CN109576236B

CN109576236B - 一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用

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Publication number: CN109576236B
Application number: CN201811618942.0A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 王柳玉; 徐建妙; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109576236A

Abstract

本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶突变体及其应用，该突变体由SEQ ID No.1所示氨基酸的第52位、第54位、第58位、第213位和第335位进行单突变或多突变获得；其中，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。本发明通过利用定点饱和突变技术对SEQ ID No.2所示的D‑氨基酸氧化酶基因进行突变，获得酶活和产物转化率远高于野生型的突变体，提高了4‑(羟基甲基磷酰基)‑2‑羰基‑丁酸生产工艺中的产物收率。

Description

一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用。

背景技术

草铵膦，又名草丁膦，英文名为Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用。目前，草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦由两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦；但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。

化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。

(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。

(3)以D,L-草铵膦为原料，经D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦得到L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，再经氨基酸脱氢酶或转氨酶催化得到L-草铵膦。

早在研究草铵膦在土壤微生物的代谢途径中就已经发现L-草铵膦在酶的作用下会被分解成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。因此，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，经酶法可逆催化生成L-草铵膦不失为一个好方法。

D-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将D-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶FAD催化完成，因其表现出的优良催化效率和选择性，D-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分L-氨基酸和α酮酸的生产。例如，D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。

发明内容

本发明针对现有L-草铵膦工艺合成存在的缺陷，提供了一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用；该突变体具有高酶活、高转化率的特点，可高效制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸，催化获得的产物收率高，产物可作为底物直接一锅法继续生产L-草铵膦。

具体技术方案如下：

一种D-氨基酸氧化酶突变体，为下列之一：

(1)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺；

(2)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸；

(3)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为苏氨酸或甘氨酸。

(4)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。

本发明通过构建D-氨基酸氧化酶突变体文库，获得了具有较高酶活和产物转化率的D-氨基酸氧化酶突变体，进而提供了D-氨基酸氧化酶重组菌在制备L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸中的应用。

本发明中，所述野生菌D-氨基酸氧化酶的NCBI登录号为ALM 22233.1；其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

作为优选，所述D-氨基酸氧化酶突变体为将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。

本发明提供了一种所述D-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。

本发明还提供了所述编码基因的重组载体和基因工程菌。

优选重组表达载体pET-24a(+)；宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎，获得粗酶液。

本发明还提供了所述的D-氨基酸氧化酶突变体在催化D,L-草铵膦或D-草铵膦合成4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸中的应用。

本发明还提供了一种制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，包括：

以D,L-草铵膦或D-草铵膦为底物，FAD为辅酶，向缓冲溶液中加入过氧化氢酶后，在催化剂的作用下，进行反应，反应液分离纯化后，得到4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸；

所述催化剂为D-氨基酸氧化酶突变体或包含D-氨基酸氧化酶突变体基因的基因工程菌及其粗酶液。

具体的，上述方法的添加方法为：配置一定浓度的D,L-草铵膦溶液，再以酶活力为单位，加入D-氨基酸氧化酶突变体或包含D-氨基酸氧化酶突变体基因的基因工程菌及其粗酶液，过氧化氢酶，恒温震荡，直至D-草铵膦完全氧化，经检测D-氨基酸氧化酶突变体催化特性。

进一步地，反应体系中，D-氨基酸氧化酶的添加量为0.1～100U/L，过氧化氢酶的添加量为0.1～100U/L，底物的初始浓度为10～500mM。

进一步地，反应的温度为30～50℃，时间为6～72小时；更优选的，反应温度为25～35℃，时间为6～24小时。

进一步地，反应体系的pH值为6～9，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，反应过程中需要通入空气或氧气。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过利用随机突变及定点饱和突变技术对SEQ ID No.2所示的D-氨基酸氧化酶基因进行突变，发现第52位、第54位、第58位、第213位和第335位是影响酶活的关键位点，获得酶活和产物转化率远高于野生型D-氨基酸氧化酶基因的突变体，提高了4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸生产工艺中的收率；4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸又可以被继续催化还原为L-草铵膦，进而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化。

(2)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法仅需添加2g/L的过氧化氢酶，显著降低了过氧化氢酶的添加量(一般为50g/L)，说明该氨基酸氧化酶突变体的过氧化氢耐受性高，有利于后续工业化应用。

(3)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤；在突变体E7的作用下，最高的转化率为48.4％(最大理论转化率为50％)为目前报道的最高水平，具有较好的应用价值。

(4)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法克服了化学法合成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的缺陷，是一种绿色，环保，低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。

附图说明

图1为D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦产生2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸以及氨气和过氧化氢的反应式。

图2为产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在不同介质，不同浓度下，与显色剂2，4-二硝基苯肼在380nm处的吸光值。

图3为实施例7的反应进程图。

图4为实施例7中D-氨基酸氧化酶菌体细胞液、粗酶液和纯酶的SDS-PAGE电泳图，

其中，泳道1：10-180kDa标准蛋白分子量；泳道2：200mM咪唑洗脱的纯酶；泳道3：粗酶液；泳道4：相同浓度的湿菌体。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本实验中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-24a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)为实验室合成，也可市售获得；D,L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

下列实施例通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行产物的检测，并对产物进行分析。

HPLC分析方法为：色谱柱/C18；柱温/30℃；流速/1mL/min；检测波长/232nm；流动相：50mM(NH₂)HPO₄，加入1％的10％的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调pH至3.8，加入12％的乙腈。

通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量。具体的，手性HPLC分析方法为：色谱柱/Pntulips QS-C18；流动相/50mM乙酸铵溶液：甲醇＝9:1；检测波长/338nm；流速/1mL/min；柱温/30℃。

衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12gN-乙酰-L-半胱氨酸，用10ml乙醇助溶，在加入40ml 0.1M硼酸缓冲液(pH)9.8。振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过3天)。衍生化反应与测定：取200μL样品加入400μL衍生化试剂，混匀至30℃保温5min，加入400μL超纯水混合，进样10μL进行分析。

D-草铵膦(简称D-PPT)的结构式如式(1)所示；L-草铵膦(简称L-PPT)的结构式如式(2)所示；2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)的结构式如式(3)所示。

实施例1 D-氨基酸氧化酶突变体文库的构建及筛选

将D-氨基酸氧化酶基因(氨基酸序列SEQ ID No.1所示，核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示)构建表达载体pET-24a(+)，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET-24a。

D-氨基酸氧化酶突变体文库的制备通过5轮突变来实现，引物设计如表1所示。

具体方法如下：

第一轮，以野生菌纤细红酵母菌(Rhodotorula gracilis)的基因组为模板，以epPCR-F和epPCR-R为上下游引物，经易错PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选、测序发现了有益突变位点213、54、58、52、335。

第二轮，以野生菌纤细红酵母菌(Rhodotorula gracilis)的基因组为模板，以M213-F和M213-R为上下游引物，经定点饱和突变、转化、涂平板，通过优势菌株筛选、获得D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S。

第三轮，以氨基酸序列SEQ ID No.1对应的突变体pRtDAAO-M213S为模板，以N5458-F和N5458-R为引物，经定点饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58Q。

第四轮，以突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58Q为模板，以G52-F和G52-R为引物，经定点饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58Q-G52L。

第五轮，以突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58Q-G52L为模板，以S335-F和S335-R为引物，经定点饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58Q-G52L-S335G。

表1 D-氨基酸氧化酶突变引物设计

注：N5458是指第54位和第58位共用相同的引物。

其中，PCR反应体系如下：

2×Phanta Max缓冲液：25μL；

dNTPs：1μL；

上游引物：1μL；

下游引物：1μL；

模板：0.5μL；

Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：0.5μL；

ddH₂O：21μL。

PCR反应条件如下：

1)预变性：95℃3min；

2)变性：95℃15s；退火：56℃-68℃30s；延伸：72℃6min；共循环30次

3)后延伸：72℃10min；

4)4℃保存。

将PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为6400bp左右。将PCR产物进行Dpn I酶消化模板。将PCR产物转化到大肠杆菌BL21中，首先吸取8uL的PCR产物，加入到BL21的感受态细胞中，冰浴30min，热击90s，冰浴3min，加600uL的LB培养基，培养1h，涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落到96孔板中，进行培养，进行高通量筛选。

实施例2高通量筛选方法的构建

以D,L-草铵膦为底物，通过2，4-二硝基苯肼显色法筛选对D-草铵膦有催化活力的酶。

定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为50mM，粗酶液浓度为50g/L，过氧化氢酶浓度为2g/L。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样。

通过2，4-二硝基苯肼显色法检测2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的含量：取60μL的反应液，加入2mM的2，4-二硝基苯肼40μl，37℃恒温槽保温20分钟，加入100μl 1M氢氧化钠，混匀30s，生成红棕色的化合物2，4-二硝基苯棕，并且，随着2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸浓度的升高，红棕色化合物颜色加深。对反应液进行全波长扫描，显示在380nm处有最大光吸收值，并在0.05-1mM范围内成线性。

为了准确的测量出2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和显色剂2，4-二硝基苯肼(DNPH)在碱性条件下生成红棕色化合物的含量，分别测定了2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在水，D,L-草铵膦溶液，铵根离子溶液和菌液为介质按上文所述方法与显色剂DNPH反应后，在碱性条件下生成红棕色化合物的最大吸收波长。

结果显示：2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在四种不同介质下在380nm处均有最大光吸收值，并成线性关系，结果参见附图2。由此，确定该方法可以作为高通量筛选D-草铵膦氧化酶的有效方法。

对实施例1中的突变体进行高通量筛选，得到优势菌株如下表

表2 D-氨基酸氧化酶突变体优势菌株

对高通量筛选结果进行液相检测，液相检测条件：

色谱柱C18(4.6×250mm)柱；流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800ml超纯水中，加入10ml四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000ml,用磷酸调pH到3.8，与乙腈以88:12混合。流速：1mL/min，检测波长为232nm，进样量10μL，柱温30℃。选取E4,E5,E7,E8,E9进行液相检测，检测结果为E7>E8>E5>E9>E4，与高通量筛选结果一致。

实施例3菌体的培养及突变体的纯化

一、菌体的培养

将含有D-氨基酸氧化酶基因的工程菌经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。

二、粗酶液的制备

将培养结束后收集的菌体用pH 8的磷酸盐缓冲液(PBS(50mM))洗涤两次，之后，将菌体加入pH 8的PBS(50mM)重悬细胞，在冰水混合物上破碎30次，超声破碎条件：功率为400W，破碎2s，间歇5s。将此细胞破碎液于4℃离心10min，去除沉淀，得到的上清，即为重组D-氨基酸氧化酶的粗酶液。

三、D-氨基酸氧化酶的纯化

将粗酶液与经上样缓冲液(pH8PBS(50mM)，其中包含500mM NaCl、20mM咪唑)平衡过的Ni亲和层析树脂结合后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8PBS，其中包含50mM咪唑、500mMNaCl)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8PBS，其中包含200mM咪唑、500mMNaCl)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM，pH8PBS)透析24h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.7mg/mL，将酶液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃，即获得重组D-氨基酸氧化酶纯酶。所得D-氨基酸氧化酶菌体细胞液，粗酶液和纯酶的SDS-PAGE电泳图见附图4。

实施例4 D-氨基酸氧化酶活力的测定

酶活定义:1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(30℃)下，在1分钟内转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中的1微摩尔的有关基团的酶量。

D-氨基酸氧化酶的酶活测定：取溶于50mM的磷酸盐缓冲液的底物溶液(100mM D,L-草铵膦)400μl，置于金属浴振荡器中，30℃保温10min，加入20μl纯酶，开始计时，30℃反应10min，加入20μl 6M的盐酸，取出震荡混匀，反应终止，12000rpm离心3min，取上清，用去离子水稀释2倍，进行HPLC检测。根据HPLC测得的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸浓度，计算酶活。

表3酶活测定结果

编号	突变类型	酶活(U/L)
			E4	M213S-N54V-F58Q	2.28±0.3
E5	M213S-N54V-F58Q-G52L	4.63±0.14
			E7	M213S-N54V-F58Q-G52L-S335G	5.96±0.22
E8	M213S-N54V-F58Q-G52L-S335T	5.01±0.07
			E9	M213S-N54V-F58Q-S335G	3.21±0.2
对照1		1.31±0.03
			对照2		1.29±0.07

实施例5菌体的大规模制备

因生产L-草铵膦及2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的过程中，需要大量的生物催化剂，因此需要菌体大规模制备。所用培养基为LB培养基。

将保藏有重组D-氨基酸氧化酶工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1L同样含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。

粗酶液的制备见实施例2。

实施例6 D-氨基酸氧化酶(E7)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E7)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为50mM，粗酶液浓度为50g/L，仅需要加入2g/L过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与ee值。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余0.8mM，转化率48.4％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为20mM，产率为40％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

实施例7 D-氨基酸氧化酶(E9)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E9)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为50mM，湿菌体浓度为50g/L，仅需要加入2g/L过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与ee值。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余5.6mM,转化率38.8％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为12.8mM,产率为25.6％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

实施例8 D-氨基酸氧化酶(E8)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E8)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余3.4mM,转化率43.2％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为15.6mM，产率为31.2％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

实施例9 D-氨基酸氧化酶(E5)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E5)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余4.9mM，转化率40.2％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为13.9mM，产率为27.8％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

实施例10 D-氨基酸氧化酶(E4)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E4)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余9.7mM，转化率30.6％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为13.9mM，产率为27.8％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

对比例1

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为50mM，湿菌体浓度为50g/L，过氧化氢酶浓度为10g/L。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与ee值。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余13mM,转化率24％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为10.78mM,产率为21.56％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

对比例2

按照实施例5的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E3)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。

反应结束，数据如下：D-PPT剩余12.6mM，转化率24.8％(其中，最大理论转化率为50％)，PPO的生成浓度为11.8mM，产率为23.6％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 368

<212> PRT

<213> 纤细红酵母菌(Rhodotorula gracilis)

<400> 1

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile

20 25 30

Val Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Ser Leu Thr Asp Gly

50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Leu Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu

65 70 75 80

Leu Val Pro Thr Gly Gln Val Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe

85 90 95

Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr

100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Asn Ser Ile

115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln

130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Gly Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg

145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Ala Phe Glu Gly Val Asp Leu Val Val

165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln

180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Ala Cys

195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ser Ser Pro Ala Tyr Ile

210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val

225 230 235 240

Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu

245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile

260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Leu Val Leu Pro Leu Asp

290 295 300

Arg Ser Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Lys Gly Thr Thr Arg Ala Ala

305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala

325 330 335

Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Leu Leu Val

340 345 350

Glu Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu

355 360 365

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 纤细红酵母菌(Rhodotorula gracilis)

<400> 2

atgcacagcc agaagcgtgt ggttgtgctg ggtagcggcg ttatcggtct gagcagcgcg 60

ctgattctgg cgcgtaaagg ctacagcgtt cacatcgtgg cgcgtgacct gccggaggat 120

gtgagcagcc agacctttgc gagcccgtgg gcgggtgcga actggacccc gtttatgagc 180

ctgaccgatg gtccgcgtca agcgaagtgg gaggaactga ccttcaagaa atgggttgag 240

ctggtgccga ccggtcaggt tatgtggctg aagggcaccc gtcgttttgc gcaaaacgaa 300

gacggtctgc tgggccactg gtacaaagat atcaccccga actatcgtcc gctgccgagc 360

agcgagtgcc cgccgaacag cattggtgtt acctatgaca ccctgagcgt gcacgcgccg 420

aagtactgcc agtatctggc gcgtggtctg cagaaactgg gcgcgacctt cgaacgtcgt 480

accgttacca gcgtggagca ggcgtttgaa ggtgtggatc tggttgtgaa cgcgaccggt 540

ctgggtgcga agagcatcgc gggtattgac gatcaggcgg cggaaccgat ccgtggccaa 600

accgttctgg tgaagagcgc gtgcaaacgt tgcaccatgg acagcagcga tccgagcagc 660

ccggcgtaca tcattccgcg tccgggtggc gaggttattt gcggtggcac ctatggtgtg 720

ggcgactggg atctgagcgt taacccggaa accgtgcaac gtatcctgaa acactgcctg 780

cgtctggacc cgagcattag cagcgatggt accatcgagg gcattgaagt tctgcgtcat 840

aacgttggcc tgcgtccggc gcgtcgtggt ggcccgcgtg ttgaagcgga acgtctggtg 900

ctgccgctgg accgtagcaa gagcccgctg agcctgggta aaggcaccac ccgtgcggcg 960

aaggagaaag aagttaccct ggtgcacgcg tacggtttca gcagcgcggg ctatcagcaa 1020

agctggggtg cggcggagga tgttgcgctg ctggttgagg aagcgttcca acgttaccac 1080

ggcgcggcgc gtgaaagcaa actg 1104

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gtgcaaacgt tgcaccnnkg acagcagcg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

ctcggatcgc tgctgtcmnn ggtgcaacg 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gcgnnktgga ccccgnnkat gagcctgac 29

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

gctcatmnnc ggggtccamn ncgcacccgc c 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gacctttgcg agcccgtggg cgnnkgcggt gt 32

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

tcattggcgg ggtccaaacc gcmnncgccc acg 33

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

gcacgcgtac ggtttcagcn nkgcgggcta tc 32

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

ccagctttgc tgatagcccg cmnngctgaa accg 34

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

atgcacagcc agaagcgtgt gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cagtttgctt tcacgcgccg cg 22

Claims

1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸；

(2)将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为苏氨酸或甘氨酸。

2.如权利要求1所述的D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体为将SEQ ID No.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。

3.一种如权利要求1或2任一项所述D-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。

4.一种包含权利要求3所述编码基因的基因工程菌。

5.如权利要求1或2任一项所述的D-氨基酸氧化酶突变体在催化D,L-草铵膦或D-草铵膦合成4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸中的应用。

6.一种制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，包括：

所述催化剂为如权利要求1或2任一项所述D-氨基酸氧化酶突变体或如权利要求4所述基因工程菌。

7.如权利要求6所述的制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，其特征在于，反应体系中，所述D-氨基酸氧化酶突变体的添加量为0.1～100U/L，过氧化氢酶的添加量为0.1～10U/L，底物的初始浓度为10～500m M。

8.如权利要求6所述的制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，其特征在于，反应的温度为30～50℃，时间为6～72小时。

9.如权利要求6所述的制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，其特征在于，反应体系的pH值为6～9。