CN107119084B - 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产l-草铵膦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L‑草铵膦的方法，该方法以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为原料，在谷氨酸或其盐为氨基供体的条件下，经转氨酶和乙烯合成酶催化反应，得到L‑草铵膦。本发明以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在谷氨酸或其盐为氨基供体的条件下，经转氨酶和乙烯合成酶共同催化得到L‑草铵膦，使得转氨反应后的副产物α‑酮酸二酸经乙烯合成酶催化全部转化为二氧化碳和乙烯，在保证原料用量较少的情况下，显著提高了原料转化率，降低了原料成本，简化了后续精制工艺，提高了产品总收率。

Description

一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，尤其涉及一种生产L-草铵膦的新工艺；具体地说，是一种利用两种生物酶提高光学纯L-草铵膦生产效率的新方法。

背景技术

草铵膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，一般是指化合物2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸或其与碱性化合物形成的盐(如式(1)所示)。草铵膦是由赫斯特公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱触杀型除草剂，属于膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，在叶子内转移，但不能转移到别处，谷氨酰胺合成受抑制后，导致铵离子累积，叶绿体解体，从而使光合作用受抑制，最终导致植物死亡。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦(式2)和D-草铵膦(式3)。但只有L型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有重要意义。

制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：不对称合成法、手性拆分法以及生物酶催化法。

不对称合成法也称化学立体合成法，对于光学纯L-草铵膦的制备，多见于实验室研究中，如Minowa N等利用甘氨酸为起始原料合成L-草铵膦(Hirayama M.AsymmetricSynthesis of(+)-Phosphinothricinand Related Compounds by the Michael AdditionofGlycine Schiff Bases to Vinyl Compounds[J].Bulletin of theChemical Societyof Japan,1987,60:1761–1766.)，还有Zeiss H J等对L-草铵膦的不对称合成做了很多尝试(Enantioselective Synthesis of Both Enantiomers ofPhosphinothricin viaAsymmetric Hydrogenation ofα-acylamidoAcrylates[J].Journal of Org--anicChemistry,1991,56:1783–1788.)，(Enantioselective Synthesis of L-PhosphinothricinfromL--methionine and L-glutamic Acid via L-vinylglycine[J].Tetrahedron,1992,48(38):8263–8270.)。由于不对称合成法工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。

手性拆分法是利用化学合成的外消旋DL-草铵膦或其衍生物，再加手性拆分试剂，进行D型和L型的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。此工艺有两大缺点，一是需要消耗手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋化再进行拆分，增加了工艺复杂度，降低了收率。

相比之下，生物酶催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在方法。早在研究草铵膦在土壤微生物的体内代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。转氨作用是一个可逆反应，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)也可在转氨酶的催化下通过逆反应生成L-草铵膦。正是利用转氨酶的这个作用，L-草铵膦的生物催化生产可行性具有十分重要的产业化价值和显著的社会效益。

国际上，Schulz A等人(Stereospecific Production oftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation andCharacterization of a Phosphinothricin-specific Transaminasefrom Escherichiacoli[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56:1-6.)(美国专利US5221737)早在上世纪90年代就利用从E.coli K-12中分离到的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，利用转氨作用生产L-草铵膦(图1)。转氨酶经固定化后安装至生物反应器，反应器的产物最高浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但这个工艺有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给分离带来了很大的负担。

解决这一问题的途径之一就是利用L-天冬氨酸代替L-谷氨酸，L-天冬氨酸经转氨作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不稳定、易分解为丙酮酸，从而打破了转氨反应的平衡。鉴于此，BartschK(美国专利US6335186B1)在上述单酶反应体系下，增加一个谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，组成双转氨酶偶联反应体系(图2)。然而，在偶联反应中仍然需要使用谷氨酸，谷氨酸与酮戊二酸的在反应中形成平衡，其结构又与产品L-PPT极为类似，难以在分离纯化中去除；此外还增加了两种需要分离的杂质草酰乙酸和L-天冬氨酸，而且此工艺中PPO的转化率也只有85％。

Bartsch K等随后在中国申请的专利(中国专利CN1349561A)中又提出了一条新工艺(如图3)，他们筛选得到了能够特异性地转化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体。但此工艺效率低下，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在几乎完全消耗大约700mmol/L的原料L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-PPT，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸。原料PPO反应转化率只有52％。

杨立荣等在中国申请的专利(公开号CN105603015A)中又提出了一条新工艺(如图4)，他们是以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为原料，以L-丙氨酸或L-丙氨酸与碱性化合物所成的盐为氨基供体，经过转氨酶的转氨基作用，生成L-PPT和副产物丙酮酸，实现PPO的100％转化，但此工艺效率较低，耗时长，需消耗大量的丙氨酸。

发明内容

本发明针对现有转氨酶法生产L-PPT工艺存在的缺陷，提供了一种全新的利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法，该方法能够将副产物α-酮戊二酸转化为二氧化碳和乙烯，转化率高达到100％。

本发明提供了一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为原料，在谷氨酸或其盐为氨基供体的条件下，经转氨酶和乙烯合成酶催化反应，得到L-草铵膦。

以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为原料，以L-谷氨酸或L-谷氨酸与碱性化合物所成的盐为氨基供体，经过转氨酶的转氨基作用，生成L-PPT和副产物α-酮酸二酸，同时通过乙烯合成酶的催化将副产物α-酮酸二酸转化为二氧化碳和乙烯。反应式如图5所示。

作为优选，所述转氨酶和乙烯合成酶独立地为离体酶、固定化酶或工程菌表达的酶。上述转氨酶和乙烯合成酶均可以以离体酶、固定化酶或工程菌表达的酶的形式参与反应，且两者的参与形式是相互独立地；即转氨酶和乙烯合成酶来源于微生物或其处理物，所述处理物为微生物进行机械破坏、超声波处理、冻结融解处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自身消化、表面活性剂处理或酶处理而得到的物质、或者通过上述处理所得到的含有转氨酶酶活性或乙烯合成酶活性的固定化物，又或者所述微生物的固定化物。

所述转氨酶可以来源于枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜热杆菌或链霉菌；所述乙烯合成酶可以来源于丁香假单胞菌、青霉、粘球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌。

其中，作为优选，所述转氨酶来源于大肠杆菌；所述乙烯合成酶来源于丁香假单胞菌。

具体地，所述转氨酶的转氨酶GenBank登录号为CP012868.1；乙烯合成酶的GenBank登录号为D13182.1。

进一步地，本发明提供的一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法，具体步骤如下：

(1)向生物反应器中加入底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，用碱调节pH；

(2)再依次加入L-谷氨酸、转氨酶、乙烯合成酶、辅酶和辅助因子，进行反应，获得L-草铵膦。

其中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、异丙胺或三乙胺。

作为优选，反应体系中，所述转氨酶和乙烯合成酶的活力比为0.8～1.2:1。

作为优选，所述谷氨酸或其盐与所述2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐的用量比为0.8:1～4:1；进一步优选，用量比为0.9:1～2:1。

作为优选，以细胞干重计，所述工程菌的添加量为反应体系质量的1～15％；进一步优选，所述细胞的添加量为反应体系质量的5～10％。

进一步地，反应体系中还包括辅助因子，所述辅助因子为L-精氨酸或其盐和Fe²⁺。所述Fe²⁺为FeSO₄或FeCl₂。

进一步地，反应体系中还包括辅酶，所述辅酶为维生素B₆类型辅酶，即吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺或它们的衍生物；优选，所述辅酶为磷酸吡哆醛。

所述反应的温度为10～80℃；时间为8～32h。作为优选，所述反应的温度为15～60℃；更优选，温度为20～40℃。

作为优选，控制反应的pH值为4～11；优选，pH为5～10；更优选，pH为6～9。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在谷氨酸或其盐为氨基供体的条件下，经转氨酶和乙烯合成酶共同催化，得到L-草铵膦，使得转氨反应后的副产物α-酮酸二酸经乙烯合成酶催化全部转化为二氧化碳和乙烯，在保证原料用量较少的情况下，显著提高了原料转化率，降低了原料成本。

(2)本发明方法以谷氨酸为氨基供体，反应过程基本完全被消耗，且副产物α-酮戊二酸也几乎完全被转化，分解产生的二氧化碳和乙烯均为气体易于去除，因而反应结束后体系中仅剩下少量精氨酸以及乙烯合成酶催化的副反应生成的少量琥珀酸、胍、1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)；这些杂质相对于其他氨基酸、α-酮酸杂质，与L-草铵膦的结构、性质等相差较大，易于分离，简化了后续精制工艺，提高了产品总收率。

(3)本发明方法中谷氨酸或其盐作为氨基供体，转氨反应效率最高；乙烯合成酶的产物大部分为气体，使得多酶反应过程较简单，不会在反应体系中引入大量杂质而造成产物抑制。

附图说明

图1为以谷氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。

图2为双转氨酶体系生产L-PPT的反应式。

图3为以天冬氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。

图4为以丙氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。

图5为本发明中以乙烯合成酶转化α-酮戊二酸提高酶促转氨反应生产L-PPT效率的反应式；

图6为本发明涉及的反应物和产物(反应过程中)的高效液相检测图谱；

其中，1：保留时间2.5:L-Arg；2：保留时间2.8:纯化酶溶液中带的杂质咪唑；3：保留时间3.1:谷氨酸；4：保留时间3.7:草铵膦；5：保留时间8.5:α-酮戊二酸；6：保留时间9.9:PPO；7：保留时间11.43:磷酸吡哆醛；其他如5.5min为原料PPO中引入的未知杂质。

图7为本发明涉及的反应物和产物(OPA衍生法)的高效液相检测图谱；

其中，1：保留时间10.4:谷氨酸；2：保留时间11.97:草铵膦；另外3.9min为未知杂质，可能为体系中其他组分在该检测条件下于死时间出峰。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：液相色谱仪：Agilent 1100；色谱柱型号：AQ-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：50mM磷酸氢二氨水溶液(含0.1％四丁基氢氧化铵，并用磷酸调pH至3.6):乙腈＝92：8。检测波长：205nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃，各相关物质出峰情况见图6-7。

为了增加氨基酸检测的灵敏度，使用邻苯二甲醛(OPA)衍生法检测生成的L-PPT的生成量及体系中剩余的L-Glu的量，衍生剂为0.06gOPA，加入100uL乙醇，800uLpH10.4的硼酸-氢氧氢氧化钠缓冲液，100uLβ-巯基乙醇；衍生时取100uL样品，加入25uL衍生剂，30℃避光反应2min，用流动相稀释10倍进样，流动相：10mM pH7.2磷酸钠缓冲液(含0.3％四氢呋喃)：甲醇：乙腈＝200:35:15，检测波长：338nm，流速：0.75ml/min，柱温40℃。

实施例1

1.1表达转氨酶的基因工程菌的构建

分别从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168、巨大芽孢杆菌Bacillusmagaterium YYBM1、大肠杆菌E.coli K12W3110、嗜热杆菌(Bacillusstearothermophilus)以及链霉菌(Streptomyces sp.DSM 40736)基因组中克隆转氨酶基因，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号分别为CP010052.1、CP001982.1、CP012868.1、AE016877.1和EFL35314.1)设计相应的PCR上游引物和下游引物。

来源于Bacillus subtilis的转氨酶的引物：

BS-F序列：5’-CCCGAGCTCATGAGTCAAACAACAGCAAGCATCA-3’(SacI)

BS-R序列：5’-CCCAAGCTTTTAAGCTCGCAGGCCCGCCT-3’(HindIII)

来源于Bacillus magaterium的转氨酶的引物：

BM-F序列：5’-CGCGGATCCATGAGTCAAACTTTTAGCAA-3’(BamHI)

BM-R序列：5’-CCCAAGCTTTTACACTTCAACCGTTTGCT-3’(HindIII)

来源于E.coli的转氨酶的引物：

EC-F序列：5’-CCGGAATTCATGAGCAACAATGAATTCCATC-3’(EcoRI)

EC-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAATCGCTCAGCGCATCC-3’(XholI)

来源于Bacillus stearothermophilus的引物：

BT-F:5’-CGCGGATCCATGAACACAAAAAAATTTGCTAAAG-3’(BamHI)

BT-R:5’-CCGCTCGAGTTAAACGCGAGCGATGTTTG-3’(XholI)

来源于Streptomyces sp.的引物：

SS-F:CGCGGATCCATGGGGCTTGCGCCGGGGAA-3’(BamHI)

SS-R:CCCAAGCTTTTACGGCGCGCACGGAGCGT-3’(HindIII)

在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点，如下划线所示，具体限制酶见引物序列括号内。

分别以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及巨大芽孢杆菌Bacillusmagaterium YYBM1、大肠杆菌E.coli K12W3110、嗜热杆菌(Bacillusstearothermophilus)以及链霉菌(Streptomyces sp.DSM 40736)基因组DNA为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存5.0h。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小为1400bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4 DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表1所示：

表1pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系

将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16℃金属浴中连接12h。将酶连产物转化至E.coliDH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。再将重组表达载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误的基因工程菌即为E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-TA。

1.2表达乙烯合成酶的基因工程菌的构建

分别从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、青霉(Penicilliumdigitatum)、铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)、荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)以及肺炎克雷伯氏菌(KlebsiellaPneumoniae)基因组中克隆乙烯合成酶基因，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号分别为D13182.1、EKV19239、KGB85377.1、NC_016830.1和KXA26957.1)，具体的步骤参考1.1中转氨酶的构建方法。相应的PCR上游引物和下游引物如下：

来源于丁香假单胞菌的乙烯合成酶的引物：

PS-F：5’-CGCGGATCCATGACCAACCTACAGACTTT-3’(BamHI)

PS-R：5’-CCCAAGCTTTCATGAGCCTGTCGCGCGGG-3’(HindIII)

来源于青霉的乙烯合成酶的引物：

PD-F：5’-CGCGGATCCATGACACACATACCTTTT-3’(BamHI)

PD-R：5’-CCCAAGCTTTCATGACGCGCGACATAGG-3’(HindIII)

来源于铜绿假单胞菌的乙烯合成酶的引物：

PA-F：5’-CGCGGATCCATGGAAAAGAACATACCTAT-3’(BamHI)

PA-R：5’-CCGCTCGAGTTAGTTGGGTTCAAGTTCAC-3’(XholI)

来源于荧光假单胞菌的乙烯合成酶的引物：

PF-F：5’-CGCGGATCCATGGAAAAGAACATACCTAT-3’(BamHI)

PF-R：5’-CCGCTCGAGTTAGTTGGGTTCAAGTTCAC-3’(HindIII)

来源于肺炎克雷伯氏菌的乙烯合成酶的引物：

KP-F：5’-CGCGGATCCATGACCGCCGTGAAGCACGCTTT-3’(BamHI)

KP-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGGGTTTTTTTGCTGAG-3’(HindIII)

实施例2

2.1微生物的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有转氨酶基因以及乙烯合成酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.1mM，18℃下诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。

2.2纯酶的制备

将培养结束后收集到的菌体细胞，用20mMPBS(pH 7.4，25mM咪唑)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于PBS(20mM，pH 7.4,25mM咪唑)缓冲液中，高压匀浆破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为上样到事先使用水和PBS(20mM，pH 7.4,25mM咪唑)缓冲液平衡的Ni-NTA填料填充柱上，静置1h，再分别使用10倍柱体积的PBS(20mM，pH 7.4,25mM咪唑)缓冲液和5倍柱体积的PBS(20mM，pH 7.4,50mM咪唑)缓冲液洗杂，最后使用PBS(20mM，pH7.4,250mM咪唑)缓冲液洗脱柱子上的蛋白，经SDS-PAGE验证条带纯度后，使用30kD的超滤管浓缩，并使用100mM磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)置换两次，加入甘油使得甘油终浓度为10％，即可制备转氨酶或乙烯合成酶的纯酶。使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，液氮速冻后置于-70℃超低温冰箱中冻存备用。

2.3酶活力的测定

酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(25℃)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

转氨酶的酶活测定：取底物溶液(0.3M谷氨酸、0.1M PPO溶液)250μL，加入0.1M的NH3·NH4Cl缓冲溶液(pH＝7.5)200μL，加入10mM PLP溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL酶液，迅速取出用手震荡、迅速放回金属浴震荡器中，开始计时，25℃反应10min；反应10min后加入500μL 5％的盐酸，取出震荡混匀，反应终止；12000rpm离心三分钟，取上清液，用去离子水稀释10倍，进HPLC分析；根据HPLC测得的L-草铵膦浓度数据，计算酶活。

乙烯合成酶酶活测定：取底物溶液(20mMα-酮戊二酸溶液)800μL，加入100mM L-精氨酸溶液50μL，40mM的FeSO₄溶液50μL，置于振荡摇床中，25℃保温10min；加入100μL酶液，迅速取出用手震荡、迅速放回振荡摇床中，开始计时，25℃反应10min；反应10min后加入500μL 5％的盐酸，取出震荡混匀，反应终止；12000rpm离心三分钟，取上清液，进HPLC分析；根据HPLC测得的20mMα-酮戊二酸溶液的浓度数据，计算其减少的量以计算酶活。

转氨酶酶活测定结果：通过对5个转氨酶的活力比较，发现来源于大肠杆菌的转氨酶活力最高，约为30U/mL，其他的转氨酶的活力均较低，来源于枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热杆菌和链霉菌的转氨酶活力分别为大肠杆菌的28％、37％、15％和10％。

乙烯合成酶酶活测定结果：通过对克隆的乙烯合成酶的活力测定，结果表明，来源于丁香假单胞菌的乙烯合成酶活力最高，约为97U/L，其他的乙烯合成酶均表现较低的活力，其中青霉来源的活力为64％，其他来源的均低于15％。

为减少菌体或者酶的使用量，故具体实施过程使用来源于大肠杆菌的转氨酶和来源于丁香假单胞菌的转氨酶作为催化剂，考察转氨酶和乙烯合成酶偶联催化对草铵膦生产效率的影响。

实施例3对比转氨酶和乙烯合成酶耦合的反应效果

3.1全细胞定性反应

配置底物溶液：定量称取PPO和L-谷氨酸、L-精氨酸、FeSO₄以及磷酸吡哆醛到烧杯中，用30％氨水调节pH＝8.5，加到容量瓶中，用去离子水定容，使PPO的终浓度为20mM，L-谷氨酸的终浓度为20mM、L-Arg浓度为5mM、Fe²⁺浓度为2mM以及磷酸吡哆醛1mM。

培养结束后，离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后测定活力。将转氨酶(来源于大肠杆菌，GenBank登录号为CP012868.1)和乙烯合成酶(来源于丁香假单胞菌，GenBank登录号为GenBank登录号为D13182.1)按照活力1:1的比例混合，其中转氨酶取50μL发酵液离心得到的菌体，加入底物溶液2mL，重悬，置于试管(15mm*150mm)中于30℃恒温振荡反应器内反应24h。

反应结束后，HPLC检测，有PPT产生，但未发现明显的α-酮戊二酸和PPO峰，衍生检测无明显谷氨酸的峰，说明PPO转化率达到100％。

3.2纯酶催化反应验证乙烯合成酶的效果并对比谷氨酸加量对反应转化率的影响

定量称取PPO到圆底烧瓶中，用0.2M氢氧化钠调节pH＝7.5，定量称取L-谷氨酸钠、L-精氨酸、硫酸亚铁和磷酸吡哆醛，用去离子水定容，使得PPO浓度为50mM，L-谷氨酸分别为50mM、62.5mM、100mM、150mM、200mM，磷酸吡哆醛浓度为2mM、L-精氨酸浓度为10mM，Fe²⁺浓度为4mM，取底物混合液2mL至于试管(15mm*150mm)中，根据纯化后测得活力，按照转氨酶：乙烯合成酶活力比1:1加入转氨酶(来源于大肠杆菌，GenBank登录号为CP012868.1)和乙烯合成酶(来源于丁香假单胞菌，GenBank登录号为GenBank登录号为D13182.1)的酶液2mL，其中转氨酶浓度为0.56g/L，最终反应体系4mL，于22℃恒温振荡器中反应24h，HPLC检测；同时，设置转氨酶单酶反应的对照，结果如下：

表1不同L-谷氨酸添加量对产率、转化率及副产物消耗的影响

标注：表格中底物加入比例表示底物谷氨酸和底物PPO的加入量的比例，谷氨酸和PPO同为转氨酶催化反应的底物，该反应产生产物草铵膦，同时生成副产物α-酮戊二酸，副产物为乙烯合成酶反应的底物，且该反应需要L-精氨酸和亚铁离子作为辅助因子，同时L-精氨酸也作为乙烯合成酶的辅助底物被消耗，其消耗量约为α-酮戊二酸的33％；转化率代表了底物PPO的转化比例。此外，检测产物草铵膦的光学纯度，发现其为L-草铵膦，且对映体过量值>99.9％。

上述结果表明：当转氨反应偶联乙烯合成酶时，能消耗体系中大部分α-酮戊二酸，从而促进反应向L-PPT方向移动，提高PPO的转化率，特别是在Glu和PPO的摩尔比较低时有非常明显效果，而且，使用纯酶进行反应，说明提高反应效率的关键是体系中的乙烯合成酶。且在反应结束后检测发现L-精氨酸基本消耗，因而体系中杂质的量相比单转氨酶反应减少了70％-80％，大大减轻了下游分离纯化的压力。

3.3提高底物浓度并比较全细胞反应偶联反应的效果

分别定量称取PPO到100mL三角瓶中，用0.2M氢氧化钠调节pH＝8.0，定量称取L-谷氨酸钠、L-精氨酸、硫酸亚铁和磷酸吡哆醛，用去离子水定容至10mL，使得PPO浓度为100mM，L-谷氨酸分别为100mM、125mM、150mM，磷酸吡哆醛浓度为2mM、L-精氨酸浓度为20mM，Fe²⁺浓度为6mM；以4mL转氨酶发酵液离心的菌体为基准，使得转氨酶：乙烯合成酶活力比为1:1.2，并用100mM pH7.5磷酸钠缓冲液重悬并定容至10mL，加入反应物中，最终反应体积为20mL，于25℃恒温振荡器中反应，HPLC检测。同时，设置转氨酶单酶反应的对照，反应10.5h。结果如下：

表2.不同底物加入量在全细胞催化高浓度PPO底物时对反应转化率、副产物消耗的影响

标注：表格中底物加入比例表示底物谷氨酸和底物PPO的加入量的比例，谷氨酸和PPO同为转氨酶催化反应的底物，该反应产生产物草铵膦，同时生成副产物α-酮戊二酸，副产物为乙烯合成酶反应的底物，且该反应需要L-精氨酸和亚铁离子作为辅助因子，同时L-精氨酸也作为乙烯合成酶的辅助底物被消耗，其消耗量约为α-酮戊二酸的33％；转化率代表了底物PPO的转化比例，此外，检测产物草铵膦的光学纯度，发现其为L-草铵膦，且对映体过量值>99.9％。

上述结果表明：当转氨反应偶联乙烯合成酶时，能消耗体系中大部分α-酮戊二酸，从而促进反应向L-PPT方向移动，提高PPO的转化率，而虽然体系中有过量的L-谷氨酸存在，但是细胞内的酶能将部分L-Glu和α-酮戊二酸消耗，反应体系中L-Glu的剩余量较低。

综上所述，本发明以谷氨酸或其盐为氨基供体，以乙烯合成酶消耗副产物α-酮戊二酸生产L-草铵膦的方法，具有原料转化率高、杂质少、生产成本低、分离简单、收率高、环保压力小、适合大规模工业化生产等优点。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例做了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<213> 人工序列

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Claims (1)

1.一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产L-草铵膦的方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，在谷氨酸为氨基供体的条件下，经转氨酶和乙烯合成酶催化反应，得到L-草铵膦，

所述转氨酶来源于大肠杆菌；所述乙烯合成酶来源于丁香假单胞菌，

反应体系中，所述转氨酶与乙烯合成酶的活力比为0.8～1.2:1，

反应体系中，所述谷氨酸与所述2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的用量比为0.8:1～4:1，

反应体系中还包括辅助因子，所述辅助因子为L-精氨酸和Fe²⁺，

反应体系中还包括辅酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛，

所述反应的温度为22～30℃；时间为8～32h，

控制反应的pH值为7.5～8.5。