CN110343676A - 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L‑谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。所述L‑谷氨酸脱氢酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第166位氨基酸残基A，和/或第376位氨基酸残基V突变为碱性、亲水性或小位阻氨基酸残基后的序列。所述应用包括以下步骤：在L‑氨基酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH的存在下，将2‑氧代‑4‑(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，即得L‑草铵膦盐；再将制得的L‑草铵膦盐进行酸化反应制得L‑草铵膦。利用本发明的L‑谷氨酸脱氢酶突变体制备L‑草铵膦时与野生型L‑谷氨酸脱氢酶相比，能够催化的底物浓度更高，从而酶的作用效率提高，降低了反应的成本，利于工业化生产。

Description

一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
草铵膦是由赫斯特公司80年代开发的广谱触杀型除草剂。目前世界上的三大除草剂是草甘膦、草铵膦、百草枯，相对于草甘膦和百草枯，草铵膦具有优异的除草性能及较小的副作用。草铵膦有两种光学异构体，分别为D-草铵膦和L-草铵膦，但是只有L-草铵膦具有除草活性，因此发展L-草铵膦的方法对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
目前，制备L-草铵膦的方法主要有手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法如CN1053669C公开了利用奎宁生物碱作为拆分剂的方法，重结晶出L-草铵膦奎宁盐，然后用酸中和盐可以得到L-草铵膦。同时利用5-硝基水杨醛或3,5-二硝基水杨醛作为消旋化试剂消旋化未反应的D-草铵膦，得到DL-草铵膦，继续用于拆分反应。但是这种方法需要昂贵的手性拆分试剂，以及多步重结晶，操作繁琐，还不是一种理想的方法。
化学合成法如US6936444公开了钌催化剂不对称氢化2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁烯酸得到L-2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁酸，再经脱乙酰可以得到L-草铵膦。此方法需要昂贵的金属催化剂，成本较高，以及重金属残留，对环境污染严重。
相对于手性拆分法，化学合成法，生物催化法具有专一性强，反应条件温和等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。
目前有US4389488(A)记载的用N-苯乙酰-DL-草铵膦为底物，来源于大肠杆菌的青霉素-G-酰基转移酶为催化剂，得到L-草铵膦的方法，但是苯乙酰草铵膦的合成成本比较高，且反应结束后得到L-草胺膦，N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸的混合溶液，需要采用强酸阳离子交换树脂分离出L-草铵膦，操作比较复杂。
EP0382113A记载了利用酰基转移酶对N-乙酰-草铵膦的羧酸酯进行催化裂解得到L-草铵膦的方法，但是此方法中的酶对游离的N-乙酰-草铵膦没有特异性，因此必须对N-乙酰-草铵膦进行酯化，增加了反应的步骤，且相应的增加了生产成本。
另有一部分是采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经转氨酶催化制备L-草铵膦的方法，其中US5221737A和EP0344683A记载了用谷氨酸作为氨基供体，自相应酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过来源于大肠杆菌的氨基转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，反应体系中需要等量或过量的氨基供体谷氨酸，使产物难以纯化。CN1284858C对上述方法进行了改进，采用天冬氨酸作为氨基供体，自相应的酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过天冬氨酸转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，此方法中天冬氨酸转变为草酰乙酸，而草酰乙酸在含水介质中不稳定，并自发的脱羧为丙酮酸，丙酮酸可通过酶促反应除去，使得逆反应不能进行，反应只需要等摩尔的氨基供体和氨基受体。但是使用转氨酶的方法中所用的氨基供体多为氨基酸，成本较高。
另外还有采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经氨基酸脱氢酶催化，制备L-草铵膦的方法，如CN106978453A，其采用无机氨基供体，使得产物分离简单，成本降低。但是CN106978453A中酶催化的底物浓度范围仅为10-100mM，酶的催化效率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的L-谷氨酸脱氢酶在制备L-草铵膦时催化效率低等缺陷，因此本发明提供一种L-谷氨酸脱氢酶突变体以及其在制备L-草铵膦中的应用。利用本发明的L-谷氨酸脱氢酶突变体制备L-草铵膦时与野生型L-谷氨酸脱氢酶相比，能够催化的底物浓度更高，从而酶的作用效率提高，降低了反应的成本，利于工业化生产。
本发明所用的野生型L-谷氨酸脱氢酶来源是Corynebacterium glutamicum，PDB号为5IJZ。该野生型L-谷氨酸脱氢酶由447个氨基酸残基组成，催化底物PPO时酶活很低，不适合工业化生产。本发明人针对该底物PPO对上述野生型酶的不同氨基酸位点进行了饱和突变筛选，发现A166，V376，T196位点的部分突变体对新底物PPO的酶活有明显提升。进而对这些位点进行组合突变并构建突变体文库，从中筛选出本发明所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种L-谷氨酸脱氢酶突变体，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第166位氨基酸残基A，和/或第376位氨基酸残基V突变为碱性、亲水性或小位阻氨基酸残基后的序列。
根据本发明，所述的碱性、亲水性或小位阻是指突变后的氨基酸残基和野生序列中氨基酸残基相比碱性更强、更亲水或空间位阻更小。一般来说，只要166或376位任一位点突变后的氨基酸残基已经符合上述特性的情况下，另一位点突变后的氨基酸残基不必严格限制需具有上述特性。所述的氨基酸可以修饰或未修饰的天然氨基酸；本发明以天然氨基酸为例。
较佳地，所述第166位氨基酸残基A可以突变为G、C、E、H或T，和/或第376位氨基酸残基V可以突变为A、E、G、P、Q或S。
更佳地，本发明突变体还包括将SEQ ID NO.1所示的第196位氨基酸残基T突变为V、S或C。
进一步更佳地，所述第166位氨基酸残基A突变为G、H或T，第376位氨基酸残基V突变为E、G、Q或S，和/或第196位氨基酸残基T突变为S或C。
在本发明一较佳实施例中，所述第166位氨基酸残基A突变为G或T，或第376位氨基酸残基V突变为A或G。
较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.20，SEQ IDNO.22，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.32，SEQ IDNO.34，SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.38所示。
较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21，SEQ IDNO.23，SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.33，SEQ IDNO.35，SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.39所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸编码如权利要求1～4任一项所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
较佳地，编码所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.11，SEQ IDNO.13，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.23，SEQ IDNO.25，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.35，SEQ IDNO.37或SEQ ID NO.39所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种包含所述核酸的重组表达载体。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种包含所述核酸或所述重组表达载体的转化体。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种L-草铵膦盐的制备方法，其包括以下步骤：在反应溶剂、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，即得L-草铵膦盐。
所述制备方法中，除L-谷氨酸脱氢酶突变体为本发明所得，其余原料、反应步骤及条件均可为本领域常规，具体可参见上述CN106978453A以及本申请人的申请号为CN201810162629.4的专利申请。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还可进一步包括以下步骤：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐即可。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐可单独存在、或、与L-草铵膦盐共同存在(此时L-草铵膦盐可不发生反应)，例如：D型富集的草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D-草铵膦盐)、L型富集的草铵膦盐(即其中L-草铵膦的含量＞50％，不包括纯L-草铵膦盐的情况)或消旋体草铵膦盐等。
在所述的氧化反应中，所述的D氨基酸氧化酶(DAAO)的浓度可为本领域常规，较佳地为0.6-6U/mL，更佳地为3.6U/mL。
在所述的氧化反应中，所述D-草铵膦盐的浓度可为本领域常规，较佳地为100-600mM，更佳地为300mM。
所述的氧化反应还可在过氧化氢酶的存在下进行。
所述的氧化反应还可在通气的条件下进行。所述通气的速率较佳地为1VVM。当所述的氧化反应还可在通气的条件下进行时，所述的氧化反应还可在消泡剂的存在下进行。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为37℃。
所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应，得到L-草铵膦盐即可。
在所述的氨化反应中，所述的L-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的用量可为本领域常规，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度为0.09-3U/ml，较佳地为0.3-1.5U/ml，更佳地为0.9U/ml。
在所述的氨化反应中，所述的无机氨基供体的用量可为本领域常规，所述的无机氨基供体的浓度为100-2000mM，较佳地为600mM。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的浓度为100-600mM，较佳地为300mM。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的用量可为本领域常规，所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的摩尔比为1:30000-1:1000，较佳地为1:20000-1:5000，更佳地为1:10000。
在所述的氨化反应中，所述的无机氨基供体为氨气、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种。
在所述的氨化反应中，所述反应的温度可为本领域常规，为了保证所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的催化效率，进行所述氨化反应的温度较佳地为20-50℃，更佳地为37℃，当所述氨化反应的温度低于20℃时，氨化反应较慢；当所述氨化反应的温度高于50℃时，酶将不可逆变性失活。
在所述的氨化反应中，所述的反应溶剂为水。
在所述的制备方法中，进行所述氨化反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液等，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液等。所述的碱溶液较佳地为氨水。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还包括以下步骤：在脱氢酶(例如葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶等)以及供氢体(葡萄糖、异丙醇或甲酸盐等)的存在下，将氧化型辅酶NADP+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶与所述的供氢体一一对应，例如：
当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；
当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；
当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶的浓度可为本领域常规，较佳地为0.6-6U/mL，更佳地为2U/mL。
在所述的还原反应中，所述的供氢体的浓度可为本领域常规，较佳地为100-1000mM，更佳地为360mM。
在所述的还原反应中，所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规。
在所述的还原反应中，进行所述还原反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液等，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液等。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的还原反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为37℃。
所述的还原反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如本发明较佳实施例中所示：在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、氧化型辅酶NADP+、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应(同时存在着的NADP+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADPH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，较佳地为0.02-0.1mM，更佳地为0.03mM。
所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如本发明较佳实施例中所示：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)、脱氢酶、氢供体、氧化型辅酶NADP+、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应(同时存在着的NADP+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADPH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，较佳地为0.02-0.1mM，更佳地为0.03mM。
所述制备方法的反应时间在用常规方法进行检测的情况下，以原料的终浓度或产物的终浓度或转化率达到所需目的即可停止；所述常规方法包括柱前衍生化高效液相色谱或离子对色谱等。
本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：一种L-草铵膦的制备方法，其包括下述步骤：
(1)按照上述的L-草铵膦盐的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦进行酸化反应，得到L-草铵膦。
本发明解决上述技术问题的技术方案之七是：一种L-谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦盐中的应用。所述的应用可包括以下步骤：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行反应，即可，其中，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体为上述制得的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
以上化合物所述浓度若无特殊说明，均为反应前所述化合物占整个反应体系的浓度。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的L-谷氨酸脱氢酶突变体制备L-草铵膦时与野生型L-谷氨酸脱氢酶相比，能够催化的底物浓度更高。相关专利CN106978453A的最佳实施例中10mL L-谷氨酸脱氢酶能够催化的底物浓度为10-100mM，而本发明的最佳实施例中15mL L-谷氨酸脱氢酶突变体所能催化的底物浓度已经达到300mM了。本发明的L-谷氨酸脱氢酶突变体其降低了反应的成本，利于工业化生产。
附图说明
图1为利用L-谷氨酸脱氢酶突变体14参与反应时，制备所得产物中D-草铵膦与L-草铵膦的Marfey试剂柱前衍生化HPLC分析结果。
图2为外消旋草铵膦标准品的Marfey试剂柱前衍生化HPLC分析结果，其中最后两个峰是Marfey试剂空白样的峰。
图3为利用L-谷氨酸脱氢酶突变体14参与反应时，制备所得L-草铵膦的离子对HPLC分析结果。
图4为PPO标准品离子对HPLC分析结果。
图5为外消旋草铵膦标准品的离子对HPLC分析结果。
图6为PPO标准品的质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
表1
所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
表2
pET28a、pET21a和bugbuster protein extraction reagent购买自Novagen公司；DpnI酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；过氧化氢酶购买自山东丰泰生物科技有限公司。
产物的手性分析通过柱前衍生化高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm。流动相A：0.1％TFA+H2O，流动相B：0.1％TFA+CAN。检测波长：340nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：Marfey试剂。准确称取50mg的N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺，用乙腈溶解配置成25ml溶液，备用。
(3)衍生反应：取反应液稀释100倍，加等体积的Marfey试剂衍生。进样10μl进行分析。
转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％
2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(简称PPO)通过离子对高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)分析，具体的分析方法为：
色谱条件：ULtimate AQ-C18，5μm，4.6*250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二铵PH＝3.6:10％四丁基氢氧化铵水溶液：乙腈＝91:1:8；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。
实施例1 L-谷氨酸脱氢酶突变体文库的构建
针对序列表中SEQ ID NO.1的第166、376、196位点进行突变的突变体文库构建所设计的引物序列如表3所示。
表3
其中，N代表A、G、C、T中任何一种核苷酸，M代表A或C，K代表G或T；其根据所述位点需突变成的氨基酸的编码核苷酸来选择，如A166-正向引物中的NNK可以代表AAG(赖氨酸)、AAT(天冬氨酸)、AGG(精氨酸)或AGT(丝氨酸)等，具体氨基酸所对应的核苷酸可参见表2。
根据序列表中SEQ ID NO.1的序列合成基因cgGLUDH，基因合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司(苏州工业园区星湖街218号生物纳米科技园C3楼)，cgGLUDH的PDB号为5IJZ。然后以NdeI和HindIII酶切位点引入质粒pET21a，构建质粒pET21a-cgGLUDH。以质粒pET21a-cgGLUDH为模板，进行PCR扩增目的条带。
PCR扩增体系为：
试剂 用量(μL)
2XPCR buffer(含高保真酶) 25
引物F 1
引物R 1
模板 1
去离子水 22
PCR扩增程序如下：
对PCR产物进行DpnI消化，37℃，2hr。反应完成转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜，收菌，得到包含突变体文库的转化子。
实施例2高通量筛选突变体文库
按照如下实验步骤进行筛选：
将转化子接种96孔板培养，加IPTG 30℃过夜诱导。之后收菌，加bugbusterprotein extraction reagent裂解，离心得酶液。
配制终浓度分别为20mM的PPO、200mM的NH4Cl与0.37mM的NADPH的反应液，取上述反应液180μL于酶标板然后加入20μL酶液，总体系200μL，在酶标仪中读取OD340时的数值。以野生型为参照系，选择阳性克隆子，测序并检测其酶活。测序公司为生工生物工程(上海)股份有限公司，上海市松江区香闵路698号。
将所选阳性克隆子进行培养，方法如下：
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
挑单克隆接种至含100μg/ml氨苄霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含100μg/ml氨苄霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600值达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组L-谷氨酸脱氢酶突变体粗酶液。
酶活检测方法：25g/L湿菌体(均质机破碎)、10mM PPO、20mM辅酶(NADPH)、750mMNH4Cl，总体系为400μL，反应介质为pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。于30℃金属浴振荡反应器内反应6h，反应结束后加入2倍体积的乙腈终止反应。样品稀释一定倍数后利用柱前衍生化高效液相检测其L-草铵膦的浓度，并计算酶活。结果如表4所示。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmol L-草铵膦所需要的酶量。
表4
其中，*代表1U/ml以下，**代表酶活在3-5U/ml以下；***代表酶活在5-10U/ml之间；****代表酶活在10U/ml以上。
以下实施例中所用到的L-谷氨酸脱氢酶粗酶液的制备方法均采用上述方法。
实施例3 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的获取
根据专利US9834802B2中记载的AC302 DAAO酶的基因序列全合成DAAO酶基因。合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司，江苏省南京市江北新区研创园浦滨路211号。
实施例4 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的表达
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将实施例3合成的DAAO酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有DAAO酶的工程菌株。
将含有DAAO酶基因的工程菌株在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600值达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例5 D氨基酸氧化酶(DAAO)粗酶液的制备及酶活测定
将实施例4中收集到的菌体，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组DAAO酶粗酶液。
酶活检测方法：100μL pH 8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含D-草铵膦50mmol/L和过氧化物酶0.1mg/mL)，加入50μL显示剂(60μg/mL 2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和1mg/mL 4-氨基安替比林)，50μL的DAAO酶，510nm处检测紫外吸收测定H2O2浓度，计算出PPO的浓度，并计算酶活。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmol PPO所需要的酶量。
以下实施例中所用到的DAAO酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。
实施例6葡萄糖脱氢酶基因的获取和表达
根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，全合成葡萄糖脱氢酶基因。
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
葡萄糖脱氢酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌株。将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例7葡萄糖脱氢酶粗酶液的制备及酶活测定
将实施例6中收集到的菌体，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组葡萄糖脱氢酶粗酶液。
酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加980μL的pH 7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含葡萄糖400mM)，再加10μL NADP+(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。
单位酶活定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟产生1μmol NADPH所需要的酶量。
以下实施例中所用到的葡萄糖脱氢酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。
实施例8 L-谷氨酸脱氢酶突变体催化制备L-草铵膦
称取PPO、NADP+、NH4Cl和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入15mL根据实施例2方法制得的L-谷氨酸脱氢酶突变体1(1U/mL)、2(1.3U/mL)、8(2.1U/mL)、14(3U/mL)、15(2.8U/mL)和16(2.5U/mL)的粗酶液和1mL根据实施例7方法制得的葡萄糖脱氢酶粗酶液(100U/mL)，用50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使PPO的终浓度为300mM，氯化铵终浓度为600mM，葡萄糖终浓度360mM，NADP+终浓度为0.03mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，37℃水浴磁力搅拌反应10h后利用离子对HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的生成量和ee值。
反应结束数据如表5所示。CN106978453A的最佳实施例中10mL L-谷氨酸脱氢酶能够催化的底物浓度为10-100mM，而该实施例中15mL L-谷氨酸脱氢酶突变体所能催化的底物浓度已经达到300mM了。
产物中D-草铵膦与L-草铵膦的HPLC分析结果见图1(附图中均以L-谷氨酸脱氢酶突变体14为例进行说明)，其中，保留时间为13.735min的为L-草铵膦，D-草铵膦几乎检测不到；外消旋草铵膦标准品(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱如图2所示(L-草铵膦的保留时间为13.683min，D-草铵膦的保留时间为12.016min)。该实施例所制备得到的产物的成分与标准品中L-草铵膦的出峰时间基本一致，说明该实施例制备得到L-草铵膦。
制备所得PPO的离子对HPLC分析结果见图3，其中，10.121min为PPO的出峰位置，3.833min为L-草铵膦的出峰位置。PPO标准品(本标准品为实验室自制，制备方法参考文献US8017797B，图6为其对应的质谱图)的离子对HPLC图谱如图4所示，其中，PPO标准品的保留时间为9.520min。外消旋草铵膦标准品(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的离子对HPLC图谱如图5所示，其中，外消旋草铵膦标准品的保留时间为3.829min。可见，该实施例中PPO与产物草铵膦的出峰时间与各自标准品的出峰时间基本一致。
表5
实施例9 DAAO酶和L-谷氨酸脱氢酶突变体催化制备L-草铵膦
称取D,L-草铵膦、NADP+、NH4Cl和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入15mL根据实施例5方法制备的DAAO酶粗酶液(12U/mL)，0.2g 20万U/g过氧化氢酶，15mL根据实施例2中制得的L-谷氨酸脱氢酶突变体1(1U/mL)或14的粗酶液(3U/mL)和1mL根据实施例7方法制得的葡萄糖脱氢酶粗酶液(100U/mL)，用50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使草铵膦的终浓度为600mM，氯化铵终浓度为600mM，葡萄糖终浓度360mM，NADP+终浓度为0.03mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，37℃水浴磁力搅拌，按照1VVM通入空气(每分钟通入1倍反应体积的空气)，加入200μL消泡剂防止起泡，反应24h后利用离子对HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的生成量和ee值。反应结束数据表6所示。
表6
突变体酶编号 转化率 ee值
1 90％ 90％
14 99％ >99％
SEQUENCE LISTING
<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120> 一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
<130> P180113543C
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys
1 5 10 15
Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu
20 25 30
Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr
35 40 45
Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg
50 55 60
Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe
65 70 75 80
Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg
85 90 95
Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu
100 105 110
Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
145 150 155 160
Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
165 170 175
Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
180 185 190
Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
195 200 205
Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
245 250 255
Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
260 265 270
Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg
275 280 285
Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His
290 295 300
Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys
305 310 315 320
Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
325 330 335
Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro
340 345 350
Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln
370 375 380
Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg
385 390 395 400
Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala
405 410 415
Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala
420 425 430
Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
435 440 445
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A166-正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> k is g or t
<400> 2
gaatatcgcg atgttccgnn kggtgatatt ggtgtggg 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A166-反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> m is a or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
cccacaccaa tatcaccmnn cggaacatcg cgatattc 38
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V376-正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> k is g or t
<400> 4
gcaaatgccg gcggtnnkgc gaccagtgca ctg 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V376-反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> m is a or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
cagtgcactg gtcgcmnnac cgccggcatt tgc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T196-正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> k is g or t
<400> 6
gaatcaggtg tgctgnnkgg taaaggcctg acc 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T196-反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> m is a or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
ggtcaggcct ttaccmnnca gcacacctga ttc 33
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体1（V376A）
<400> 8
Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys
1 5 10 15
Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu
20 25 30
Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr
35 40 45
Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg
50 55 60
Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe
65 70 75 80
Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg
85 90 95
Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu
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Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
145 150 155 160
Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
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Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
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Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
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Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
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Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
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<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体1（V376A）
<400> 9
atgaccgttg acgaacaggt ttctaactac tacgacatgc tgctgaaacg taacgctggt 60
gaaccggaat tccaccaggc tgttgctgaa gttctggaat ctctgaaaat cgttctggaa 120
aaagacccgc actacgctga ctacggtctg atccagcgtc tgtgcgaacc ggaacgtcag 180
ctgatcttcc gtgttccgtg ggttgacgac cagggtcagg ttcacgttaa ccgtggtttc 240
cgtgttcagt tcaactctgc tctgggtccg tacaaaggtg gtctgcgttt ccacccgtct 300
gttaacctgg gtatcgttaa attcctgggt ttcgaacaga tcttcaaaaa ctctctgacc 360
ggtctgccga tcggtggtgg taaaggtggt tctgacttcg acccgaaagg taaatctgac 420
ctggaaatca tgcgtttctg ccagtctttc atgaccgaac tgcaccgtca catcggtgaa 480
taccgtgacg ttccggctgg tgacatcggt gttggtggtc gtgaaatcgg ttacctgttc 540
ggtcactacc gtcgtatggc taaccagcac gaatctggtg ttctgaccgg taaaggtctg 600
acctggggtg gttctctggt tcgtaccgaa gctaccggtt acggttgcgt ttacttcgtt 660
tctgaaatga tcaaagctaa aggtgaatct atctctggtc agaaaatcat cgtttctggt 720
tctggtaacg ttgctaccta cgctatcgaa aaagctcagg aactgggtgc taccgttatc 780
ggtttctctg actcttctgg ttgggttcac accccgaacg gtgttgacgt tgctaaactg 840
cgtgaaatca aagaagttcg tcgtgctcgt gtttctgttt acgctgacga agttgaaggt 900
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225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
245 250 255
Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
260 265 270
Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg
275 280 285
Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His
290 295 300
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Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
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Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro
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Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体7（A166C, V376A）
<400> 20
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<210> 22
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体8（A166G）
<400> 22
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<210> 23
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体8（A166G）
<400> 23
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<210> 24
<211> 447
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体9（A166G, V376G）
<400> 24
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115 120 125
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130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
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Tyr Arg Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
165 170 175
Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
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Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
195 200 205
Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
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Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
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Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
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Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
435 440 445
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<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体9（A166G, V376G）
<400> 25
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cgtgaaatca aagaagttcg tcgtgctcgt gtttctgttt acgctgacga agttgaaggt 900
gctacctacc acaccgacgg ttctatctgg gacctgaaat gcgacatcgc tctgccgtgc 960
gctacccaga acgaactgaa cggtgaaaac gctaaaaccc tggctgacaa cggttgccgt 1020
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<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体10（A166G, V376E）
<400> 26
Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys
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Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
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Tyr Arg Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
165 170 175
Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
180 185 190
Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
195 200 205
Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
245 250 255
Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
260 265 270
Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro
340 345 350
Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Glu Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln
370 375 380
Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg
385 390 395 400
Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala
405 410 415
Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala
420 425 430
Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
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<210> 27
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体10（A166G, V376E）
<400> 27
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aaagacccgc actacgctga ctacggtctg atccagcgtc tgtgcgaacc ggaacgtcag 180
ctgatcttcc gtgttccgtg ggttgacgac cagggtcagg ttcacgttaa ccgtggtttc 240
cgtgttcagt tcaactctgc tctgggtccg tacaaaggtg gtctgcgttt ccacccgtct 300
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ggtctgccga tcggtggtgg taaaggtggt tctgacttcg acccgaaagg taaatctgac 420
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35 40 45
Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg
50 55 60
Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe
65 70 75 80
Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg
85 90 95
Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu
100 105 110
Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
145 150 155 160
Tyr Arg Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
165 170 175
Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
180 185 190
Gly Val Leu Cys Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
195 200 205
Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
245 250 255
Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
260 265 270
Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg
275 280 285
Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His
290 295 300
Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys
305 310 315 320
Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
325 330 335
Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro
340 345 350
Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Ser Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln
370 375 380
Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg
385 390 395 400
Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala
405 410 415
Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala
420 425 430
Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
435 440 445
<210> 37
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体15（A166G, V376S, T196C）
<400> 37
atgaccgttg acgaacaggt ttctaactac tacgacatgc tgctgaaacg taacgctggt 60
gaaccggaat tccaccaggc tgttgctgaa gttctggaat ctctgaaaat cgttctggaa 120
aaagacccgc actacgctga ctacggtctg atccagcgtc tgtgcgaacc ggaacgtcag 180
ctgatcttcc gtgttccgtg ggttgacgac cagggtcagg ttcacgttaa ccgtggtttc 240
cgtgttcagt tcaactctgc tctgggtccg tacaaaggtg gtctgcgttt ccacccgtct 300
gttaacctgg gtatcgttaa attcctgggt ttcgaacaga tcttcaaaaa ctctctgacc 360
ggtctgccga tcggtggtgg taaaggtggt tctgacttcg acccgaaagg taaatctgac 420
ctggaaatca tgcgtttctg ccagtctttc atgaccgaac tgcaccgtca catcggtgaa 480
taccgtgacg ttccgggtgg tgacatcggt gttggtggtc gtgaaatcgg ttacctgttc 540
ggtcactacc gtcgtatggc taaccagcac gaatctggtg ttctgtgcgg taaaggtctg 600
acctggggtg gttctctggt tcgtaccgaa gctaccggtt acggttgcgt ttacttcgtt 660
tctgaaatga tcaaagctaa aggtgaatct atctctggtc agaaaatcat cgtttctggt 720
tctggtaacg ttgctaccta cgctatcgaa aaagctcagg aactgggtgc taccgttatc 780
ggtttctctg actcttctgg ttgggttcac accccgaacg gtgttgacgt tgctaaactg 840
cgtgaaatca aagaagttcg tcgtgctcgt gtttctgttt acgctgacga agttgaaggt 900
gctacctacc acaccgacgg ttctatctgg gacctgaaat gcgacatcgc tctgccgtgc 960
gctacccaga acgaactgaa cggtgaaaac gctaaaaccc tggctgacaa cggttgccgt 1020
ttcgttgctg aaggtgctaa catgccgtct accccggaag ctgttgaagt tttccgtgaa 1080
cgtgacatcc gtttcggtcc gggtaaagct gctaacgctg gtggttctgc tacctctgct 1140
ctggaaatgc agcagaacgc ttctcgtgac tcttggtctt tcgaatacac cgacgaacgt 1200
ctgcaggtta tcatgaaaaa catcttcaaa acctgcgctg aaaccgctgc tgaatacggt 1260
cacgaaaacg actacgttgt tggtgctaac atcgctggtt tcaaaaaagt tgctgacgct 1320
atgctggctc agggtgttat c 1341
<210> 38
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体16（A166H, V376S）
<400> 38
Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys
1 5 10 15
Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu
20 25 30
Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr
35 40 45
Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg
50 55 60
Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe
65 70 75 80
Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg
85 90 95
Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu
100 105 110
Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu
145 150 155 160
Tyr Arg Asp Val Pro His Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile
165 170 175
Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser
180 185 190
Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg
195 200 205
Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly
245 250 255
Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro
260 265 270
Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg
275 280 285
Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His
290 295 300
Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys
305 310 315 320
Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
325 330 335
Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro
340 345 350
Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Ser Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln
370 375 380
Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg
385 390 395 400
Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala
405 410 415
Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala
420 425 430
Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
435 440 445
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> L-谷氨酸脱氢酶突变体16（A166H, V376S）
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ggtctgccga tcggtggtgg taaaggtggt tctgacttcg acccgaaagg taaatctgac 420
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ggtcactacc gtcgtatggc taaccagcac gaatctggtg ttctgaccgg taaaggtctg 600
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ggtttctctg actcttctgg ttgggttcac accccgaacg gtgttgacgt tgctaaactg 840
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ctggaaatgc agcagaacgc ttctcgtgac tcttggtctt tcgaatacac cgacgaacgt 1200
ctgcaggtta tcatgaaaaa catcttcaaa acctgcgctg aaaccgctgc tgaatacggt 1260
cacgaaaacg actacgttgt tggtgctaac atcgctggtt tcaaaaaagt tgctgacgct 1320
atgctggctc agggtgttat c 1341

Claims (14)

1.一种L-谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第166位氨基酸残基A，
和/或第376位氨基酸残基V突变为碱性、亲水性或小位阻氨基酸残基后的序列。
2.如权利要求1所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述第166位氨基酸残基A突变为G、C、E、H或T，
和/或第376位氨基酸残基V突变为A、E、G、P、Q或S；
较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的序列还包括将SEQ ID NO.1所示的第196位氨基酸残基T突变为V、S或C；
更佳地，所述第166位氨基酸残基A突变为G、H或T，
和/或第376位氨基酸残基V突变为E、G、Q或S，
和/或第196位氨基酸残基T突变为S或C。
3.如权利要求1或2所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述第166位氨基酸残基A突变为G或T，
或第376位氨基酸残基V突变为A或G。
4.如权利要求1所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.14，SEQ IDNO.16，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.26，SEQ IDNO.28，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.32，SEQ ID NO.34，SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.38所示；较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.11，SEQ IDNO.13，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.23，SEQ IDNO.25，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.35，SEQ IDNO.37或SEQ ID NO.39所示。
5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～4任一项所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体；较佳地，编码所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.11，SEQID NO.13，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.23，SEQID NO.25，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.35，SEQID NO.37或SEQ ID NO.39所示。
6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体。
7.一种包含如权利要求5所述的核酸或如权利要求6所述的重组表达载体的转化体。
8.一种L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，即得L-草铵膦盐；其中，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体为如权利要求1～5任一项所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下步骤：在D-氨基酸氧化酶的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐即可；
较佳地，所述的D-草铵膦盐单独存在、或、与L-草铵膦盐共同存在；所述的与L-草铵膦盐共同存在的形式为D型富集的草铵膦盐、L型富集的草铵膦盐或消旋体草铵膦盐；
和/或，所述的D-氨基酸氧化酶的浓度为0.6-6U/mL，较佳地为3.6U/mL；其中，所述D氨基酸氧化酶的浓度为反应前D-氨基酸氧化酶的酶活(U)与D氨基酸氧化酶溶液的体积(ml)比值；
和/或，所述的氧化反应在通气的条件下进行，所述通气的速率较佳地为1VVM；
和/或，所述的氧化反应在过氧化氢酶的存在下进行；
和/或，所述的D-草铵膦盐的浓度为100-600mM，较佳地为300mM；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度为0.09-3U/ml，较佳地为0.3-1.5U/ml，更佳地为0.9U/ml；
和/或，所述的无机氨基供体的浓度为100-2000mM，较佳地为600mM；
和/或，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的浓度为100-600mM，较佳地为300mM；
和/或，所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的摩尔比为1:30000-1:1000，较佳地为1:20000-1:5000，更佳地为1:10000；
和/或，所述的无机氨基供体为氨气、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种，所述氨气的使用形式较佳地为氨水；
和/或，所述的反应溶剂为水；
和/或，所述氨化反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述氨化反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
11.如权利要求8～10任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下步骤：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可；较佳地，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；
和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；
更佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶的浓度为0.6-6U/mL，较佳地为2U/mL；
和/或，所述氧化型辅酶NADP+的浓度为0.02-0.1mM，较佳地为0.03mM；
和/或，所述的供氢体的浓度为100-1000mM，较佳地为360mM；
和/或，所述还原反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述还原反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
13.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
(1)按照权利要求8～12任一项所述的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦进行酸化反应，得到L-草铵膦。
14.一种如权利要求1～5任一项所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦盐中的应用。
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