CN107502647B

CN107502647B - 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法

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Publication number: CN107502647B
Application number: CN201710834958.4A
Authority: CN
Inventors: 杨立荣; 周海胜; 居述云; 尹新坚; 徐刚; 吴坚平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: CN107502647A

Abstract

本发明公开了一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，该方法以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系由D‑氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明方法以外消旋D,L‑草铵膦为原料，利用D‑氨基酸氧化酶将D‑草铵膦氧化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，L‑草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L‑草铵膦，进而实现了D,L‑草铵膦的原位去消旋化，得到的L‑草铵膦中无其他副产物，产品总收率≥99％，光学纯度可超过99％。

Description

一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法；具体地说，是关于一种生物催化法拆分草铵膦消旋混合物制备光学纯L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是由Hoechst公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱灭生性除草剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大，占整个除草剂市场的六七成，尤其是在热带、亚热带地区，使用量巨大。目前，世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。在市场使用量方面，草甘膦独占鳌头，近年来全球年使用量在85万吨左右；百草枯紧随其后，2015年的市场份额10万吨左右；而目前草铵膦产量很小，2015年国内产能只有0.6-0.7万吨。

然而，前两大除草剂都遇到了极大的问题：草甘膦的长期大量使用，一是造成大量杂草产生抗性，使草甘膦趋于失效；二是造成严重水土流失和土壤板结；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部等多部委联合发布的1745号公告已说明，百草枯水剂在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用。百草枯退市后，其国内近5万吨的市场空白将极有可能被草铵膦替代。更重要的是，草铵膦乃全球第二大转基因作物的耐受除草剂，使用量仅次于草甘膦，由于作用机理不同，可除去对草甘膦产生抗性的杂草。随着转基因技术的发展，抗草铵膦作物的种类和种植面积会进一步增多，草铵膦完全有可能与草甘膦并驾齐驱，甚至成为除草剂中的第一大品种。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。但目前大规模工业化生产的的草铵膦都是外消旋混合物，产品中的一半是不起药效作用的D-草铵膦，这极大降低了生产草铵膦的原子经济性、增加了生产成本、增大了环保压力。拆分草铵膦消旋混合物并将其中的D-草铵膦加以再利用，具有重要的市场前景和社会价值。

现有拆分消旋混合物的方法主要分为化学手性拆分和生物催化手性拆分。

化学手性拆分法是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂，进行D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。1998年，Hoechst公司报道了草铵膦消旋体的化学拆分法。将草铵膦消旋体与奎宁成盐后结晶，过滤洗涤后得到高纯度的L-草铵膦酸奎宁盐，再用氨中和得到L-草铵膦。收率最高为86％，e.e.值最高为99％(美国专利US5767309)。但化学法拆分工艺存在以下缺点，一是需要使用昂贵的手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率不超过50％，需要多次拆分才能达到高收率，工艺过程复杂而不利于大规模工业化生产。

生物催化手性拆分法是一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、再消旋后、再进行酶催化反应。

美国专利(US8981142)利用腈水解酶(图1)，水解10g/L的2-氨基-4(羟基乙基磷酰基)-丁氰，30℃反应24h，转化率为21％，但未测定产物的光学纯度。中国专利(CN103275896)以外消旋的2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁氰为底物，同样利用腈水解酶，30℃反应24h，得到L-草铵膦的光学纯度为95％，转化率未知。

美国专利(US6686181-B1，US5756800)利用乙酰氨基水解酶(图2)，水解N-苯乙酰草铵膦制备L-草铵膦，L-构型N-苯乙酰草铵膦转化率83％，产品ee值66％。

美国专利(US5618728)酰胺酶(图3)，利用酰胺酶制备L-草铵膦的方法。他们利用从土壤中筛选到的Enterobacteraerogenes 9164L-酰胺酶水解(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺制备得到L-草铵膦，同时释放NH₃；28℃下振荡15h，转化液中L-草铵膦的ee值为95.7％。

这类生物拆分工艺存在明显的缺陷：首先，需要合成草铵膦衍生物，再进行酶催化反应，而不是直接拆分D,L-草铵膦；其次，L-草铵膦与未反应的D-构型衍生物难以分离，产品光学纯度不高；再者，D-构型衍生物分离后还是需要再消旋化、进行循环拆分，导致工艺过程复杂、产品收率低，与化学法拆分相比并不具有优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的拆分消旋混合物制备L-草铵膦的方法。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低，易于工业化。

具体的，本发明提供的技术方案如下：

一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系由D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。

具体原理为：采用一锅化的多酶催化体系，以外消旋D,L-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦不参与反应而完全保留；接着，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸被氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，从而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到光学纯的L-草铵膦。氨基酸脱氢酶在实现催化作用时需要NADH或NADPH作为辅酶，反应后生成NAD⁺或NADP⁺；由于辅酶价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD(P)⁺为NAD(P)H。反应原理见附图4。

为获得本发明方法所需的对D-草铵膦有催化作用的D-氨基酸氧化酶，构建一个D-氨基酸氧化酶酶库，该酶库的构建步骤为：

(1)通过已知常用的D-氨基酸氧化酶基因序列，如来源于红酵母(Rhodotorulagracilis)ATCC26217的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，从NCBI数据库中筛选与RgDAAO相似度较高的基因序列；

(2)将上述D-氨基酸氧化酶的基因序列，经密码子优化后送基因合成公司进行全基因合成；

(3)将合成的基因克隆到重组表达质粒上；

(4)重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，构建成功重组菌。

从构建的D-氨基酸氧化酶酶库中筛选得到来源于粗糙脉孢菌的D-氨基酸氧化酶对D-草铵膦有催化活力。具体的，所述D-氨基酸氧化酶来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)OR74A，NCBI登录号为XP_964990.2，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

作为优选，所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶，来源于Pseudomonas entomophilastr.L48、Pseudomonas putida KT2440或Bordetella prtrii DSM12804，NCBI登录号依次为WP_044487662.1、NP_742836.1或WP_012247444.1。

本发明中，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NA(P)D⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

作为优选，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)DSM319；所述醇脱氢酶为来源于乳酸杆菌(Lactobacillus kefiri)DSM20587；所述甲酸脱氢酶为来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii。

具体的，本发明方法的添加方法为：配置一定浓度的D,L-草铵膦(即2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸铵)溶液，再以酶活力为单位，加入D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶以及辅酶再生底物，恒温搅拌或振荡直至D-草铵膦完全转化。

作为优选，催化体系中，所述D-氨基酸氧化酶的添加量为0.1～100U/L；所述氨基酸脱氢酶的添加量为0.1～100U/L；所述辅酶的添加量为0.1～100U/L；更优选，上述三种酶的添加量均为1～20U/L。

作为优选，催化体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～96h；更优选，温度为30～60℃，时间为12～72h。

作为优选，催化体系中，反应的pH值为6～9。采用氢氧化铵(氨水)来调节控制pH；反应过程需要通入空气或氧气。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法以外消旋D,L-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，进而实现了D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到的L-草铵膦中无其他副产物，产品总收率≥99％，光学纯度可超过99％。

(2)本发明方法能够直接以D,L-草铵膦为原料进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵磷进行分离、再消旋、再拆分等步骤。

(3)本发明方法极大的简化了现有D,L-草铵膦的拆分工艺，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。

附图说明

图1为氰基水解酶拆分法生产L-草铵膦的反应式。

图2为乙酰氨基酸水解酶拆分法生产L-草铵膦的反应式。

图3为酰胺酶拆分法生产L-草铵膦的反应式。

图4为本发明方法(实施例3～6)所采用的多酶体系拆分法生产L-草铵膦的反应式。

图5为2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的核磁图谱¹H-NMR。

图6为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的核磁图谱¹H-NMR。

图7为实施例3的反应物和产物的高效液相检测图谱；

其中，1：保留时间:3.868min为草铵膦(即2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)；2：保留时间:5.034min为未知杂质；3：保留时间:6.569min为未知杂质；4：保留时间:7.183为未知杂质；5：保留时间:9.718min为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。

图8为对比例2的草铵膦两个光学异构体的高效液相检测图(柱前衍生化HPLC法)；

其中，1：保留时间5.490min为D-草铵膦；2：保留时间:6.255min为L-草铵膦。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为实验室合成，其核磁谱图如图6所示；D,L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

下列实施例的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/40℃；流速/1mL/min；检测波长/UV205nm；流动相：50mM(NH₄)₂HPO4，加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸调pH至3.6，加入8％乙腈。具体各相关物质出峰情况见附图7。

通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量，手性HPLC分析方法为：色谱柱/

QS-C18；流动相/50mM乙酸钠溶液:乙腈＝8:0.5；检测波长/338nm；流速/0.85mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μL进行分析。D-草铵膦和L-草铵膦出峰情况见附图8。

实施例1基因工程菌的构建

一、D-氨基酸氧化酶库的构建与筛选以及表达D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

通过已知来源于红酵母(Rhodotorula gracilis)ATCC26217的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，NCBI登录号为AAB51107.1(Jorge Alonso，et al.D-Amino-acid oxidase genefrom Rhodotorula gracilis(Rhodosporidium toruloides)ATCC26217.Microbiology(1998),144,1905-1101)，从NCBI数据库中筛选与RgDAAO相似度较高的基因序列。

将上述D-氨基酸氧化酶的基因序列，经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上。重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组D-氨基酸氧化酶的表达。

以D,L-草铵膦为底物，通过过氧化氢/邻联茴香胺比色法筛选对D-草铵膦具有催化活力的酶，结果如下：

表1D-氨基酸氧化酶的筛选

注：“+”代表显色反应阳性，有酶活；“－”代表显色反应阴性，无酶活；

二、表达谷氨酸脱氢酶的基因工程菌的构建

1、野生菌的活化及基因组提取

Pseudomonas entomophila str.L48、Pseudomonas putida KT2440和Bordetellaprtrii DSM12804野生菌均使用LB培养基进行活化与培养，配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。

将保存有野生菌的甘油管划线至含有LB固体培养基的平皿上，30℃静置培养2～3天。从平皿上挑取菌落接入含有50mL LB培养基的三角瓶中，30℃、200rpm培养2～3天。在获得培养液后，根据基因组提取试剂盒的操作说明书进行全基因组的提取。所得基因组可直接用于目的基因的扩增也可置于-20℃长期保存。

2、目的基因的扩增

分别从Pseudomonas entomophila str.L48、Pseudomonas putida KT2440和Bordetella prtrii DSM12804野生菌的基因组中克隆谷氨基酸脱氢酶的基因。通过查询这些野生菌在基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)登陆的全基因组序列，找到其中编码谷氨基酸脱氢酶的基因序列，设计特异性引物。分别以Pseudomonasentomophila str.L48、Pseudomonas putida KT2440和Bordetella prtrii DSM12804的基因组为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)后延伸：72℃10min；

4)4℃保存。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1400bp与1100bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

3、表达载体和工程菌的构建

表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶在37℃双酶切。酶切体系如表2所示：

表2酶切体系

酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表3所示：

表3pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系

将酶连产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂平板、挑单菌落至LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。验证后无误的基因工程菌即为重组谷氨基酸脱氢酶表达菌株，加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃保藏备用。下表为构建的谷氨基酸脱氢酶：

表4所构建的谷氨基酸脱氢酶

三、表达辅酶再生酶的基因工程菌的构建

从巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319基因组中克隆葡萄糖脱氢酶基因；从乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM20587基因组中克隆醇脱氢酶基因；从博伊丁假丝酵母Candida boidinii基因组中克隆甲酸脱氢酶基因，设计相应的PCR上游引物和下游引物。

来源于Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶的引物：

BGdh-F序列：5’-GAAGATCTGATGTATAAAGATTTAGAAGGAAAAGTC-3’(BglⅡ)

BGdh-R序列：5’-CCGCTCGAGTTATCCGCGTC-3’(XholI)

来源于Lactobacillus kefiri的醇脱氢酶的引物：

LAdh-F序列：5’-CCGAATTCATGACCGATCGTCTGAAGGGC-3’(EcoRI)

LAdh-R序列：5’-CCCAAGCTTTCACTGTGCGGTATACCCGCC-3’(HindIII)

来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的引物：

CFdh-F序列：5’-GGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCTTATACGGT-3’(BamHI)

CFdh-R序列：5’-TACGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTTACCGT-3’(SalI)

在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点，具体限制酶见引物序列括号内。分别以巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319、乳酸杆菌Lactobacillus kefiriDSM20587以及博伊丁假丝酵母Candida boidinii基因组DNA为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小为1400bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表1所示：

表1pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系

将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16℃金属浴中连接12h。将酶连产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由基因测序公司来验证插入序列的正确性。再将重组表达质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误即用作表达所述酶的基因工程菌。

实施例2

1.微生物的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.1～0.3mM，18～28℃下诱导培养20h左右。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。

2.粗酶液的制备

将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5,20mM咪唑,0.3M NaCl,5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为粗酶液。

3.酶活力的测定

酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(25℃)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

D-氨基酸氧化酶的酶活测定：取底物溶液(20mM D,L-草铵膦溶液)250μL，加入0.1M的NH3·NH4Cl缓冲溶液(pH＝8.0)200μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入50μL粗酶液，迅速取出用手震荡、迅速放回金属浴震荡器中，开始计时，25℃反应10min；反应10min后加入500μL 5％的盐酸，取出震荡混匀，反应终止；12000rpm离心三分钟，取上清液，用去离子水稀释10倍，进HPLC分析；根据HPLC测得的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸浓度数据，计算酶活。

谷氨酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(20mM 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)950μL，加入10mM NAD(P)H溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NAD(P)H摩尔吸光系数，即可计算酶活。

葡萄糖脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M葡萄糖溶液)950μL，加入10mM NAD(P)⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NAD(P)H摩尔吸光系数，即可计算酶活。

醇脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M异丙醇溶液)950μL，加入10mM NAD(P)⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NAD(P)H摩尔吸光系数，即可计算酶活。

甲酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M甲酸铵溶液)950μL，加入10mM NAD(P)⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NAD(P)H摩尔吸光系数，即可计算酶活。

实施例3

选取粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶、Pseudomonas putida KT2440来源的谷氨酸脱氢酶、巨大芽胞杆菌Bacillus megateriumDSM319来源的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

经微生物培养后收集细胞，获得粗酶液并测定酶活，具体方法参考实施例2，三种酶的粗酶液活分别为3.741U/L、22.17U/L、1012.65U/L

用0.1M的NH₃·NH₄Cl缓冲溶液(pH＝8.0)配置100mM的D,L-草铵膦溶液，同样用0.1M的NH₃·NH₄Cl缓冲溶液(pH＝8.0)配置100mM的葡萄糖溶液，分别取100mM的D,L-草铵膦溶液150μL，100mM的葡萄糖溶液180μL，加入2mL EP管中，再加入D-氨基酸氧化酶粗酶液700μL、谷氨酸脱氢酶粗酶液165μL、葡萄糖脱氢酶粗酶液5μL，加入10mM的NADP⁺溶液300μL，将EP管置于37℃恒温金属浴振荡器中震荡反应，用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查D-草铵膦和L-草铵膦的浓度以及产品草铵膦的ee值。

反应48小时后，数据如下：PPO剩余0mM，D-草铵膦转化率97.8％。L-PPT的生成浓度为9.89mM，产品草铵膦ee值为98.9％。

实施例4

选取粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶、Bordetellaprtrii DSM12804来源的谷氨酸脱氢酶、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319来源的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

经微生物培养后收集细胞，获得粗酶液并测定酶活，具体方法参考实施例2，三种酶的粗酶液活分别为3.741U/L、35.54U/L、1012.65U/L

将含有D,L-草铵膦约20mM、葡萄糖约24mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到7.5，再加入NADP⁺0.1mM；然后依次加入D-氨基酸氧化酶5U/L、谷氨酸脱氢酶粗酶液6U/L、葡萄糖脱氢酶粗酶液6U/L，水浴控制反应温度30℃，开启搅拌，以鼓泡的方式缓慢通入压缩空气于液面以下，用氨水控制pH＝7.5，反应40小时，液相检测PPO为0mM，D-草铵膦转化率97.5％。L-PPT的生成浓度为19.75mM，产品草铵膦ee值为98.8％。

实施例5

选取粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶、Bordetellaprtrii DSM12804来源的谷氨酸脱氢酶、乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM20587来源的醇脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

经微生物培养后收集细胞，获得粗酶液并测定酶活，具体方法参考实施例2，三种酶的粗酶液活分别为3.741U/L、35.54U/L、152.79U/L

将含有D,L-草铵膦约20mM、葡萄糖约24mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到8.5，再加入NADP⁺0.2mM；然后依次加入D-氨基酸氧化酶5U/L、谷氨酸脱氢酶粗酶液6U/L、醇脱氢酶粗酶液10U/L，水浴控制反应温度35℃，开启搅拌，以鼓泡的方式缓慢通入压缩空气于液面以下，用氨水控制pH＝8.5，反应64小时，液相检测PPO为0mM，D-草铵膦转化率98.1％。L-PPT的生成浓度为19.81mM，产品草铵膦ee值为99.1％。

实施例6

粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶、Bordetellaprtrii DSM12804来源的谷氨酸脱氢酶、博伊丁假丝酵母Candida boidinii来源的甲酸脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

经微生物培养后收集细胞，获得粗酶液并测定酶活，具体方法参考实施例2，三种酶的粗酶液活分别为3.741U/L、35.54U/L、47.03U/L

将含有D,L-草铵膦约20mM、葡萄糖约24mM的溶液置于磁力10L发酵罐中，用30％氨水调节溶液pH到8.0，再加入NADP⁺0.05mM；然后依次加入D-氨基酸氧化酶10U/L、谷氨酸脱氢酶10U/L、甲酸脱氢酶12U/L，水浴控制反应温度40℃，开启搅拌，缓慢通入纯氧，用氨水控制pH＝8.0，反应24小时，液相检测PPO为0mM，D-草铵膦转化率99.4％。L-PPT的生成浓度为19.94mM，产品草铵膦ee值为99.7％。

对比例1

粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶、Bordetellaprtrii DSM12804来源的谷氨酸脱氢酶、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319来源的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

将含有D,L-草铵膦20mM、葡萄糖24mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到7.5；然后加入D-氨基酸氧化酶5U/L、水浴控制反应温度30℃，开启搅拌，以鼓泡的方式缓慢通入压缩空气于液面以下，用氨水控制pH＝7.5，反应108小时，液相检测PPO为7.63mM，D-草铵膦转化率76.3％。L-PPT的生成浓度为12.60mM，产品草铵膦ee值为80.8％。

对比例2

选取表1中除了粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A来源的D-氨基酸氧化酶以外其他的D-氨基酸氧化酶、Pseudomonas entomophila str.L48来源的谷氨酸脱氢酶、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319来源的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。

用0.1M的NH₃·NH₄Cl缓冲溶液(pH＝8.0)配置100mM的D,L-草铵膦溶液，同样用0.1M的NH₃·NH₄Cl缓冲溶液(pH＝8.0)配置100mM的葡萄糖溶液，分别取100mM的D,L-草铵膦溶液75μL，100mM的葡萄糖溶液90μL，加入2mL EP管中，再加入D-氨基酸氧化酶粗酶液1060μL、谷氨酸脱氢酶粗酶液24.5μL、葡萄糖脱氢酶粗酶液0.5μL，加入10mM的NADP⁺溶液150μL，将EP管置于37℃恒温金属浴振荡器中震荡反应，用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检查D-草铵膦和L-草铵膦的浓度以及产品草铵膦的ee值。

反应7天后，数据如下：没有检测到PPO的生产，D-草铵膦转化率为0％，产品草铵膦ee为0，原料D,L-草铵膦并没有去消旋化。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法

<140> 2017108349584

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagatctga tgtataaaga tttagaagga aaagtc 36

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgctcgagt tatccgcgtc 20

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgaattcat gaccgatcgt ctgaagggc 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt cactgtgcgg tatacccgcc 30

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatccatga agatcgtttt agtcttatac ggt 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacgtcgact tatttcttat cgtgttttac cgt 33

<210> 7

<211> 439

<212> PRT

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) OR74A (Neurospora crassa)

<400> 7

Met His Leu Arg Phe Pro Thr Thr Thr Thr Tyr Ser Leu Arg Pro Ser

1 5 10 15

Ser Thr Arg Thr Ser Pro Pro Pro Leu Ile Val Ser Phe Ala Pro Arg

20 25 30

His Ser Ile Val Ser Tyr Thr Thr Ser Pro Arg Arg Leu Phe Ser Ile

35 40 45

Ile Met Ser Glu Pro Lys Gly His Val Val Val Ile Gly Ala Gly Val

50 55 60

Ile Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ala Leu Leu Glu Ala Asn Tyr Ala Thr

65 70 75 80

Thr Ile Leu Ala Lys Asp Leu Pro Ala Pro Phe Glu Ser Ile Asp Pro

85 90 95

Arg Ser Gln Ile Asn Phe Thr Ser Pro Trp Gly Gly Ala His Asn Arg

100 105 110

Trp Val Pro Pro Phe Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Pro Leu

115 120 125

Thr Pro Thr Gln Gln Ala Glu His Ala Leu Arg Ile Arg Glu His Ala

130 135 140

Phe Ser Leu Ser Thr Phe His Arg Met Gln Leu Phe Gln Ser Gln Gly

145 150 155 160

Gln Asp Gln Gln Ala Gly Ile Thr Phe Leu Lys Gly Ile Glu Tyr Leu

165 170 175

Glu Ser Pro Gly Pro Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Pro Gln Arg Ala Ser

180 185 190

Gln Glu Leu Gly Leu Pro Gly His Phe Arg Val Leu Glu Thr His Glu

195 200 205

Phe Pro Asp Asp Lys Val Gln Trp Gly Cys Glu Tyr Asp Thr Trp Cys

210 215 220

Val Asn Pro Met Gln Tyr Cys Leu Phe Leu Leu Gly Gln Ile Ile Ala

225 230 235 240

Arg Gly Gly Lys Val Phe Lys Arg Asp Val Arg Ser Val Ala Glu Val

245 250 255

Phe Gln Leu Phe Ser Asp Ser Val Gln Glu Phe Gly Ala Thr Ile Pro

260 265 270

Pro Ala Asp Ala Val Val Asn Ala Thr Gly Ile Gly Leu Gly Asp Asp

275 280 285

Glu Met Val Phe Pro Thr Arg Gly Gln Thr Cys Leu Val Gln Glu Pro

290 295 300

Cys Asp Ala Thr Val Thr Arg Gln Asn Ala Asp Gly Thr Trp Thr Phe

305 310 315 320

Cys Val Pro Arg Gly Phe Lys Ala Gly Thr Ile Ile Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Glu Pro Asp Asn Trp Asp Pro Lys Pro Asp Pro Glu Val Arg Glu Arg

340 345 350

Leu Leu Arg Ala Phe Glu Gly Thr Tyr Pro Arg Ile Leu Ala Asp Gly

355 360 365

Lys Thr Arg Leu Thr Pro Val Arg Asp Ile Val Gly Arg Arg Pro Thr

370 375 380

Arg Lys Gly Gly Leu Arg Leu Glu Gly Glu Val Val Asp Gly Ala Gly

385 390 395 400

Phe Val Met His Ala Tyr Gly Leu Gly Gly Arg Gly Tyr Glu Leu Ser

405 410 415

Trp Gly Val Ala Glu Gly Val Ile Glu Gly Ile Gln Gly His Leu Glu

420 425 430

Ser Glu Lys Gly Ser Arg Leu

435

Claims

1.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系为一锅化的多酶催化体系，由D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成；所述D-氨基酸氧化酶来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)OR74A，NCBI登录号为XP_964990.2；所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶来源于Pseudomonasentomophila str.L48、Pseudomonas putida KT2440或Bordetella prtrii DSM12804。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)DSM319；所述醇脱氢酶为来源于乳酸杆菌(Lactobacilluskefiri)DSM20587；所述甲酸脱氢酶为来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，催化体系中，所述D-氨基酸氧化酶的添加量为0.1～100U/L；所述氨基酸脱氢酶的添加量为0.1～100U/L；所述辅酶再生酶的添加量为0.1～100U/L。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，催化体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～96h。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，催化体系中，反应的pH值为6～9。