CN113088501B - 一种用于生产l-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及l-草铵膦生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于生产L‑草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体，属于基因工程技术领域，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.11所示。本发明还公开了一种L‑草铵膦的生产方法，以2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸作为原料，添加NH4 +、辅酶NADH/NAD+，然后使用所述谷氨酸脱氢酶突变体进行催化，谷氨酸脱氢酶用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑丁酸还原胺化为L‑草铵膦。本发明方法开发得到了大量的谷氨酸脱氢酶突变体基因，这些谷氨酸脱氢酶突变体可以利用价格较低的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH或NAD+)作为辅酶制备L‑草铵膦，底物转化率≥99％，产品光学纯度超过99％，反应条件温和，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱氢酶突变体及其在制备L-草铵膦中的应用。
背景技术
草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种广谱灭生性除草剂。
目前，世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。目前，前两大除草剂都遇到了极大的问题：草甘膦的长期大量使用，一是造成大量杂草产生抗性，使草甘膦趋于失效；二是造成严重水土流失和土壤板结；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用。草铵膦由于其环境相容度高、几乎没有动物毒性等优点，是草甘膦和百草枯的最佳替代者。更重要的是，随着转基因技术的发展，抗草铵膦作物的种类和种植面积会进一步增多，草铵膦将具备更广阔的的市场前景。
但目前大规模工业化生产的的草铵膦都是外消旋混合物，产品中的一半是不起药效作用的D-草铵膦，这极大降低了生产草铵膦的原子经济性、增加了生产成本、增大了环保压力。制备光学纯的L-草铵膦具有重要的经济和社会价值。
制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：化学不对称合成法、手性拆分法以及生物催化法。
化学不对称合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，其工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂和催化剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。手性拆分法主要存在以下缺点，一是需要使用手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，四是工艺比较复杂。
相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。
这类反应中的代表就是酶催化的还原胺化，涉及到的酶为谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2～4)。虽然自然界谷氨酸脱氢酶具有广泛的存在、是生命体中不可或缺的一种酶，然而谷氨酸脱氢酶底物选择性极为严格，天然存在的谷氨酸脱氢酶基本都不能催化制备L-草铵膦。专利CN110184246A通过基因工程改造、获得了一种酶活更高的谷氨酸脱氢酶突变体，谷氨酸脱氢酶突变体利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADHP或NADP+)作为辅酶来催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦，原料PPO转化率>99％，L-草铵膦浓度最高达到445mM(80.6g/L)，产品ee值>99％，但是具有能够催化制备L-草铵膦的酶依然有限，且谷氨酸脱氢酶是NADPH或NADP+辅酶依赖型，辅酶价格较为昂贵。
发明内容
针对现有技术中谷氨酸脱氢酶为NADPH或NADP+辅酶依赖型的问题。本发明提供了一种用于生产L-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体，利用该谷氨酸脱氢酶突变体构建基因工程菌，使用价格较低的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH或NAD+)作为辅酶，催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)制备L-草铵膦。
一种用于生产L-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体，所述谷氨酸脱氢酶突变体为下列之一：
(1)将GeneBank登录号为NC_003413.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第145位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1；
(2)将GeneBank登录号为NC_007493.2的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第148位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2；
(3)将GeneBank登录号为WP_033013982.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第153位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3；
(4)将GeneBank登录号为BAM47507.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第154位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4；
(5)将GeneBank登录号为NP_391659.2的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第154位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5；
(6)将GeneBank登录号为WP_029099571.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第155位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.6；
(7)将GeneBank登录号为WP_013084905.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第156位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.7；
(8)将GeneBank登录号为WP_003497202.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第164位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.8；
(9)将GeneBank登录号为BAM47507.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第368位缬氨酸突变为丙氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.9；
(10)将GeneBank登录号为WP_003497202.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第378位缬氨酸突变为丙氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.10；
(11)将GeneBank登录号为WP_012292398.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第144位缬氨酸突变为丙氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.11。
为获得本发明方法所需的对PPO具有催化作用的谷氨酸脱氢酶，构建了一个谷氨酸脱氢酶突变体的酶库，该酶库的构建步骤为：通过比较文献数据，获得对天然底物α-酮戊二酸(产物为L-谷氨酸)具有较高催化活力的、可以以NADH为辅酶的谷氨酸脱氢酶的原始基因序列；然后对各个原始基因设计定点突变引物，以带有目标基因(谷氨酸脱氢酶原始基因)的重组质粒作为模板，通过全质粒PCR引入突变、以获得对PPO有催化作用的谷氨酸脱氢酶突变体基因。
本发明还提供了所述的谷氨酸脱氢酶突变体的编码基因。
本发明还提供了包含所述编码基因的表达载体或基因工程菌。该基因工程菌可以使用包含所述编码基因的表达载体转染宿主细胞后获得。
本发明还提供了所述的谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦中的应用。
本发明还提供了一种L-草铵膦的生产方法，包括以下步骤：以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸作为原料，添加NH4 +、辅酶NADH/NAD+，然后使用谷氨酸脱氢酶突变体进行催化，谷氨酸脱氢酶用于将PPO还原胺化为L-草铵膦。
谷氨酸脱氢酶突变体通过消耗等当量的还原型辅酶NADH的同时，在无机氨的存在下将原料PPO还原胺化为L-草铵膦。还原型辅酶反应后生成氧化型辅酶NAD+，而氧化型辅酶将不再具有还原胺化活性；由于辅酶价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD+为NADH。将谷氨酸脱氢酶突变体基因和辅酶再生系统基因构建于基因工程菌内、通过基因表达获得相应的酶，用于催化制备光学纯L-草铵膦。
所述辅酶再生系统为下列之一：
(1)以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，葡萄糖为辅酶再生底物；
(2)以醇脱氢酶为辅酶再生酶，异丙醇为辅酶再生底物；
(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶，甲酸为辅酶再生底物。
PPO作为原料生产L-草铵膦过程中在谷氨酸脱氢酶作用下利用NADH辅酶提供还原力，产生NAD+，同时，辅酶再生底物在辅酶再生酶作用下消耗氧化型辅酶NAD+，产生还原型辅酶NADH，形成辅酶再生系统；添加辅酶NAD+时，辅酶再生酶催化辅酶再生底物，添加辅酶NADH时，谷氨酸脱氢酶催化PPO，优选的，首次加入NAD+启动催化反应。谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶来源于同一宿主细胞的细胞悬液或破胞粗酶液。
作为优选的辅酶再生酶，葡萄糖脱氢酶的编码基因NCBI登录号：WP_087960837.1；醇脱氢酶的编码基因NCBI登录号：NZ_JYNW01000069.1；甲酸脱氢酶的编码基因NCBI登录号：P33160.3。
谷氨酸脱氢酶突变体基因和辅酶再生酶基因构建于同一表达质粒，转入表达质粒工程菌宿主细胞，获得可以催化制备L-草铵膦的工程菌菌株，优选的，表达质粒为pET-28a(+)，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
优选的，所述底物PPO的浓度为100mM～500mM，辅酶再生底物的浓度为120mM～1000mM，辅酶的浓度为0.001mM～0.5mM。所述还原胺化反应的温度为15～60℃，反应液的pH值为6.0～9.5。
本发明具有的有益效果：本发明方法开发得到了谷氨酸脱氢酶突变体基因，谷氨酸脱氢酶突变体可以利用价格较低的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH或NAD+)作为辅酶来催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦，制备的L-草铵膦，底物转化率≥99％，产品光学纯度超过99％，反应条件温和，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。
附图说明
图1共表达辅酶再生酶和谷氨酸脱氢酶突变体的质粒图谱。
具体实施方式
上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为实验室合成；D，L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
下列实施例的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为色谱柱：AQ-C18；柱温：40℃；流速：1mL/min；检测波长：UV 205nm；流动相：50mM(NH4)2HPO4，加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸调pH至3.6，加入8％乙腈。
通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量，手性HPLC分析方法为：
(1)色谱条件：色谱柱：
QS-C18；流动相：50mM乙酸钠溶液:乙腈＝8:0.5；检测波长：338nm；流速：0.85mL/min；柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。
(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μL进行分析。
实施例1：微生物培养与酶活测定
1、微生物培养
(1)LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。LB液体固体培养基组成(平板)：在LB液体培养基的基础上加入琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，冷却到50-60℃，加入50μg/mL卡那霉素(Kan)，导入培养皿中，冷却凝固后待用。
将基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其浓度为0.3mM，28℃下诱导培养20h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。
2、酶活测定
将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5,20mM咪唑,0.3M NaCl,5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到上清为粗酶液。
(1)以α-酮戊二酸溶液为底物的谷氨酸脱氢酶酶活测定
取底物溶液(20mMα-酮戊二酸溶液，用氨水调pH到8.0)950μL，加入10mM NADH溶液25μL，置于金属浴震荡器中，35℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，计算酶活。
(2)以PPO溶液为底物的谷氨酸脱氢酶酶活测定
取底物溶液(20mM PPO溶液，用氨水调pH到8.0)950μL，加入10mM NADH溶液25μL，置于金属浴震荡器中，35℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。
(3)葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶酶活测定
葡萄糖脱氢酶底物醇脱氢酶底物和甲酸脱氢酶底物分别为0.1M磷酸盐缓冲液配置的葡萄糖溶液、异丙醇溶液和甲酸铵溶液。
取相应底物溶液950μL，加入10mM NAD+溶液25μL，置于金属浴震荡器中，35℃保温10min；加入25μL对应粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。
实施例2：基因工程菌的构建
1、表达原始谷氨酸脱氢酶的基因工程菌的构建
通过比较文献数据，获得对天然底物α-酮戊二酸(产物为L-谷氨酸)具有较高催化活力的、可以以NADH为辅酶的谷氨酸脱氢酶的原始基因序列，如表1所示。
通过查询基因数据库NCBI，获得上述原始谷氨酸脱氢酶的基因序列，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上，插入酶切位点为BamH I和Xho I。重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于原始谷氨酸脱氢酶的表达以及后续的基因突变。
分别以α-酮戊二酸(产物为L-谷氨酸)和PPO(产物为L-草铵膦)为底物，测定这些基因工程菌株表达的谷氨酸脱氢酶的活力；由表1可知，所选的这些原始谷氨酸脱氢酶对α-酮戊二酸具有明显的催化活力，但对PPO都没有检测到催化活力。结果见表1。
表1原始谷氨酸脱氢酶的来源与酶活
注：酶活1是以α-酮戊二酸为底物时谷氨酸脱氢酶的催化活力；酶活2是以PPO为底物时的催化活力。
2、表达谷氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌的构建
设计定点突变引物(表2)，以带有目标基因(谷氨酸脱氢酶原始基因)的重组质粒作为模板，通过全质粒PCR引入突变，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR扩增体系：DNA聚合酶25μl；上游引物(10pmol/μl)1.5μl；下游引物(10pmol/μl)1.5μl；模板1.0μl；dd H2O 21μl。
PCR扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，55-58℃退火15s，72℃延伸15-60s，共循环30次；72℃后延伸10min；4℃保存。
PCR扩增结束后，扩增产物用DpnⅠ消化3h去除模板质粒。消化产物进一步通过热激法转化至表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，涂平板，置于37℃恒温培养箱中培养12h。挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由基因测序公司来验证插入序列的正确性。验证后无误的菌株置于-80℃保藏备用。
以PPO(产物为L-草铵膦)为底物，测定这些基因工程菌株表达的谷氨酸脱氢酶突变体的活力，由表2可知，这些谷氨酸脱氢酶突变体对PPO都检测到了催化活力。
结果见表2。
表2谷氨酸脱氢酶突变体酶活
注：酶活2是以PPO为底物时的催化活力。
3、表达辅酶再生酶的基因工程菌的构建
将优选的三种辅酶再生酶葡萄糖脱氢酶(编码基因NCBI登录号：WP_087960837.1，酶编号E21)、醇脱氢酶(编码基因NCBI登录号：NZ_JYNW01000069.1，酶编号E22)和甲酸脱氢酶(编码基因NCBI登录号：P33160.3，酶编号E23)的基因序列，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上。重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，用于辅酶再生酶的表达以及后续的共表达基因工程菌株的构建。
4、共表达谷氨酸脱氢酶突变体和辅酶再生酶的基因工程菌的构建
如图1所示为共表达辅酶再生酶和谷氨酸脱氢酶突变体的质粒图谱。通过全质粒PCR的方式得到质粒pET-28a(+)上的谷氨酸脱氢酶突变体基因和辅酶再生酶基因的线性片段。通过重组反应，将两个线性片段重新连接成pET-28a(+)质粒，新的pET-28a(+)质粒携带有谷氨酸脱氢酶突变体基因和辅酶再生酶基因。再将重组pET-28a(+)质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，测序验证后无误即用作共表达所述两种酶的基因工程菌。
实施例3：使用共表达E10和E21的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E10和E21的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将收集到的菌体细胞，进行超声破碎、离心去除沉淀，得到粗酶液。将含有PPO约200mM、葡萄糖约250mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到7.5，再加入NAD+0.001mM；然后加入相当于湿细胞浓度20g/L的粗酶液，水浴控制反应温度20℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝7.5，反应24h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为197.9mM，检测产品草铵膦ee值为99.1％。
实施例4：使用共表达E11和E21的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E11和E21的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约200mM、葡萄糖约250mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到8.0，再加入NAD+0.05mM；然后加入收集的湿细胞20g/L，水浴控制反应温度15℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝8.0，反应10h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为198.1mM，检测产品草铵膦ee值为99.7％。
实施例5：使用共表达E12和E21的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E12和E21的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM、葡萄糖约120mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到7.0，再加入NAD+0.2mM；然后加入收集的湿细胞30g/L，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝7.0，反应36h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为99.3mM，检测产品草铵膦ee值为99.2％。。
实施例6：使用共表达E13和E21的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E13和E21的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约300mM、葡萄糖约400mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到6.0，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度30℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝6.0，反应4h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为295.2mM，检测产品草铵膦ee值为99.6％。
实施例7：使用共表达E14和E22的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E14和E22的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约300mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到8.5，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度40℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝8.5，分8批加入异丙醇约400mM，反应6h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为298.1mM，检测产品草铵膦ee值为99.3％。
实施例8：使用共表达E15和E22的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E15和E22的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约500mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到9.5，再加入NAD+0.1mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度50℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝9.5，分12批加入异丙醇约600mM，反应10h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为492.1mM，检测产品草铵膦ee值为99.2％。
实施例9：使用共表达E16和E22的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E16和E22的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约500mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到9.0，再加入NAD+0.1mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度50℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝9.0，分12批加入异丙醇约600mM，反应12h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为493.8mM，检测产品草铵膦ee值为99.5％。
实施例10：使用共表达E17和E22的菌株制备L-草铵膦。
选取共表达E17和E22的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约500mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到9.0，再加入NAD+0.1mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度55℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝9.0，分12批加入异丙醇约600mM，反应12h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为497.2mM，检测产品草铵膦ee值为99.8％。
实施例11：使用共表达E18和E23的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E18和E23的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM、甲酸铵约120mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％甲酸水溶液调节反应溶液pH到8.0，再加入NAD+0.1mM；然后加入收集的湿细胞20g/L，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用甲酸控制pH＝8.0，反应24h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为98.9mM，检测产品草铵膦ee值为99.1％。
实施例12：使用共表达E19和E23的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E19和E23的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM、甲酸铵约120mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％甲酸水溶液调节反应溶液pH到8.0，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞20g/L，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用甲酸控制pH＝8.0，反应36h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为99.3mM，检测产品草铵膦ee值为99.5％。
实施例13：使用共表达E20和E23的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E20和E23的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM、甲酸铵约120mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％甲酸水溶液调节反应溶液pH到8.0，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用甲酸控制pH＝8.0，反应48h，液相检测PPO为0.0mM，L-草铵膦的生成浓度为98.1mM，检测产品草铵膦ee值为99.5％。
对比例1：使用共表达E1和E21的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E10和E21的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将收集到的菌体细胞，进行超声破碎、离心去除沉淀，得到粗酶液。将含有PPO约100mM、葡萄糖约150mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到7.5，再加入NAD+0.5mM；然后加入相当于湿细胞浓度20g/L的粗酶液，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝7.5，反应75h，液相检测PPO为95.7mM，L-草铵膦的生成浓度为0.0mM。
对比例2：使用共表达E6和E22的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E6和E22的基因工程，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％氨水调节溶液pH到8.5，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度40℃，开启搅拌，用氨水控制pH＝8.5，分4批加入异丙醇约200mM，反应72h，液相检测PPO为94.3mM，L-草铵膦的生成浓度为0.0mM。
对比例3：使用共表达E7和E23的菌株制备L-草铵膦
选取共表达E7和E23的基因工程菌，按照实施例1的操作、经微生物培养后收集细胞。将含有PPO约100mM、甲酸铵约120mM的溶液置于磁力搅拌反应器中，用30％甲酸水溶液调节溶液pH到6.0，再加入NAD+0.5mM；然后加入收集的湿细胞40g/L，水浴控制反应温度25℃，开启搅拌，用甲酸控制pH＝6.0，反应72h，液相检测PPO为96.1mM，L-草铵膦的生成浓度为0.0mM。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于生产L-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及L-草铵膦生产方法
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Glu Gln Asp Pro Tyr Glu Ile Val Ile Lys Gln Leu Glu Arg
1 5 10 15
Ala Ala Gln Tyr Met Glu Ile Ser Glu Glu Ala Leu Glu Phe Leu Lys
20 25 30
Arg Pro Gln Arg Ile Val Glu Val Thr Ile Pro Val Glu Met Asp Asp
35 40 45
Gly Ser Val Lys Val Phe Thr Gly Phe Arg Val Gln His Asn Trp Ala
50 55 60
Arg Gly Pro Thr Lys Gly Gly Ile Arg Trp His Pro Glu Glu Thr Leu
65 70 75 80
Ser Thr Val Lys Ala Leu Ala Ala Trp Met Thr Trp Lys Thr Ala Val
85 90 95
Met Asp Leu Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Val Asp Pro
100 105 110
Lys Lys Leu Ser Asp Arg Glu Lys Glu Arg Leu Ala Arg Gly Tyr Ile
115 120 125
Arg Ala Ile Tyr Asp Val Ile Ser Pro Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Pro
130 135 140
Asp Val Tyr Thr Asn Pro Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Thr Ile Ser Arg Arg Lys Thr Pro Ala Phe Gly Ile Ile Thr Gly
165 170 175
Lys Pro Leu Ser Ile Gly Gly Ser Leu Gly Arg Ile Glu Ala Thr Ala
180 185 190
Arg Gly Ala Ser Tyr Thr Ile Arg Glu Ala Ala Lys Val Leu Gly Trp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Gly Lys Thr Ile Ala Ile Gln Gly Tyr Gly Asn Ala
210 215 220
Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Ile Met Ser Glu Asp Phe Gly Met Lys Val
225 230 235 240
Val Ala Val Ser Asp Ser Lys Gly Gly Ile Tyr Asn Pro Asp Gly Leu
245 250 255
Asn Ala Asp Glu Val Leu Lys Trp Lys Asn Glu His Gly Ser Val Lys
260 265 270
Asp Phe Pro Gly Ala Thr Asn Ile Thr Asn Glu Glu Leu Leu Glu Leu
275 280 285
Glu Val Asp Val Leu Ala Pro Ala Ala Ile Glu Glu Val Ile Thr Lys
290 295 300
Lys Asn Ala Asp Asn Ile Lys Ala Lys Ile Val Ala Glu Val Ala Asn
305 310 315 320
Gly Pro Val Thr Pro Glu Ala Asp Glu Ile Leu Phe Glu Lys Gly Ile
325 330 335
Leu Gln Ile Pro Asp Phe Leu Cys Asn Ala Gly Gly Val Thr Val Ser
340 345 350
Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Ile Thr Gly Tyr Tyr Trp Thr Ile Glu
355 360 365
Glu Val Arg Glu Arg Leu Asp Lys Lys Met Thr Lys Ala Phe Tyr Asp
370 375 380
Val Tyr Asn Ile Ala Lys Glu Lys Asn Ile His Met Arg Asp Ala Ala
385 390 395 400
Tyr Val Val Ala Val Gln Arg Val Tyr Gln Ala Met Leu Asp Arg Gly
405 410 415
Trp Val Lys His
420
<210> 2
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gln Ala Ala Glu Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Asp Leu Met Phe
1 5 10 15
Asn Arg Ala Val Ala Leu Met Asp Leu Ser Pro Gly Leu Glu Glu Lys
20 25 30
Ile Arg Val Cys Asn Ser Thr Tyr Thr Val Arg Phe Gly Val Arg Leu
35 40 45
Arg Gly Lys Ile Phe Thr Phe Thr Gly Tyr Arg Ser Val His Ser Glu
50 55 60
His Met Glu Pro Val Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Ala Leu Ser Val Ser
65 70 75 80
Gln Asp Glu Val Glu Ala Leu Ala Ala Leu Met Thr Tyr Lys Cys Ala
85 90 95
Leu Val Glu Thr Pro Phe Gly Gly Ser Lys Gly Gly Leu Cys Ile Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Trp Asp Glu His Glu Leu Glu Gln Ile Thr Arg Arg Phe
115 120 125
Ala Tyr Glu Leu Ala Lys Arg Asp Leu Ile His Pro Ala Gln Asn Val
130 135 140
Pro Gly Pro Asp Met Gly Thr Gly Glu Arg Glu Met Ala Trp Ile Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Ala Arg Met Asn Thr Ala Asp Ile Asn Ala Arg Ala Cys
165 170 175
Val Thr Gly Lys Pro Ile Asn Ala Gly Gly Ile His Gly Arg Val Glu
180 185 190
Ala Thr Gly Arg Gly Val Gln Phe Ala Leu Arg Glu Phe Phe Arg His
195 200 205
Ala Glu Asp Lys Ala Arg Ala Gly Leu Ser Gly Asp Leu Asp Gly Lys
210 215 220
Arg Ile Ile Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Gly Tyr His Ala Ala Lys
225 230 235 240
Phe Leu Thr Glu Glu Asp Gly Ala Lys Val Thr Gly Val Ile Glu Arg
245 250 255
Asp Gly Ala Leu Val Asn Pro Ala Gly Ile Pro Val Glu Glu Leu Arg
260 265 270
His Trp Met Met Lys Thr Gly Ser Ile Arg Gly Phe Ser Gln Ala Asp
275 280 285
Phe Val Glu Asp Gly Arg Lys Leu Leu Glu Glu Glu Cys Asp Ile Leu
290 295 300
Ile Pro Ala Ala Met Glu Gly Val Ile Thr Arg Glu Asn Ala Ala Arg
305 310 315 320
Ile Lys Ala Pro Leu Ile Ile Glu Ala Ala Asn Gly Pro Ile Thr Phe
325 330 335
Gly Ala Asp Glu Ile Leu Arg Gln Lys Gly Thr Val Ile Val Pro Asp
340 345 350
Leu Tyr Ala Asn Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val
355 360 365
Lys Asn Leu Ser His Ile Arg Phe Gly Arg Met Gln Arg Arg Ala Glu
370 375 380
Glu Ala Arg Ser Arg Ala Leu Val Glu Glu Leu Glu Arg Leu Ser Ala
385 390 395 400
Asp Gln Gly Leu Gly Trp Gln Leu Ala Pro Asp Phe Lys Gln Lys Phe
405 410 415
Met Gln Gly Ser Asp Glu Leu Ala Leu Val Arg Ser Gly Leu Asp Asp
420 425 430
Thr Met Arg Ile Ala Tyr Gln Ser Met Arg Glu Val Trp His Gly Ala
435 440 445
Glu Gly Ala Gln Asp Leu Arg Val Ala Ala Tyr Ile Val Ala Ile Arg
450 455 460
Arg Val Ala Ala Thr Tyr Arg Ser Lys Gly Leu
465 470 475
<210> 3
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Ala Asp Lys His Thr Glu Glu Lys Gly Gln Gln Asp Asp Val
1 5 10 15
Leu Ala Ser Thr Gln Ile Val Ile His Arg Ala Leu Glu Lys Leu Gly
20 25 30
Tyr Pro Glu Glu Val Tyr Glu Leu Leu Lys Glu Pro Ile Arg Val Leu
35 40 45
Thr Val Arg Ile Pro Val Arg Met Asp Asp Gly Ser Val Lys Ile Phe
50 55 60
Thr Gly Tyr Arg Ala Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys Gly
65 70 75 80
Gly Val Arg Phe His Pro Asp Val Thr Glu Arg Glu Val Lys Ala Leu
85 90 95
Ser Ile Trp Met Ser Leu Lys Cys Gly Ile Val Asp Leu Pro Tyr Gly
100 105 110
Gly Gly Lys Gly Gly Ile Val Cys Asp Pro Arg Thr Met Ser Phe Arg
115 120 125
Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln Ile
130 135 140
Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Gly Pro Asp Val Phe Thr Asn Ser
145 150 155 160
Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Phe
165 170 175
Asp Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly Ser
180 185 190
His Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Lys Gly Val Thr Ile Cys Ile Arg
195 200 205
Glu Ala Ala Lys Lys Arg Gly Leu Ser Leu Glu Gly Ala Arg Val Val
210 215 220
Val Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Ala Lys Phe Leu His
225 230 235 240
Asp Ala Gly Ala Lys Val Val Gly Ile Ser Asp Val Tyr Gly Ala Leu
245 250 255
Tyr Asp Pro Asn Gly Leu Asp Ile Asp Tyr Leu Leu Glu Arg Arg Asp
260 265 270
Ser Phe Gly Thr Val Thr Lys Leu Phe Lys Asn Thr Ile Ser Asn Lys
275 280 285
Glu Leu Leu Glu Leu Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala Ile Glu
290 295 300
Asn Gln Ile Thr Ala Glu Asn Ala Pro Arg Ile Lys Ala Ser Ile Val
305 310 315 320
Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Leu Glu Ala Thr Glu Ile Leu
325 330 335
Thr Gln Arg Gly Ile Leu Leu Val Pro Asp Val Leu Ala Ser Ala Gly
340 345 350
Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln Gly Tyr
355 360 365
Tyr Trp Thr Glu Glu Glu Val Glu Gln Arg Leu Glu Lys Val Met Val
370 375 380
Lys Ala Phe Asn Asn Val Tyr Glu Met Ala Gln Thr Arg Arg Val Asp
385 390 395 400
Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Val Gly Val Arg Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Cys Arg Phe Arg Gly Trp Val
420
<210> 4
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Thr Gln Asp Asn Tyr Asn Ala Tyr Gln Thr Ala Gln Glu Gln Phe
1 5 10 15
Asp His Val Ala Asp Leu Ile Asn Leu Asn Gln Ser Ala Arg Glu Met
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Ser Arg Glu Phe His Phe Thr Ile Pro Val Lys Met
35 40 45
Asp Asp Gly Thr Thr Lys Val Phe Lys Gly Tyr Arg Ile Gln His Asn
50 55 60
Asp Ala Arg Gly Pro Ser Lys Gly Gly Ile Arg Phe Asp Pro Asn Glu
65 70 75 80
Thr Val Asp Thr Ile Arg Ala Leu Ser Met Trp Met Thr Trp Lys Cys
85 90 95
Ala Val Val Asp Ile Pro Leu Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Val Cys
100 105 110
Asp Pro Arg Gln Leu Ser Asp Ala Glu Gln Glu Arg Leu Cys Arg Gly
115 120 125
Tyr Val Arg Gln Leu Ala Arg Asn Ile Gly Glu Val Ile Asp Val Pro
130 135 140
Ala Pro Asp Val Met Ser Asn Gly Gln His Met Leu Trp Met Leu Asp
145 150 155 160
Glu Tyr Glu Thr Ile Arg Gly Gly His Tyr Pro Gly Ala Ile Thr Gly
165 170 175
Lys Pro Val Gly Met Gly Gly Ser Leu Gly Arg Thr Glu Ala Thr Gly
180 185 190
Phe Gly Val Ile Tyr Thr Leu Arg Glu Ala Leu Lys Thr Gln Asn Ile
195 200 205
Asp Ile Thr Lys Thr Thr Ala Ser Ile Gln Gly Phe Gly Asn Val Ala
210 215 220
Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Tyr Ser Glu Met Gly Gly Lys Ile Ile Ala
225 230 235 240
Ile Ser Thr Trp Asp Asn Gln Asp Lys Lys Ala Tyr Thr Tyr Arg Asn
245 250 255
Leu Lys Gly Ile Asn Val Glu Glu Leu Val Leu Ile Lys Asp Lys Phe
260 265 270
Gly Thr Ile Asp Lys Glu Lys Ala Val Gln Met Gly Tyr Glu Val Leu
275 280 285
Asp Gly Asp Ala Trp Leu Glu Gln Glu Val Asp Ile Leu Leu Pro Cys
290 295 300
Ala Leu Glu Asn Gln Ile Thr Ala Asp Lys Phe Pro Leu Ile Asn Gln
305 310 315 320
Ser Val Lys Val Ile Cys Glu Gly Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Asp
325 330 335
Ala Asp Lys Leu Ile Lys Glu Arg Gly Ile Tyr Leu Val Pro Asp Phe
340 345 350
Leu Cys Asn Ala Gly Gly Val Thr Cys Ser Tyr Phe Glu Gln Val Gln
355 360 365
Ser Asn Met Asn Tyr Phe Trp Asp Lys Ala Glu Val Leu Glu Lys Leu
370 375 380
Asp Ser Lys Met Thr Ala Ala Phe His Ala Val His Glu Leu Ala Glu
385 390 395 400
Glu Lys Glu Leu Tyr Met Arg Asp Ala Ala Tyr Val Ile Ala Ile Glu
405 410 415
Arg Val Ala Asn Ala Val Lys Leu Arg Gly Trp Ile
420 425
<210> 5
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ser Ala Lys Gln Val Ser Lys Asp Glu Glu Lys Glu Ala Leu Asn
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Thr Gln Thr Ile Ile Lys Glu Ala Leu Arg Lys Leu
20 25 30
Gly Tyr Pro Gly Asp Met Tyr Glu Leu Met Lys Glu Pro Gln Arg Met
35 40 45
Leu Thr Val Arg Ile Pro Val Lys Met Asp Asn Gly Ser Val Lys Val
50 55 60
Phe Thr Gly Tyr Arg Ser Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys
65 70 75 80
Gly Gly Val Arg Phe His Pro Glu Val Asn Glu Glu Glu Val Lys Ala
85 90 95
Leu Ser Ile Trp Met Thr Leu Lys Cys Gly Ile Ala Asn Leu Pro Tyr
100 105 110
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Cys Asp Pro Arg Thr Met Ser Phe
115 120 125
Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln
130 135 140
Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Gly Pro Asp Val Tyr Thr Asn
145 150 155 160
Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Asp Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Gln Gly Val Thr Ile Cys Ile
195 200 205
Glu Glu Ala Val Lys Lys Lys Gly Ile Lys Leu Gln Asn Ala Arg Ile
210 215 220
Ile Ile Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Phe Leu Ala Lys Phe Met
225 230 235 240
His Asp Ala Gly Ala Lys Val Ile Gly Ile Ser Asp Ala Asn Gly Gly
245 250 255
Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Leu Asp Ile Pro Tyr Leu Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Asp Ser Phe Gly Met Val Thr Asn Leu Phe Thr Asp Val Ile Thr Asn
275 280 285
Glu Glu Leu Leu Glu Lys Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala Ile
290 295 300
Ser Asn Gln Ile Thr Ala Lys Asn Ala His Asn Ile Gln Ala Ser Ile
305 310 315 320
Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Ile Asp Ala Thr Lys Ile
325 330 335
Leu Asn Glu Arg Gly Val Leu Leu Val Pro Asp Ile Leu Ala Ser Ala
340 345 350
Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln Gly
355 360 365
Tyr Tyr Trp Ser Glu Glu Glu Val Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Met
370 375 380
Val Ser Ser Phe Glu Thr Ile Tyr Gln Thr Ala Ala Thr His Lys Val
385 390 395 400
Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Thr Gly Ile Arg Lys Ser Ala Glu
405 410 415
Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val
420
<210> 6
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Val Thr Glu Asn Thr Gln Gly Lys Glu Gln Lys Gln Glu Ser Met
1 5 10 15
Asn Leu Leu Gln Ser Thr Gln Thr Val Ile Lys Glu Ala Leu Glu Lys
20 25 30
Leu Gly Tyr Gln Glu Ser Met Tyr Glu Leu Leu Lys Glu Pro Leu Arg
35 40 45
Val Leu Thr Val Arg Ile Pro Val Arg Met Asp Asn Gly Glu Val Lys
50 55 60
Val Phe Thr Gly Tyr Arg Ala Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr
65 70 75 80
Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Pro Asp Val Thr Glu Asp Glu Val Lys
85 90 95
Ala Leu Ser Ile Trp Met Ser Leu Lys Ala Gly Ile Val Asp Leu Pro
100 105 110
Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Cys Asp Pro Arg Glu Met Ser
115 120 125
Phe Arg Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Val Ser
130 135 140
Gln Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Gly Pro Asp Val Phe Thr
145 150 155 160
Asn Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Ile Arg
165 170 175
Glu Phe Asp Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Ile Ala Leu Gly
180 185 190
Gly Ser His Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Lys Gly Val Thr Ile Cys
195 200 205
Ile Arg Glu Ala Ala Lys Arg Arg Gly Ile Asp Leu Lys Gly Ala Arg
210 215 220
Val Val Val Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Lys Phe
225 230 235 240
Met His Asp Ala Gly Ala Lys Val Val Gly Ile Ser Asp Ala Tyr Gly
245 250 255
Ala Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Leu Asp Ile Asp Tyr Leu Leu Asp Arg
260 265 270
Arg Asp Ser Phe Gly Thr Val Thr Lys Leu Phe Thr Asn Thr Ile Thr
275 280 285
Asn Lys Glu Leu Leu Glu Leu Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala
290 295 300
Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala Asn Ala His Asn Ile Lys Ala Lys
305 310 315 320
Ile Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Leu Glu Ala Thr Lys
325 330 335
Ile Leu Thr Glu Arg Gly Ile Leu Leu Val Pro Asp Val Leu Ala Ser
340 345 350
Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln
355 360 365
Gly Tyr Tyr Trp Ser Glu Glu Glu Val Gln Glu Lys Leu Glu Lys Val
370 375 380
Met Val Lys Ala Phe Glu Asn Val Tyr Ser Leu Ala Gln Thr Arg Arg
385 390 395 400
Val Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Val Gly Val Arg Lys Met Ala
405 410 415
Glu Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val
420 425
<210> 7
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Val Ala Asp Lys Met Gln Asp Ser Lys Asn Ser Gln Glu Glu Lys
1 5 10 15
His Asp Val Leu Lys Ser Thr Gln Thr Val Ile His Lys Ala Leu Glu
20 25 30
Lys Leu Gly Tyr Pro Asp Glu Val Tyr Glu Leu Leu Lys Glu Pro Leu
35 40 45
Arg Met Met Thr Val Lys Ile Pro Val Arg Met Asp Asp Gly Ser Val
50 55 60
Lys Ile Phe Thr Gly His Arg Ala Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro
65 70 75 80
Thr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Pro Asn Val Thr Glu Lys Glu Val
85 90 95
Lys Ala Leu Ser Ile Trp Met Ser Leu Lys Cys Gly Ile Val Asp Leu
100 105 110
Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Val Cys Asp Pro Arg Asn Met
115 120 125
Ser Phe Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile
130 135 140
Ser Gln Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Gly Pro Asp Val Phe
145 150 155 160
Thr Asn Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Ile
165 170 175
Asp Glu Phe Asn Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu
180 185 190
Gly Gly Ser His Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Lys Gly Val Thr Ile
195 200 205
Cys Ile Arg Glu Ala Ala Lys Lys Arg Gly Ile Glu Leu Gln Gly Ala
210 215 220
Arg Val Val Val Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Phe Leu Ala Lys
225 230 235 240
Phe Met His Asp Ala Gly Ala Lys Ile Val Gly Ile Ser Asp Ala Tyr
245 250 255
Gly Ala Leu His Asp Pro Asn Gly Leu Asp Ile Asp Tyr Leu Leu Asp
260 265 270
Arg Arg Asp Ser Phe Gly Thr Val Thr Lys Leu Phe Asn Asn Thr Ile
275 280 285
Ser Asn Lys Glu Leu Leu Glu Leu Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala
290 295 300
Ala Ile Glu Asn Gln Ile Thr Glu Glu Asn Ala His Asn Ile Gln Ala
305 310 315 320
Ser Ile Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Leu Glu Ala Thr
325 330 335
Arg Ile Leu Ser Glu Arg Gly Ile Leu Leu Val Pro Asp Val Leu Ala
340 345 350
Ser Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn
355 360 365
Gln Gly Tyr Tyr Trp Thr Glu Glu Glu Val Glu Glu Lys Leu Glu Lys
370 375 380
Val Met Val Lys Ser Phe Asn Asn Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Thr Arg
385 390 395 400
Lys Val Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Ile Gly Val Arg Lys Met
405 410 415
Ala Glu Gly Ser Arg Phe Arg Gly Trp Ile
420 425
<210> 8
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Lys Tyr Val Asp Arg Val Ile Ala Glu Val Glu Lys Lys Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Glu Pro Glu Phe Val Gln Thr Val Glu Glu Val Leu Ser Ser
20 25 30
Leu Gly Pro Val Val Asp Ala His Pro Glu Tyr Glu Glu Val Ala Leu
35 40 45
Leu Glu Arg Met Val Ile Pro Glu Arg Val Ile Glu Phe Arg Val Pro
50 55 60
Trp Glu Asp Asp Asn Gly Lys Val His Val Asn Thr Gly Tyr Arg Val
65 70 75 80
Gln Phe Asn Gly Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe Ala
85 90 95
Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ala
100 105 110
Phe Lys Asp Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Ala Lys Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Phe Asp Pro Asn Gly Lys Ser Asp Arg Glu Val Met Arg Phe
130 135 140
Cys Gln Ala Phe Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Ile
145 150 155 160
Asp Val Pro Gly Gly Asp Leu Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr
165 170 175
Met Tyr Gly Gln Tyr Arg Lys Ile Val Gly Gly Phe Tyr Asn Gly Val
180 185 190
Leu Thr Gly Lys Ala Arg Ser Phe Gly Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu
195 200 205
Ala Thr Gly Tyr Gly Ser Val Tyr Tyr Val Glu Ala Val Met Lys His
210 215 220
Glu Asn Asp Thr Leu Val Gly Lys Thr Val Ala Leu Ala Gly Phe Gly
225 230 235 240
Asn Val Ala Trp Gly Ala Ala Lys Lys Leu Ala Glu Leu Gly Ala Lys
245 250 255
Ala Val Thr Leu Ser Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Pro Glu Gly
260 265 270
Ile Thr Thr Glu Glu Lys Ile Asn Tyr Met Leu Glu Met Arg Ala Ser
275 280 285
Gly Arg Asn Lys Val Gln Asp Tyr Ala Asp Lys Phe Gly Val Gln Phe
290 295 300
Phe Pro Gly Glu Lys Pro Trp Gly Gln Lys Val Asp Ile Ile Met Pro
305 310 315 320
Cys Ala Thr Gln Asn Asp Val Asp Leu Glu Gln Ala Lys Lys Ile Val
325 330 335
Ala Asn Asn Ile Lys Tyr Tyr Ile Glu Val Ala Asn Met Pro Thr Thr
340 345 350
Asn Glu Ala Leu Arg Phe Leu Met Gln Gln Pro Asn Met Val Val Ala
355 360 365
Pro Ser Lys Ala Val Asn Ala Gly Gly Val Leu Val Ser Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ser Gln Asn Ser Glu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Glu Glu Val Asp
385 390 395 400
Ser Lys Leu His Gln Val Met Thr Asp Ile His Asp Gly Ser Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Glu Arg Tyr Gly Leu Gly Tyr Asn Leu Val Ala Gly Ala Asn
420 425 430
Ile Val Gly Phe Gln Lys Ile Ala Asp Ala Met Met Ala Gln Gly Ile
435 440 445
Ala Trp
450
<210> 9
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Lys Tyr Val Asp Arg Val Ile Ala Glu Val Glu Lys Lys Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Glu Pro Glu Phe Val Gln Thr Val Glu Glu Val Leu Ser Ser
20 25 30
Leu Gly Pro Val Val Asp Ala His Pro Glu Tyr Glu Glu Val Ala Leu
35 40 45
Leu Glu Arg Met Val Ile Pro Glu Arg Val Ile Glu Phe Arg Val Pro
50 55 60
Trp Glu Asp Asp Asn Gly Lys Val His Val Asn Thr Gly Tyr Arg Val
65 70 75 80
Gln Phe Asn Gly Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe Ala
85 90 95
Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ala
100 105 110
Phe Lys Asp Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Ala Lys Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Phe Asp Pro Asn Gly Lys Ser Asp Arg Glu Val Met Arg Phe
130 135 140
Cys Gln Ala Phe Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Ile
145 150 155 160
Asp Val Pro Ala Gly Asp Leu Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr
165 170 175
Met Tyr Gly Gln Tyr Arg Lys Ile Val Gly Gly Phe Tyr Asn Gly Val
180 185 190
Leu Thr Gly Lys Ala Arg Ser Phe Gly Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu
195 200 205
Ala Thr Gly Tyr Gly Ser Val Tyr Tyr Val Glu Ala Val Met Lys His
210 215 220
Glu Asn Asp Thr Leu Val Gly Lys Thr Val Ala Leu Ala Gly Phe Gly
225 230 235 240
Asn Val Ala Trp Gly Ala Ala Lys Lys Leu Ala Glu Leu Gly Ala Lys
245 250 255
Ala Val Thr Leu Ser Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Pro Glu Gly
260 265 270
Ile Thr Thr Glu Glu Lys Ile Asn Tyr Met Leu Glu Met Arg Ala Ser
275 280 285
Gly Arg Asn Lys Val Gln Asp Tyr Ala Asp Lys Phe Gly Val Gln Phe
290 295 300
Phe Pro Gly Glu Lys Pro Trp Gly Gln Lys Val Asp Ile Ile Met Pro
305 310 315 320
Cys Ala Thr Gln Asn Asp Val Asp Leu Glu Gln Ala Lys Lys Ile Val
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340 345 350
Asn Glu Ala Leu Arg Phe Leu Met Gln Gln Pro Asn Met Val Val Ala
355 360 365
Pro Ser Lys Ala Val Asn Ala Gly Gly Ala Leu Val Ser Gly Phe Glu
370 375 380
Met Ser Gln Asn Ser Glu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Glu Glu Val Asp
385 390 395 400
Ser Lys Leu His Gln Val Met Thr Asp Ile His Asp Gly Ser Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Glu Arg Tyr Gly Leu Gly Tyr Asn Leu Val Ala Gly Ala Asn
420 425 430
Ile Val Gly Phe Gln Lys Ile Ala Asp Ala Met Met Ala Gln Gly Ile
435 440 445
Ala Trp
450
<210> 10
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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Asp His Val Ala Asp Leu Ile Asn Leu Asn Gln Ser Ala Arg Glu Met
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Ser Arg Glu Phe His Phe Thr Ile Pro Val Lys Met
35 40 45
Asp Asp Gly Thr Thr Lys Val Phe Lys Gly Tyr Arg Ile Gln His Asn
50 55 60
Asp Ala Arg Gly Pro Ser Lys Gly Gly Ile Arg Phe Asp Pro Asn Glu
65 70 75 80
Thr Val Asp Thr Ile Arg Ala Leu Ser Met Trp Met Thr Trp Lys Cys
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Asp Ile Thr Lys Thr Thr Ala Ser Ile Gln Gly Phe Gly Asn Val Ala
210 215 220
Glu Tyr Ala Ala Arg Leu Tyr Ser Glu Met Gly Gly Lys Ile Ile Ala
225 230 235 240
Ile Ser Thr Trp Asp Asn Gln Asp Lys Lys Ala Tyr Thr Tyr Arg Asn
245 250 255
Leu Lys Gly Ile Asn Val Glu Glu Leu Val Leu Ile Lys Asp Lys Phe
260 265 270
Gly Thr Ile Asp Lys Glu Lys Ala Val Gln Met Gly Tyr Glu Val Leu
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Val Lys Val Ile Cys Glu Gly Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Asp
325 330 335
Ala Asp Lys Leu Ile Lys Glu Arg Gly Ile Tyr Leu Val Pro Asp Phe
340 345 350
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Ser Asn Met Asn Tyr Phe Trp Asp Lys Ala Glu Val Leu Glu Lys Leu
370 375 380
Asp Ser Lys Met Thr Ala Ala Phe His Ala Val His Glu Leu Ala Glu
385 390 395 400
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Arg Val Ala Asn Ala Val Lys Leu Arg Gly Trp Ile
420 425
<210> 11
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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1 5 10 15
Asp Ala Leu Asn Lys Leu Gly Tyr Asp Glu Ala Met Tyr Glu Leu Leu
20 25 30
Lys Glu Pro Leu Arg Met Leu Gln Val Arg Ile Pro Val Lys Met Asp
35 40 45
Asp Gly Thr Thr Lys Val Phe Thr Gly Tyr Arg Ala Gln His Asn Asp
50 55 60
Ala Val Gly Pro Thr Lys Gly Gly Val Arg Phe His Pro Gln Val Ser
65 70 75 80
Glu Glu Glu Val Lys Ala Leu Ser Met Trp Met Thr Leu Lys Cys Gly
85 90 95
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100 105 110
Pro Arg Gln Met Ser Met Gly Glu Ile Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr
115 120 125
Val Arg Ala Val Ser Gln Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Gly
130 135 140
Pro Asp Val Phe Thr Asn Ala Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Pro Leu Val Leu Gly Gly Ser Gln Gly Arg Asp Arg Ala Thr Ala Gln
180 185 190
Gly Val Thr Ile Val Ile Glu Glu Ala Ala Lys Lys Arg Gly Ile Asp
195 200 205
Ile Lys Gly Ala Arg Val Val Ile Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser
210 215 220
Phe Leu Ala Lys Phe Met His Asp Leu Gly Ala Lys Val Ile Gly Ile
225 230 235 240
Ser Asp Ala Tyr Gly Ala Leu His Asp Pro Glu Gly Leu Asp Ile Asp
245 250 255
Tyr Leu Leu Asp Arg Arg Asp Ser Phe Gly Thr Val Thr Thr Leu Phe
260 265 270
Glu Asn Thr Ile Ser Asn Lys Glu Leu Leu Glu Leu Asp Cys Asp Ile
275 280 285
Leu Val Pro Ala Ala Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Asp Asn Ala His
290 295 300
Asn Ile Lys Ala Asp Ile Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr
305 310 315 320
Ala Glu Ala Thr Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Ile Leu Leu Val Pro
325 330 335
Asp Val Leu Ala Ser Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp
340 345 350
Val Gln Asn Asn Gln Gly Tyr Tyr Trp Thr Glu Glu Glu Val Glu Glu
355 360 365
Arg Leu Tyr Lys Lys Met Val Glu Ala Phe Asp Asn Val Tyr Thr Thr
370 375 380
Ala Thr Thr Arg Asn Ile Asn Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Val Gly
385 390 395 400
Val Arg Arg Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val
405 410
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<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atattccggg tccggatgtt tataccaatc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatccggac ccggaatatc ttcatacgga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgtgccggg tccggatatg ggtaccggtg 30
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atatccggac ccggcacatt ctgtgccgga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acattccggg tccggatgtg tttacaaact 30
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 30
<212> DNA
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atattccagg tcccgatgtg tacaccaatt 30
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<212> DNA
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<400> 33
acgtctggac caggaatgtc ttttgttggt c 31
Claims (10)
1.一种用于生产L-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶突变体为下列之一：
（1）将GeneBank登录号为NC_003413.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第145位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1；
（2）将GeneBank登录号为NC_007493.2的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第148位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2；
（3）将GeneBank登录号为BAM47507.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第154位丙氨酸突变为甘氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4；
（4）将GeneBank登录号为BAM47507.1的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第368位缬氨酸突变为丙氨酸，获得谷氨酸脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.9。
2.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶突变体的编码基因。
3.包含权利要求2所述编码基因的表达载体或基因工程菌。
4.如权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦中的应用。
5.一种L-草铵膦的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：以2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]-丁酸作为原料，然后使用如权利要求1所述谷氨酸脱氢酶突变体进行催化，获得为L-草铵膦。
6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，反应体系中，还包括辅酶再生系统；所述辅酶再生系统为下列之一：
（1）以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，葡萄糖为辅酶再生底物；
（2）以醇脱氢酶为辅酶再生酶，异丙醇为辅酶再生底物；
（3）以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶，甲酸为辅酶再生底物。
7.如权利要求6所述L-草铵膦的生产方法，其特征在于，葡萄糖脱氢酶的编码基因NCBI登录号：WP_087960837.1；醇脱氢酶的编码基因NCBI登录号：NZ_JYNW01000069.1；甲酸脱氢酶的编码基因NCBI登录号：P33160.3。
8.如权利要求6所述L-草铵膦的生产方法，其特征在于，谷氨酸脱氢酶突变体基因和辅酶再生酶基因构建于同一表达质粒，转入表达质粒工程菌宿主细胞，获得可以催化制备L-草铵膦的工程菌菌株。
9.如权利要求5所述L-草铵膦的生产方法，其特征在于，底物2-羰基-4-（羟基甲基膦酰基）丁酸的浓度为100 mM~500 mM，辅酶再生底物的浓度为120 mM~1000 mM，辅酶的浓度为0.001 mM~0.5 mM。
10.如权利要求5所述L-草铵膦的生产方法，其特征在于，所述催化的反应温度为15~60℃，反应液的pH值为6.0~9.5。
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| Efficient reductive amination process for enantioselective synthesis of L-phosphinothricin applying engineered glutamate dehydrogenase;Xinjian Yin等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20180316;第102卷;第4425-4433页 * |
| Rational Molecular Engineering of Glutamate Dehydrogenases for Enhancing Asymmetric Reductive Amination of Bulky a-Keto Acids;Xinjian Yin等;《Adv. Synth. Catal.》;20181228;第361卷;第803-812页 * |
| 响应面法优化重组大肠杆菌产谷氨酸脱氢酶培养基的研究;张雨晴等;《生物学杂志》;20190816;第36卷(第4期);第18-22页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113088501A (zh) | 2021-07-09 |
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