CN106978453B

CN106978453B - 一种利用氨基酸脱氢酶制备l-草铵膦的方法

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Publication number: CN106978453B
Application number: CN201710210030.9A
Authority: CN
Inventors: 杨立荣; 尹新坚; 蒙丽钧; 周海胜; 吴坚平; 徐刚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: CN106978453A

Abstract

本发明公开了一种利用氨基酸脱氢酶制备L‑草铵膦的方法，该方法以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体及还原型辅酶存在的条件下，利用离体的谷氨酸脱氢酶或体外表达谷氨酸脱氢酶的细胞作为催化剂，进行还原胺化反应，获得L‑草铵膦。本发明方法原料转化率和收率高，产物易于分离提纯且手性纯度较高；与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高达100％。

Description

一种利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种手性纯L-草铵膦的生产方法；具体地说是一种利用来源于微生物的氨基酸脱氢酶生产光学纯L-草铵膦的方法。

技术背景

草铵膦(glufosinate-ammonium)是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

目前，世界上的三大除草剂品种是草甘膦、草铵膦和百草枯，相对于百草枯和草甘膦，草铵膦具有优异的除草性能及较小的药害副作用，随着抗草铵膦转基因作物的快速发展，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的方法主要制备方法有三种：手性拆分法、化学直接合成法以及生物催化法。

手性拆分法是通过对外消旋D，L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分收率低、工艺比较复杂。

化学直接合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。

相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。

生物法生产L-草铵膦以起始原料和途径进行分类，主要包括以下3大类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体(Organophosphorus analoguesand derivatives of the natural L-amino carboxylic acids andpeptides.I.Enzymatic synthesis of D-,DL-,and L-phosphinothricin and theircyclic analogues[J].Bullchemsocjpn,1988,61(10):3699-3704.)。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。Natchev报道了一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键(ChemInform Abstract:Total Synthesis and Enzyme-Substrate Interaction of D-,DL-,and L-Phosphinotricine,“Bialaphos”(SF-1293)and Its Cyclic Analogues[J].ChemInform,1989,1(17):125-131.)。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。

3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与氨基酸脱氢酶。

早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)。

Schulz A等(Stereospecific production of the herbicidephosphinothricin(glufosinate)by transamination:isolation and characterizationof a phosphinothricin-specific transaminase from Escherichia coli[J].Applied&Environmental Microbiology,1990,56(1):1-6.)在上世纪90年代就利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦。该在转氨酶经固定化并安装至生物反应器，催化制备L-草铵膦，其产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给L-草铵膦的分离带来了很大的麻烦。

氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.-，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)⁺)。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。因其表现出的优良催化效率与选择性，氨基酸脱氢酶被广泛的应用于天然与非天然α-氨基酸的合成。例如，Li等利用亮氨酸脱氢酶制备L-叔亮氨酸，0.6M的底物能够在5.5H被完全转化，且其产物的ee值高达99％(Stereoselective synthesis of l-tert-leucine by a newly cloned leucinedehydrogenase from Exiguobacterium sibiricum[J].Journal of MolecularCatalysis B Enzymatic,2014,105(7):11-17.)。Hanson等人利用谷氨酸脱氢酶制备L-6-羟基正亮氨酸，其最终产率为91～97％，ee值大于99％(Enzymatic synthesis of L-6-hydroxynorleucine.[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry,1999,7(10):2247-2252.)。

发明内容

本发明针对现有L-草铵膦合成工艺存在的缺陷，提供了一种利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法，该方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯。

本发明提供了一种利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体及还原型辅酶存在的条件下，利用离体的谷氨酸脱氢酶或体外表达谷氨酸脱氢酶的细胞作为催化剂，进行还原胺化反应，获得L-草铵膦。

为获得本发明方法所需的酶类，申请人构建了一个氨基酸脱氢酶库，该酶库的构建步骤为：(1)将本实验室保藏的野生菌进行活化培养，并按试剂盒操作说明进行全基因组的提取；(2)通过基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)查询不同菌株基因组中包含的氨基酸脱氢酶基因序列，并设计特异性引物进行合成；(3)通过PCR对不同菌种中的氨基酸脱氢酶基因进行扩增；(4)扩增产物通过酶切、酶连与表达载体进行连接；(5)酶连产物转化到表达宿主中；(6)测序验证重组菌是否构建成功；(7)构建成功重组菌，编号，放入-80℃冰箱保藏备用。

上述氨基酸脱氢酶库中所包含的氨基酸脱氢酶根据其底物特异性可分为谷氨酸脱氢酶(GluDH)、丙氨酸脱氢酶(AlaDH)、亮氨酸脱氢酶(LeuDH)、缬氨酸脱氢酶(ValDH)，具体来源和序列见实施例的表3和表4。

其中，所述谷氨酸脱氢酶来源于Pseudomonas entomophila str.L48、Pseudomonas putida KT2440或Bordetella prtrii DSM12804。

进一步地，所述谷氨酸脱氢酶的NCBI登录号为WP_044487662.1、NP_742836.1或WP_012247444.1。

更优选，所述谷氨酸脱氢酶的NCBI登录号为WP_012247444.1；采用该氨基酸序列的谷氨酸脱氢酶作为催化剂，催化获得的L-草铵膦产率高达99.2％，ee值达到99％以上。

作为优选，所述细胞为表达氨基酸脱氢酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

具体地，所述工程菌含有表达载体pET-28a(+)，所述氨基酸脱氢酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上。

反应体系中，催化剂的使用形式为细胞破碎后的粗酶液，也可以为表达重组酶的工程菌静息细胞，还可以采用纯化后的纯酶，或者是经固定化后的酶。

作为优选，反应体系中，催化剂的添加量以10000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的0.5～15％。

作为优选，所述无机氨基供体为氨水、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵；无机氨基供体的添加量为0.05～1.5M。

作为优选，反应体系中，所述底物的浓度为10～100mM。

具体地，所述还原型辅酶为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；还原型辅酶的添加量为10～100mM。

上述反应体系中，可通过辅酶再生系统实现辅酶的再生。具体地，反应体系中还包括辅酶再生系统，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

作为优选，所述辅酶再生系统为以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统。

所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168，NCBI登录号为NP_388275.1；醇脱氢酶来源于Lactobscillus kefir DSM20587，NCBI登录号为AAP94029.1。

作为优选，反应体系中，所述辅酶再生系统的葡萄糖脱氢酶添加量(质量分数)为反应液重量的0.5～15％，葡萄糖添加量为10～200mM；或者，醇脱氢酶添加量(质量分数)为反应液重量的0.5～15％，异丙醇添加量为10～200mM。

作为优选，所述还原胺化反应的温度为20～70℃，时间为6～72h，反应液的pH值为6～9。更优选，所述温度为30～60℃，时间为12～36h。采用缓冲液实现pH的稳定，所述缓冲液为pH 6～8磷酸盐缓冲液与pH 8～9Tris-HCl缓冲液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体与辅酶存在时，通过氨基酸脱氢酶催化底物发生氨化还原反应直接制备手性纯的L-草铵膦，该方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯且手性纯度较高。

(2)本发明方法与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，且获得的产物易于从反应液中分离提纯。

附图说明

图1为利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的反应式。

图2为利用氨基酸脱氢酶与辅酶再生酶双酶耦联制备L-草铵膦的反应式。

图3为底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的标样高效液相检测图谱(非手性分析，5mM)；

其中，底物PPO的保留时间为9.7min。

图4为外消旋草胺膦标样柱前衍生化高效液相图谱(手性分析，0.5mM)；

其中，保留时间：L-草铵膦为6.2min，D-草铵膦为7.3min。

图5为实施案例18中的反应进程图。

图6为实施案例18中反应液(反应结束后)的高效液相检测图谱(非手性分析)。

图7为实施案例18中反应液(反应结束后)柱前衍生化高效液相检测图谱(手性分析)。

图8为原料2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的质谱图；

其中，A图为PPO的正源质谱图；B图为PPO的负源质谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自Novagen公司；DNAmarker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为人工合成，其质谱图如图8所示；D，L-草铵膦、L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADH与NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的结构式如式(1)所示；L-草铵膦(简称L-PPT)的结构式如式(2)所示；具体如下：

本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析反应液中底物的浓度，监测反应的进行。HPLC分析方法为：色谱柱型号：QS-C18,5μm,4.6×250mm。流动相：50mM(NH₄)₂HPO₄,加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸(质量分数)调pH至3.6，加入8％乙腈。检测波长：205nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃。底物出峰情况见，附图3。

产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18,5μm,4.6×250mm。流动相：50mM乙酸钠溶液：乙腈＝8：0.5。检测波长：338nm。流速：0.85mL/min。柱温：30℃。

(2)衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1g N-乙酰-L-半胱氨酸，用400uL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。

(3)衍生化反应与测定：取100μl样品加入150μl衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μl进行分析。

D-草铵膦与L-草铵膦的出峰情况，见附图4。

实施例1氨基酸脱氢酶的构建

一、野生菌的活化及基因组提取

所有野生菌均使用LB培养基进行活化与培养，配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。

将保存有野生菌的甘油管划线至含有LB固体培养基的平皿上，30℃静置培养2～3天。从平皿上挑取菌落接入含有50mL LB培养基的三角瓶中，30℃、200rpm培养2～3天。在获得培养液后，根据基因组提取试剂盒的操作说明书进行全基因组的提取。所得基因组可直接用于目的基因的扩增也可置于-20℃长期保存。

二、目的基因的扩增

分别从大肠杆菌E.coli K12W3110、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus ATCC 14579、谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032等野生菌的基因组中克隆氨基酸脱氢酶的基因。通过查询这些野生菌在基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)登陆的全基因组序列，找到其中编码氨基酸脱氢酶的基因序列，设计特异性引物。以克隆来自大肠杆菌E.coli K12W3110中的谷氨酸脱氢酶(E₁)与来自Bacillus subtilis168的亮氨酸脱氢酶(E₃)为例，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号分别为NC_007779.1和NC_000964.3)中注释为氨基酸脱氢酶的蛋白质的核酸序列，设计相应的PCR上游引物和下游引物。

来源于E.coli的谷氨酸脱氢酶的引物：

E₁-F序列：5’-CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGG-3’(BamHI)

E₁-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAAATCACACCCTGCGCCA-3’(XhoI)

来源于Bacillus Subtilis的转氨酶的引物：

E₃-F序列：5’-CGCGGATCCATGGAACTTTTTAAATATATGG-3’(BamHI)

E₃-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAACGTCTGCTTAATACAC-3’(XhoI)

在上、下游引物中分别加入限制性内切酶切位点，如下划线所示，具体限制性内切酶见引物序列括号内。分别以大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168基因组为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)后延伸：72℃10min；

4)4℃保存。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1400bp与1100bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

二、表达载体和工程菌的构建

表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶在37℃双酶切3H。酶切体系如表1所示：

表1酶切体系

酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表1所示：

表2pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系

将酶连产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂平板、挑单菌落至LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。验证后无误的基因工程菌即为重组氨基酸脱氢酶表达菌株，加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃保藏备用。下表为构建的氨基酸脱氢酶库：

表3所构建氨基酸脱氢酶库

*GluDH:谷氨酸脱氢酶；LeuDH：亮氨酸脱氢酶；AlaDH：丙氨酸脱氢酶；ValDH：缬氨酸脱氢酶。以上编号用于区分各氨基酸脱氢酶，因各氨基酸脱氢酶均具有NCBI登录号，故未在序列表中列出。

实施例2菌体的培养及粗酶液的制备

一、菌体的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有氨基酸脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃下诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。

二、粗酶液的制备

将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，400W功率超声破碎30次，每次超声持续3S，间歇7S。将此细胞破碎液12000g 4℃离心3min去除沉淀，得到的上清为含重组氨基酸脱氢酶的粗酶液。

实施例3酶库酶活的测定

标准酶活检测体系：25g/L湿菌体(超声波破碎)、10mM底物、20mM辅酶(NADH或NADPH)、750mM NH₄Cl，总体系为400μL，反应介质为pH 8.0磷酸盐缓冲液。单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol L-草铵膦所需要的酶量。

按照上述标准酶活检测体系配置反应溶液，于30℃金属浴振荡反应器内反应6H，加入40μL 5M NaOH终止反应后置于冰上保存。样品稀释一定倍数后利用柱前衍生化高效液相检测其L-草铵膦的浓度，并计算酶活。

表4酶库酶活测定结果

注释：1：N.D为未检测出酶活；2：unkwn表示辅酶特异性未知，检测酶活时分别添加NADH或NADPH。

实施例4菌体的大规模制备

因L-草铵膦的制备实验中，需使用大量的生物催化剂，因此要进行菌体的大规模制备。所用培养基为LB培养基，具体配方见实施例2。

将保藏有重组酶工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1L同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃下诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。

粗酶液的制备见实施例2。

实施例5谷氨酸脱氢酶(E₁)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₁的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NADPH、NH₄Cl到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，加入20mL粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为20mM，NADPH的终浓度为20mM，NH₄ ⁺为0.5M，湿菌体浓度为20g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，反应时间为24h后利用非手性液相色谱检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余4.3mM，转化率78.5％。L-PPT的生成浓度为15.3mM，产率为76.5％，产物ee值达99％以上。

实施例6谷氨酸脱氢酶(E₂)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₂的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余11.5mM，转化率42.5％。L-PPT的生成浓度为8.3mM，产率为41.5％，产物ee值达99％以上。

实施例7亮氨酸脱氢酶(E₃)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达亮氨酸脱氢酶E₃的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NADH、NH₄Cl到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，加入20mL粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为20mM，NADH的终浓度为20mM，NH₄ ⁺为0.5M，湿菌体浓度为20g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，反应时间为24h后利用非手性液相色谱检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余17.6mM，转化率12.0％。L-PPT的生成浓度为2.08mM，产率为10.4％，产物ee值达99％以上。

实施例8谷氨酸脱氢酶(E₄)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₄的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NADPH、NH₄Cl到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，加入20mL粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为20mM，NADPH的终浓度为20mM，NH₄ ⁺为0.5M，湿菌体浓度为25g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，反应时间为24h后利用非手性液相色谱检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余0mM，转化率100％。L-PPT的生成浓度为19.5mM，产率为97.5％，产物ee值达99％以上。

实施例9谷氨酸脱氢酶(E₅)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₅的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NADPH、NH₄Cl到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液至pH＝8.0，加入20mL粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为20mM，NADPH的终浓度为20mM，NH₄ ⁺为0.5M，湿菌体浓度为25g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，反应时间为24h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余0mM，转化率100％。L-PPT的生成浓度为19.57mM，产率为97.9％，ee值达99％以上。

实施例10丙氨酸脱氢酶(E₇)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达丙氨酸脱氢酶E₇的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NADH、NH₄Cl到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液至pH＝8.0，加入20mL粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为20mM，NADH的终浓度为20mM，NH₄ ⁺为0.5M，湿菌体浓度为25g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，反应时间为24h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余18.1mM，转化率9.5％。L-PPT的生成浓度为1.8mM，产率为9.0％，ee值达99％以上。

实施例11缬氨酸脱氢酶(E₉)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达缬氨酸脱氢酶E₉的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余19.8mM，转化率1％。L-PPT的生成浓度为0.0mM。

实施例12谷氨酸脱氢酶(E₁₀)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₁₀的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余5.2mM，转化率74％。L-PPT的生成浓度为14.1mM，产率为70.5％，ee值达99％以上。

实施例13谷氨酸脱氢酶(E₁₁)单酶制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₁₁的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余0mM，转化率100％。L-PPT的生成浓度为19.7mM，产率为98.5％，ee值达99％以上。

实施例14谷氨酸脱氢酶(E₄)，葡萄糖糖脱氢酶(来源于枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis 168，NCBI登录号为NP_388275.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够谷氨酸脱氢酶(E₄)和葡萄糖糖脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NH₄Cl、葡萄糖到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液至pH＝8.0，加入10mL谷氨酸脱氢酶粗酶液与10mL醇脱氢酶粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为50mM，NADP⁺的终浓度为1mM，NH₄ ⁺为0.5M，葡萄糖浓度为100mM，谷氨酸脱氢酶湿菌体浓度为20g/L，醇脱氢酶湿菌体浓度为10g/L，通过水浴控制反应温度为37℃。反应时间24h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余1.7mM，转化率96.6％。L-PPT的生成浓度为48.1mM，产率为96.2％，ee值达到99％以上。

实施例15谷氨酸脱氢酶(E₄)，醇脱氢酶(Lactobscillus kefir DSM20587，NCBI登录号为AAP94029.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₄和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NH₄Cl、异丙醇到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液至pH＝8.0，加入10mL谷氨酸脱氢酶粗酶液与10mL醇脱氢酶粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为50mM，NADP⁺的终浓度为1mM，NH₄ ⁺为0.5M，异丙醇浓度为100mM，谷氨酸脱氢酶湿菌体浓度为20g/L，醇脱氢酶湿菌体浓度为20g/L，通过水浴控制反应温度为37℃。反应时间24h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余6.3mM，转化率87.4％。L-PPT的生成浓度为42.3mM，产率为84.6％，ee值达到99％以上。

实施例16谷氨酸脱氢酶(E₅)，葡萄糖糖脱氢酶(来源于枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis 168，NCBI登录号为NP_388275.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₅和葡萄糖糖脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余0.3mM，转化率99.4％。L-PPT的生成浓度为49.1mM，产率为98.2％，ee值达到99％以上。

实施例17谷氨酸脱氢酶(E₅)，醇脱氢酶(Lactobscillus kefir DSM20587，NCBI登录号为AAP94029.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₅和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余3.7mM，转化率92.6％。L-PPT的生成浓度为45.6mM，产率为91.2％，ee值达到99％以上。

实施例18谷氨酸脱氢酶(E₁₁)，葡萄糖脱氢酶(来源于枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis 168，NCBI登录号为NP_388275.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₁₁和葡萄糖脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

定量称取PPO、NH₄Cl、葡萄糖到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液至pH＝8.0，加入10mL谷氨酸脱氢酶粗酶液与10mL葡萄糖脱氢酶粗酶液，用100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液定容到100mL，使PPO的终浓度为50mM，NADP⁺的终浓度为1mM，NH₄ ⁺为0.5M，葡萄糖浓度为100mM，谷氨酸脱氢酶湿菌体浓度为20g/L，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为10g/L。通过水浴控制反应温度为37℃；磁力搅拌，非手性HPLC监测反应进行，其反应进程如附图5所示。

反应时间24h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查L-PPT的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余0mM，转化率100％。L-PPT的生成浓度为49.6mM，产率为99.2％，ee值达到99％以上。

反应液样品(24h)高效液相检测图谱(非手性分析)见附图6，反应液(24h)柱前衍生化HPLC检测图谱(手性分析)见附图7。

实施例19谷氨酸脱氢酶(E₁₁)，醇脱氢酶(Lactobscillus kefir DSM20587，NCBI登录号为AAP94029.1)双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例4的方法培养能够表达谷氨酸脱氢酶E₁₁和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应结束数据如下：PPO剩余0mM，转化率100％。L-PPT的生成浓度为49.3mM，产率为98.6％，ee值达到99％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tggatcagac atattctctg g 31

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt taaatcacac cctgcgcca 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tggaactttt taaatatatg g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt taacgtctgc ttaatacac 29

Claims

1.一种利用氨基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在无机氨基供体及还原型辅酶存在的条件下，利用离体的谷氨酸脱氢酶或体外表达谷氨酸脱氢酶的细胞作为催化剂，进行还原胺化反应，获得L-草铵膦；

所述谷氨酸脱氢酶来源于Pseudomonas entomophila str.L48、Pseudomonas putidaKT2440或Bordetella prtrii DSM12804。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶的NCBI登录号为WP_044487662.1、NP_742836.1或WP_012247444.1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶的NCBI登录号为WP_012247444.1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞的添加量为反应液重量的0.5～15％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机氨基供体为氨水、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵；无机氨基供体的添加量为0.05～1.5M。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述底物的浓度为10～100mM。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述还原型辅酶为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；还原型辅酶的添加量为10～100mM。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括辅酶再生系统，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原胺化反应的温度为20～70℃，时间为6～72h，反应液的pH值为6～9。