粒为pET-28b，构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-ADH，氨基酸序列为SEQ ID NO.15所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.16所示。

实施例5

共表达菌株的构建。

一、含去过氧化氢系统的共表达菌株构建

将DAAO-M213S-N54V-F58E-D207A-S60T突变株通过一步克隆试剂盒连接到多克隆位点载体pCDFduet-1上，酶切位点为NcoI和HindⅢ，一步克隆引物为C1-F和C1-R(表2)，构建得到质粒pCDFduet-1-DAAO。再在pCDFduet-1-DAAO质粒的基础上，通过一步克隆试剂盒将CAT连接到多克隆位点载体pCDFduet-1第二个克隆位点上，酶切位点为NdeI和XhoI，一步克隆引物为C2-F和C2-R，构建得到质粒pCDFduet-1-DAAO-CAT，构建得到共表达菌株E.coliBL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT。

二、含葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统的共表达菌株构建

在载体pETduet-1-GluDHV377S上，通过一步克隆试剂盒连接到多克隆位点载体pETduet-1第二个克隆位点上，酶切位点为NdeI和XhoI，一步克隆引物为C3-F和C3-R，构建得到质粒pETduet-1-GluDHV377S-GDH，构建得到共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-GDH。

三、含甲酸脱氢酶辅酶循环系统的共表达菌株构建

在载体pETduet-1-GluDHV377S上，通过一步克隆试剂盒连接到多克隆位点载体pETduet-1第二个克隆位点上，酶切位点为NdeI和XhoI，一步克隆引物为C4-F和C4-R，构建得到质粒pETduet-1-GluDHV377S-FDH，构建得到共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-FDH。

四、乙醇脱氢酶辅酶循环系统共表达菌株的构建

在载体pETduet-1-GluDHV377S上，通过一步克隆试剂盒连接到多克隆位点载体pETduet-1第二个克隆位点上，酶切位点为NdeI和XhoI，一步克隆引物为C5-F和C5-R，构建得到质粒pETduet-1-GluDHV377S-ADH，构建得到共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-ADH。

表2共表达菌株的构建引物设计

五、草铵膦去消旋共表达菌株的构建(含乙醇脱氢酶辅酶循环系统)

将之前构建的质粒pCDFduet-1-DAAO-CAT和pETduet-1-GluDHV377S-ADH导入E.coli BL21(DE3)，构建得到双质粒去消旋共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT，pETdue-1-GluDHV377S-ADH。

六、草铵膦去消旋共表达菌株的构建(含甲酸脱氢酶辅酶循环系统)

将之前构建的模块1的质粒pCDFduet-1-DAAO-CAT中的DAAO-CAT片段(M1)，通过一步克隆试剂盒连接到其他多克隆位点载体pETduet-1、pACYCduet-1和pRSFduet-1上，一步克隆引物为PDC-F和PDC-R，得到质粒pET_M1、pACYC_M1和pRSF_M1(表3)。

将之前构建的模块2的质粒pETduet-1-GluDHV377S-FDH中的GluDH-FDH片段(M2)，通过一步克隆试剂盒连接到其他多克隆位点载体pETduet-1、pACYCduet-1和pRSFduet-1上，一步克隆引物分别为PPF-F和PPF-R，得到质粒pET_M2、pACYC_M2和pRSF_M2(表3)。

将两个模块的质粒导入到E.coli BL21(DE3)中，得到12株草铵膦去消旋共表达菌株(表3)。

表3草铵膦去消旋共表达菌株(含甲酸脱氢酶辅酶循环系统)

实施例6

双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含葡萄糖脱氢酶GDH辅酶循环体系)。

按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶CAT的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT。按照实施例4的方法培养能够表达草铵膦脱氢酶GluDHV377S和葡萄糖脱氢酶GDH的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-GDH，离心收集菌体细胞。

在1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、消泡剂、20g/L E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT菌体，通入空气，通气量2L/min，反应14小时，再加入20g/L E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-GDH菌体和250mM葡萄糖，氨水控制pH为8，反应15小时，液相检测D-PPT为0mM，D-PPT转化率为99.9％，PPO为2mM，L-PPT为398mM，产品草铵膦的ee值为99.9％。

实施例7

双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含甲酸脱氢酶FDH辅酶循环体系)。

按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶CAT的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT。按照实施例4的方法培养能够表达草铵膦脱氢酶GluDHV377S和甲酸脱氢酶FDH的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-FDH，离心收集菌体细胞。

在1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、消泡剂和20g/L E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT菌体、20g/L E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-FDH菌体、NADP⁺0.05mM和250mM甲酸铵，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，反应30小时，液相检测D-PPT为0mM，D-PPT转化率为99.9％，PPO为8mM，L-PPT为392mM，产品草铵膦的ee值为99.9％。

实施例8

双菌多酶去消旋制备L-草铵膦(乙醇脱氢酶ADH辅酶循环体系)。

按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶CAT的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT。按照实施例4的方法培养能够表达草铵膦脱氢酶GluDHV377S和乙醇脱氢酶ADH的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-1-GluDHV377S-ADH，离心收集菌体细胞。

在1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、20g/L D-氨基酸氧化酶菌体、20g/L过氧化氢酶CAT菌体、5g/L草铵膦脱氢酶pETduet-1-GluDHV377S菌体、40g/L乙醇脱氢酶ADH菌体、NADP⁺0.05mM和250mM异丙醇，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，反应30小时，液相检测D-PPT为0mM，D-PPT转化率为99.9％，PPO为15mM，L-PPT为385mM，产品草铵膦的ee值为99.9％。

实施例9

单菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含乙醇脱氢酶ADH辅酶循环体系)。

按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶、过氧化氢酶CAT、草铵膦脱氢酶GluDHV377S和乙醇脱氢酶ADH的共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT-pETduet-1-GluDHV377S-ADH，离心收集菌体细胞。

在1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、40g/L共表达基因工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFduet-1-DAAO-CAT-pETduet-1-GluDHV377S-ADH和250mM异丙醇，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，反应30小时，液相检测D-PPT为0mM，D-PPT转化率为99.9％，PPO为20mM，L-PPT为380mM，产品草铵膦的ee值为99.9％。

实施例10

单菌多酶去消旋制备L-草铵膦(含甲酸脱氢酶FDH辅酶循环体系)。

按照实施例3的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶、过氧化氢酶CAT、草铵膦脱氢酶GluDHV377S和甲酸脱氢酶FDH的12个共表达菌株E.coli(SA)、E.coli(SC)、E.coli(SK)、E.coli(AS)、E.coli(AC)、E.coli(AK)、E.coli(CS)、E.coli(CA)、E.coli(CK)、E.coli(KS)、E.coli(KA)和E.coli(KC)，离心收集菌体细胞。

在12组1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、NADP⁺0.05mM和250mM甲酸铵，分别加入12个共表达菌株E.coli(SA)、E.coli(SC)、E.coli(SK)、E.coli(AS)、E.coli(AC)、E.coli(AK)、E.coli(CS)、E.coli(CA)、E.coli(CK)、E.coli(KS)、E.coli(KA)和E.coli(KC)，通入空气，通气量2L/min，氨水控制pH为8，反应30小时，液相检测12个反应D-PPT均为0mM，D-PPT转化率为99.9％，E.coli(KA)催化的反映中L-PPT含量最高，为395mM，产品草铵膦的ee值为99.9％。

实施例11

L-草铵膦的分离提取

氢型001x7阳离子树脂的预处理：(1)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；(2)用2M氢氧化钠水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；(3)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV；(4)用2M盐酸水溶液洗柱，流速为0.5BV/h，洗2BV；(5)用去离子水洗柱，流速为1.0BV/h，洗2BV。

将实施例11-18中反应液离心去除菌体，上清液用盐酸调pH至2抽滤，滤液上样至已经预处理好的氢型001x7阳离子树脂，柱体积为120mL，离子交换柱柱高比15:1，上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集含有L-草铵膦的洗脱液。将洗脱液在60℃，真空度0.075～0.085MPa下，减压浓缩结晶得到纯度为98％的L-草铵膦。

对比例1

按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶突变株、过氧化氢酶CAT、未突变草铵膦脱氢酶的基因工程菌和乙醇脱氢酶ADH的基因工程菌，离心收集菌体细胞。

在1L反应器中，加入600mL pH＝8的磷酸盐缓冲液，温度30℃，含有400mM D,L-PPT、消泡剂、20g/L D-氨基酸氧化酶菌体和20g/L过氧化氢酶CAT菌体，通入空气，通气量2L/min，反应14小时，再加入5g/L草铵膦脱氢酶pETduet-1-GluDH菌体、20g/L葡萄糖脱氢酶GDH菌体和250mM葡萄糖，氨水控制pH为8，反应20小时，液相检测D-PPT为0mM，PPO为350mM,L-PPT为50mM。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcctatt cattggacag cttcctgcag catatcaaac agcgcgatcc agaacagcct 60

gaattccacc aagcagtcga ggaagtactt cgtactttgt ggcccttcct gcaagaaaat 120

ccaaagtatg tgcagaatgg tatcatcgag cgcatggtag aaccagaacg cgttatcctt 180

ttccgtgtcc cttgggtaga tgacgccgga cgtgtacacg taaatcgcgg ataccgtatt 240

cagatgagta gcgcaattgg gccttacaag ggaggaatcc gcttccaccc ttccgtcaac 300

ttaggtgtcc ttaagttttt ggcttttgaa caagttttca agaattctct gacgagtctg 360

ccgatgggcg gggggaaagg cggagcggac tttgacccga aaggaaagtc agagcaggaa 420

gtaatgcgtt tttgccagtc ctttatgaac gagctttatc gccacattgg ccaacacttg 480

gatgtgcccg caggcgacat tggtgtgggg gcgcgtgaag ttggttatat gttcggacaa 540

tataagcgtc ttgccaacga gttcacttca gtcttcactg ggaaagggat gacgtatggt 600

gggtcactga ttcgtccgga ggctaccgga tatggttgcg tttattttgc cgagcagatg 660

cttaagtcca tcaaacgccg ttttgaggga cagcgcgtcg ccatctccgg gtctggcaac 720

gtcgctcagt acgccgccca aaaagtcacc gagcttggcg gtaaagttgt ctcactttca 780

gattcggggg gaacgctgta catgccagaa ggtttgaatg gggaacattg ggcgtatttg 840

atggatctta agaccgttcg tcgcgggcgc attgaagaga tggcgcgcga gttcggtgcc 900

cagttcttcc ctgggcaacg tccttggcat ctggagtgcg atatcgctat gccgtgtgcg 960

acccaaaatg aactgaatgg ggatgacgct cgccagttga ttaaaaatgg ttgcgtatgc 1020

gttgccgagg gagccaatat gccttccacc cttgaggcca ttgatttgtt ccaagaagcg 1080

ggcatcttgt ttgcgccagg gaaagcgtct aatgcgggtg gtgtcgcagt atcagggtta 1140

gagatgacgc aaaatgcaat gcgcctttta tggacagatg gggaggtaga cgccaagctt 1200

cactcgatta tgcaagggat tcacgcatca tgtgttaatt atggtacaga aaatggaaaa 1260

gtcaattatg tcaagggagc taatatcgct gggtttgtaa aggtcgccga cgcgatgctt 1320

gcgcagggaa tcgtc 1335

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 混养反硝化硫细菌(Thiopseudomonas denitrificans)

<400> 2

Met Ser Tyr Ser Leu Asp Ser Phe Leu Gln His Ile Lys Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Glu Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Gln Glu Asn Pro Lys Tyr Val Gln Asn Gly Ile

35 40 45

Ile Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Leu Phe Arg Val Pro

50 55 60

Trp Val Asp Asp Ala Gly Arg Val His Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ala Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu Gln Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Phe Met Asn Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Gln His Leu

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Val Gly Tyr

165 170 175

Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Thr Ser Val Phe

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Gln Met Leu Lys Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Arg Phe Glu Gly Gln Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Thr Glu Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Val Ser Leu Ser Asp Ser Gly Gly Thr Leu Tyr Met Pro Glu Gly Leu

260 265 270

Asn Gly Glu His Trp Ala Tyr Leu Met Asp Leu Lys Thr Val Arg Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Glu Glu Met Ala Arg Glu Phe Gly Ala Gln Phe Phe Pro

290 295 300

Gly Gln Arg Pro Trp His Leu Glu Cys Asp Ile Ala Met Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Asp Asp Ala Arg Gln Leu Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Cys Val Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Ile Asp Leu Phe Gln Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Asp Gly Glu Val Asp Ala Lys Leu

385 390 395 400

His Ser Ile Met Gln Gly Ile His Ala Ser Cys Val Asn Tyr Gly Thr

405 410 415

Glu Asn Gly Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Ile Val

435 440 445

<210> 3

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcctatt cattggacag cttcctgcag catatcaaac agcgcgatcc agaacagcct 60

gaattccacc aagcagtcga ggaagtactt cgtactttgt ggcccttcct gcaagaaaat 120

ccaaagtatg tgcagaatgg tatcatcgag cgcatggtag aaccagaacg cgttatcctt 180

ttccgtgtcc cttgggtaga tgacgccgga cgtgtacacg taaatcgcgg ataccgtatt 240

cagatgagta gcgcaattgg gccttacaag ggaggaatcc gcttccaccc ttccgtcaac 300

ttaggtgtcc ttaagttttt ggcttttgaa caagttttca agaattctct gacgagtctg 360

ccgatgggcg gggggaaagg cggagcggac tttgacccga aaggaaagtc agagcaggaa 420

gtaatgcgtt tttgccagtc ctttatgaac gagctttatc gccacattgg ccaacacttg 480

gatgtgcccg caggcgacat tggtgtgggg gcgcgtgaag ttggttatat gttcggacaa 540

tataagcgtc ttgccaacga gttcacttca gtcttcactg ggaaagggat gacgtatggt 600

gggtcactga ttcgtccgga ggctaccgga tatggttgcg tttattttgc cgagcagatg 660

cttaagtcca tcaaacgccg ttttgaggga cagcgcgtcg ccatctccgg gtctggcaac 720

gtcgctcagt acgccgccca aaaagtcacc gagcttggcg gtaaagttgt ctcactttca 780

gattcggggg gaacgctgta catgccagaa ggtttgaatg gggaacattg ggcgtatttg 840

atggatctta agaccgttcg tcgcgggcgc attgaagaga tggcgcgcga gttcggtgcc 900

cagttcttcc ctgggcaacg tccttggcat ctggagtgcg atatcgctat gccgtgtgcg 960

acccaaaatg aactgaatgg ggatgacgct cgccagttga ttaaaaatgg ttgcgtatgc 1020

gttgccgagg gagccaatat gccttccacc cttgaggcca ttgatttgtt ccaagaagcg 1080

ggcatcttgt ttgcgccagg gaaagcgtct aatgcgggtg gtgtcgcatc ctcagggtta 1140

gagatgacgc aaaatgcaat gcgcctttta tggacagatg gggaggtaga cgccaagctt 1200

cactcgatta tgcaagggat tcacgcatca tgtgttaatt atggtacaga aaatggaaaa 1260

gtcaattatg tcaagggagc taatatcgct gggtttgtaa aggtcgccga cgcgatgctt 1320

gcgcagggaa tcgtc 1335

<210> 4

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Tyr Ser Leu Asp Ser Phe Leu Gln His Ile Lys Gln Arg Asp

1 5 10 15

Pro Glu Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Thr

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Gln Glu Asn Pro Lys Tyr Val Gln Asn Gly Ile

35 40 45

Ile Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Leu Phe Arg Val Pro

50 55 60

Trp Val Asp Asp Ala Gly Arg Val His Val Asn Arg Gly Tyr Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ala Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu Gln Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Phe Met Asn Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Gln His Leu

145 150 155 160

Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Val Gly Tyr

165 170 175

Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Glu Phe Thr Ser Val Phe

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Met Thr Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Gln Met Leu Lys Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Arg Phe Glu Gly Gln Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Lys Val Thr Glu Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Val Ser Leu Ser Asp Ser Gly Gly Thr Leu Tyr Met Pro Glu Gly Leu

260 265 270

Asn Gly Glu His Trp Ala Tyr Leu Met Asp Leu Lys Thr Val Arg Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Glu Glu Met Ala Arg Glu Phe Gly Ala Gln Phe Phe Pro

290 295 300

Gly Gln Arg Pro Trp His Leu Glu Cys Asp Ile Ala Met Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Asp Asp Ala Arg Gln Leu Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Cys Val Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Ile Asp Leu Phe Gln Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Ser Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Asp Gly Glu Val Asp Ala Lys Leu

385 390 395 400

His Ser Ile Met Gln Gly Ile His Ala Ser Cys Val Asn Tyr Gly Thr

405 410 415

Glu Asn Gly Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Ile Val

435 440 445

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctagttat tgctcagcgg 20

<210> 7

<211> 490

<212> PRT

<213> 乳杆菌(Parageobacillus)

<400> 7

Met Gly Met Ala Asp Thr Lys Lys Leu Thr Thr Ser Trp Gly Ala Pro

1 5 10 15

Val Gly Asp Asn Gln Asn Ser Ile Thr Ala Gly Asn Pro Gly Pro Thr

20 25 30

Leu Ile Gln Asp Val His Leu Ile Glu Lys Leu Ala His Phe Asn Arg

35 40 45

Glu Arg Val Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly Ala His

50 55 60

Gly Tyr Phe Glu Val Thr Asn Asp Met Ser Lys Tyr Thr Lys Ala Lys

65 70 75 80

Val Phe Asn Gly Val Gly Lys Arg Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser

85 90 95

Thr Val Ala Gly Glu Leu Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Pro Arg

100 105 110

Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val

115 120 125

Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Ala Ile Lys Phe Pro

130 135 140

Asp Phe Ile His Thr Gln Lys Arg Asp Pro Arg Thr His Leu Lys Asn

145 150 155 160

Pro Thr Ala Met Trp Asp Phe Trp Ser Leu Ser Pro Glu Ser Leu His

165 170 175

Gln Val Thr Tyr Leu Phe Gly Asp Arg Gly Ile Pro Leu Thr Tyr Arg

180 185 190

His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Trp Val Asn Glu Lys

195 200 205

Gly Glu Ala Val Trp Val Lys Tyr His Phe Lys Thr Asn Gln Gly Val

210 215 220

Lys Asn Met Asp Pro Glu Leu Ala Val Lys Ile Ala Gly Glu Asn Pro

225 230 235 240

Asp Tyr His Thr Glu Asp Leu Tyr Asn Ala Ile Glu Lys Gly Asp Tyr

245 250 255

Pro Ser Trp Thr Leu Tyr Val Gln Ile Met Pro Leu Glu Asp Ala Lys

260 265 270

Thr Tyr Arg Phe Asn Pro Phe Asp Val Thr Lys Val Trp Ser His Lys

275 280 285

Asp Tyr Pro Leu Ile Glu Val Gly Arg Met Val Leu Asn Arg Asn Pro

290 295 300

Glu Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Ala Thr Phe Ser Pro Gly Asn

305 310 315 320

Leu Val Pro Gly Val Glu Pro Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln Ala Arg

325 330 335

Leu Phe Ala Tyr Ala Asp Ala His Arg Tyr Arg Val Gly Val Asn His

340 345 350

Asn Leu Leu Pro Ile Asn Arg Pro Arg Val Glu Val Asn Asn Tyr Gln

355 360 365

Arg Asp Gly Phe Met Arg Phe Asp Asn Asn Gly Gly Gly Ser Val Asn

370 375 380

Tyr Glu Pro Asn Ser Phe Gly Gly Pro Thr Glu Val Ser Glu His Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Phe Pro Val Ser Gly Met Ala Glu Ser Val Pro Tyr Asp

405 410 415

Asp Asp Asp His Tyr Thr Gln Ala Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Met Ser

420 425 430

Glu Glu Glu Lys Ala Arg Leu Val Lys Asn Ile Val Glu Ser Leu Lys

435 440 445

Gln Val Thr Lys Glu Glu Ile Lys Leu Arg Gln Ile Arg His Phe Tyr

450 455 460

Lys Ala Asp Pro Asp Tyr Gly Arg Arg Val Ala Glu Gly Leu Gly Leu

465 470 475 480

Gln Val Pro Asp Asp Val Ile Thr Asn Ala

485 490

<210> 8

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggcatgg cggacaccaa gaaactgacc accagctggg gcgcgccggt gggtgataac 60

cagaacagca ttaccgcggg taacccgggt ccgaccctga tccaagacgt gcacctgatt 120

gagaaactgg cgcacttcaa ccgtgaacgt gttccggaac gtgttgttca tgcgaagggt 180

gcgggtgcgc acggttactt cgaagtgacc aacgatatga gcaaatatac caaggcgaaa 240

gtgtttaacg gcgttggcaa gcgtaccccg gtgttcgttc gttttagcac cgttgcgggt 300

gaactgggta gcgcggacac cgtgcgtgat ccgcgtggtt tcgcggttaa attttacacc 360

gaggaaggca actatgacat cgttggtaac aacaccccga tcttctttat tcgtgacgcg 420

atcaagttcc cggattttat tcacacccag aaacgtgacc cgcgtaccca cctgaagaac 480

ccgaccgcga tgtgggattt ctggagcctg agcccggaaa gcctgcacca agtgacctac 540

ctgtttggcg accgtggtat cccgctgacc taccgtcaca tgaacggcta tggtagccac 600

accttcaaat gggttaacga aaagggcgag gcggtgtggg ttaagtatca ctttaaaacc 660

aaccagggtg tgaaaaacat ggatccggag ctggcggtta agattgcggg cgaaaacccg 720

gactaccaca ccgaggatct gtataacgcg atcgaaaagg gtgactaccc gagctggacc 780

ctgtatgtgc aaattatgcc gctggaagat gcgaagacct accgtttcaa cccgtttgac 840

gtgaccaaag tttggagcca caaggattat ccgctgatcg aagtgggccg tatggttctg 900

aaccgtaacc cggaaaacta cttcgcggaa gttgagcagg cgacctttag cccgggtaac 960

ctggtgccgg gtgttgagcc gagcccggac aaaatgctgc aagcgcgtct gttcgcgtac 1020

gcggatgcgc accgttatcg tgtgggtgtt aaccacaacc tgctgccgat taaccgtccg 1080

cgtgttgagg tgaacaacta ccagcgtgac ggcttcatgc gttttgataa caacggtggc 1140

ggtagcgtga actatgaacc gaacagcttc ggcggtccga ccgaagttag cgagcacaaa 1200

accaccccgt ttccggttag cggtatggcg gaaagcgttc cgtacgacga tgacgatcac 1260

tatacccaag cgggcgacct gtaccgtctg atgagcgagg aagagaaagc gcgtctggtg 1320

aagaacatcg ttgagagcct gaagcaggtg accaaagaag agatcaagct gcgtcaaatt 1380

cgtcactttt acaaggcgga cccggattat ggtcgtcgtg ttgcggaagg tctgggtctg 1440

caggtgccgg acgatgttat taccaacgcg taa 1473

<210> 9

<211> 372

<212> PRT

<213> 红酵母(Rhodotorula taiwanensis)

<400> 9

Met Ala Pro Ser Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Val Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Gln Lys Gly Tyr Ser Val His Val

20 25 30

Val Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Thr Val Ala Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Val Trp Thr Pro Glu Met Thr Lys Glu Asp Gly

50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Thr Ala Thr Phe Asn Gln Trp Val Asp

65 70 75 80

Leu Val Pro Gln Gly Leu Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Tyr

85 90 95

Ala Gln Asp Glu Ala Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Gln His Ile Thr

100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Lys Leu Glu Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val Asn Ala Pro Lys Phe Cys Gln

130 135 140

Tyr Leu Gln Arg Glu Ala Gln Lys Leu Gly Val Thr Phe Glu Arg Arg

145 150 155 160

Leu Val Thr Ser Leu Glu Gln Ile Glu Gly Gly Phe Asp Leu Ile Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Val Glu Asp Gln

180 185 190

Glu Val Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Ala Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Asn Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Leu Val

225 230 235 240

Gly Asn Tyr Asp Leu Ser Val Asp Pro Pro Thr Ile Asn Arg Ile Leu

245 250 255

Gln His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Thr Asp Gly Thr Leu

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Ile Val Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Val Glu Arg Val Ala Phe Pro Leu Glu

290 295 300

Arg Gly Lys Ser Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ala Arg Ala Asp Ser Ser

305 310 315 320

Lys Pro Arg Arg Glu Val Pro Val Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser

325 330 335

Ala Gly Tyr Gln Gln Gly Trp Gly Ala Ala Leu Glu Val Ala Glu Leu

340 345 350

Val Glu Gly Ala Ile Gly Ala Ala Pro Ala Arg Ser Ser His Arg Trp

355 360 365

Leu Ser Lys Leu

370

<210> 10

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggcgccga gcaagcgtgt ggttgtgctg ggtagcggcg ttgttggtct gagcagcgcg 60

ctgaccctgg cgcagaaagg ctacagcgtt cacgttgtgg cgcgtgacct gccggaagat 120

accgttgcgc aaacctttgc gagcccgtgg gcgggtgcgg tttggacccc ggaaatgacc 180

aaggaagacg gtccgcgtca ggcgaaatgg gagaccgcga cctttaacca gtgggttgat 240

ctggtgccgc aaggtctggc gatgtggctg aagggcaccc gtcgttatgc gcaagatgag 300

gcgggtctgc tgggtcactg gtaccaacac atcaccccga actatcgtaa actggagagc 360

agcgaatgcc cgccgggtgc gattggtgtt acctacgata ccctgagcgt gaacgcgccg 420

aagttctgcc agtatctgca acgtgaagcg cagaaactgg gtgttacctt tgagcgtcgt 480

ctggtgacca gcctggagca aatcgaaggt ggcttcgacc tgattgttaa cgcgaccggt 540

ctgggtgcga agagcattgc gggtgttgaa gaccaggaag tggaaccgat tcgtggccaa 600

accgttctgg tgaagagcgc ttgcaaacgt tgcacctctg acagcagcga tccgaacagc 660

ccggcgtaca tcattccgcg tccgggtggc gaggtgatct gcggtggcac ctacctggtt 720

ggtaactatg acctgagcgt ggatccgccg accatcaacc gtattctgca gcactgcctg 780

cgtctggacc cgagcattag caccgatggt accctggagg gcatcgaaat tgttcgtcat 840

aacgttggcc tgcgtccggc gcgtcgtggt ggcccgcgtg ttgaggtgga acgtgttgcg 900

tttccgctgg aacgtggcaa gagcaaactg agcctgggta ccgcgcgtgc ggatagcagc 960

aaaccgcgtc gtgaggtgcc ggttgtgcac gcgtacggtt tcagcagcgc gggttatcaa 1020

cagggttggg gcgcggcgct ggaagtggcg gaactggtgg agggtgcgat tggtgcggcg 1080

ccggcgcgta gcagccaccg ttggctgagc aaactg 1116

<210> 11

<211> 262

<212> PRT

<213> 西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 11

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 12

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 13

<211> 398

<212> PRT

<213> 布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)

<400> 13

Met Thr Lys Val Leu Ala Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Phe

1 5 10 15

Pro Pro Lys Tyr Val Arg Asp Asp Ile Pro Lys Ile Thr His Tyr Pro

20 25 30

Asp Gly Ser Thr Val Pro Thr Pro Glu Gly Ile Asp Phe Lys Pro Gly

35 40 45

Glu Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Gly Leu Gly Leu Lys Lys Tyr Leu

50 55 60

Glu Ser Lys Gly Val Glu Phe Val Val Thr Ser Asp Lys Glu Gly Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Phe Glu Lys Glu Leu Pro Thr Ala Asp Val Val Ile Ser

85 90 95

Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Asp Leu Ile Asp Lys Ala

100 105 110

Lys Lys Leu Lys Leu Ala Ile Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val

115 120 125

Asp Leu Asn Ala Ala Asn Glu His Asn Ile Thr Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Tyr Ser Asn Ser Val Ser Val Ala Glu Ala Glu Val Met Gln Leu Leu

145 150 155 160

Ala Leu Val Arg Asn Phe Ile Pro Ala His Asp Ile Val Lys Ala Gly

165 170 175

Gly Trp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ser Arg Ala Tyr Asp Leu Glu Gly

180 185 190

Met Thr Val Gly Val Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly Arg Ala Val Leu

195 200 205

Glu Arg Leu Lys Pro Phe Gly Val Lys Leu Val Tyr Asn Gln Arg His

210 215 220

Gln Leu Pro Asp Glu Val Glu Asn Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Phe Pro

225 230 235 240

Asp Val His Glu Met Val Lys Val Val Asp Ala Val Val Leu Ala Ala

245 250 255

Pro Leu His Ala Gln Thr Tyr His Leu Phe Asn Asp Glu Val Leu Ala

260 265 270

Thr Met Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Asn Ser Arg Gly Glu Glu

275 280 285

Val Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Leu Asn Ser Gly Gln Ile Gly

290 295 300

Gly Tyr Ser Gly Asp Val Trp Tyr Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His

305 310 315 320

Pro Trp Arg Thr Met Pro Asn Glu Ala Met Thr Pro His Met Ser Gly

325 330 335

Thr Thr Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Ala Arg Glu Ile

340 345 350

Leu Glu Asp Phe Leu Glu Asp Lys Pro Ile Arg Pro Glu Tyr Leu Ile

355 360 365

Ala Gln Gly Gly Ser Leu Ala Gly Thr Gly Ala Lys Ser Tyr Thr Val

370 375 380

Lys Lys Gly Glu Glu Thr Pro Gly Ser Gly Glu Ala Glu Lys

385 390 395

<210> 14

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgaccaaag ttctggccgt gctgtatccg gatccggtgg atggttttcc gccgaaatat 60

gttcgtgatg atattccgaa aatcacccat tatccggatg gcagtaccgt tccgaccccg 120

gaaggcattg attttaaacc gggtgaactg ctgggtagcg ttagtggcgg tctgggcctg 180

aaaaaatatc tggaaagtaa aggtgtggaa tttgttgtta ccagtgataa agaaggcccg 240

gatagtgtgt ttgaaaaaga actgccgacc gccgatgtgg ttattagtca gccgttttgg 300

ccggcctatc tgaccgcaga tctgattgat aaagcaaaaa agctgaaact ggcaattacc 360

gccggtattg gcagcgatca tgtggatctg aatgccgcca atgaacataa tattaccgtt 420

gcagaagtga cctatagcaa tagtgttagt gttgcagaag cagaagtgat gcagctgctg 480

gccctggtgc gtaattttat tccggcacat gatattgtga aagccggtgg ctggaatatt 540

gcagatgcag ttagccgtgc ctatgatctg gaaggtatga ccgttggtgt gattggtgca 600

ggccgcattg gtcgtgccgt tctggaacgt ctgaaaccgt ttggcgttaa actggtgtat 660

aatcagcgcc atcagctgcc ggatgaagtt gaaaatgaac tgggcctgac ctattttccg 720

gatgttcatg aaatggtgaa agttgtggat gccgttgttc tggcagcacc gctgcatgca 780

cagacctatc atctgtttaa tgatgaagtt ctggccacca tgaaacgtgg cgcctatatt 840

gtgaataata gccgcggcga agaagttgat cgcgatgcaa ttgttcgcgc actgaatagc 900

ggtcagattg gcggttatag tggcgatgtt tggtatccgc agccggcacc gaaagatcat 960

ccgtggcgta ccatgccgaa tgaagcaatg accccgcata tgagtggcac caccctgagt 1020

gcccaggcac gctatgccgc aggtgcacgt gaaattctgg aagattttct ggaagataaa 1080

ccgattcgtc cggaatatct gattgcccag ggtggtagtc tggccggtac cggtgccaaa 1140

agttataccg tgaaaaaagg cgaagaaacc ccgggtagcg gcgaagcaga aaaataa 1197

<210> 15

<211> 252

<212> PRT

<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)

<400> 15

Met Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Val Gly Thr Pro Asp Gln Ile Gln Phe Phe Gln His Asp Ser

50 55 60

Ser Asp Glu Asp Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Ser Thr Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asn

85 90 95

Lys Ser Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ala

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 16

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgagcaacc gtctggacgg caaggtggcg atcattaccg gtggcaccct gggtattggt 60

ctggcgattg cgaccaagtt cgtggaggaa ggtgcgaaag ttatgatcac cggccgtcac 120

agcgacgtgg gcgagaaggc ggcgaaaagc gttggcaccc cggaccagat tcaattcttt 180

cagcacgata gcagcgacga ggatggttgg accaagctgt tcgatgcgac cgaaaaagcg 240

tttggcccgg ttagcaccct ggttaacaac gcgggtattg cggtgaacaa gagcgttgag 300

gaaaccacca ccgcggagtg gcgtaaactg ctggcggtga acctggatgg tgttttcttt 360

ggcacccgtc tgggtatcca acgtatgaag aacaaaggtc tgggcgcgag catcattaac 420

atgagcagca ttgaaggttt cgttggtgac ccgagcctgg gtgcgtacaa cgcgagcaag 480

ggtgcggttc gtatcatgag caaaagcgcg gcgctggatt gcgcgctgaa ggactacgat 540

gtgcgtgtta acaccgtgca cccgggctat attaaaaccc cgctggttga cgatctgccg 600

ggtgcggagg aagcgatgag ccagcgtacc aagaccccga tgggtcacat cggcgaaccg 660

aacgacatcg cgtacatttg cgtttatctg gcgagcaacg agagcaaatt cgcgaccggt 720

agcgaatttg tggttgatgg tggctatacc gcgcaataa 759

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actttaataa ggagatatac catggatgca tagccagaa 39

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

actgcggccg caagcttagt ggtggtggtg gtggtg 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taagaaggag atataatggc ggacaccaag aaactg 36

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtttcttta ccagattacg cgttggtaat aacatcgtc 39

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttatactacc agcgtaatgc tttaccaaaa gaa 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcttttggt aaagcattac gctggtagta taa 33

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taagaaggag atatacatat gaccaaagtt ctggccgtgc 40

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggtttcttta ccagactcga gttatttttc tgcttcgccg c 41

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

taagaaggag atatacatat gatgagcaac cgtctggacg g 41

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tttaccagac tcgagggtac cttattgcgc ggtatagcca cc 42

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaggagatat accatgggca tgcatagcca gaaacgtgt 39

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtttctttac cagactcgag ttacgcgttg gtaataaca 39

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaggagatat accatgggca tgattgagag cgtcgagtc 39

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtttctttac cagactcgag ttatttttct gcttcgccg 39

Claims

1.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经多酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的草铵膦脱氢酶突变体，

所述草铵膦脱氢酶突变体由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S，所述草铵膦脱氢酶的GenBank号为WP_101496154。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.9所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系还包括用于去除副产物过氧化氢的过氧化氢酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系还包括辅酶循环系统，所述辅酶循环系统为以下至少一种：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；所述葡萄糖脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；所述乙醇脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。

6.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中的草铵膦脱氢酶突变所得，突变位点为：V377S，所述草铵膦脱氢酶的GenBank号为WP_101496154。

7.编码如权利要求6所述草铵膦脱氢酶突变体的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No.3所示。

8.包含如权利要求7所述基因的基因工程菌。

9.如权利要求6所述草铵膦脱氢酶突变体、如权利要求7所述基因或如权利要求8所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。