CN113088500B - 一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备l-草铵膦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L‑草铵膦的方法。本发明通过定向进化与半理性设计相结合的分子改造方法，显著提高了源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶对PPO的催化活力；解决了还原胺化法制备L‑草铵膦工艺中NADH特异性谷氨酸脱氢酶酶活几乎没有酶活的问题；本发明谷氨酸脱氢酶突变体对PPO的催化活力显著提高，LB培养基摇瓶发酵的酶活最高达16.14U/mL；本发明谷氨酸脱氢酶突变体在L‑草铵膦的制备中，表现出良好的催化效率，底物转化率>99％，L‑草铵膦浓度最高达83.6g/L，ee值>99％，具有非常大的工业应用前景；本发明成功的解决了氨化还原反应制备L‑草铵膦过程中的生物催化剂活力低和辅酶稳定性的关键问题，为实现该工艺的工业化应用奠定了基础。

Description

一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L-草铵膦的方法

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L- 草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一种含磷氨基酸类灭生性除草剂，化学名称为2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，是全球第三大灭生性除草剂及第二大转基因作物除草剂，具有杀草谱广、低毒、活性高以及环境相容性好等优点。草铵膦有两种光学异构体，其中只有L-草铵膦具有除草活性。但目前，市场销售的草铵膦都是外消旋体混合物(D,L-草铵膦)，若能够以L-构形的纯光学异构体形式使用，草铵膦施用量将降低50％，可显著提高经济性、减轻环境压力。因此，光学纯L-草铵膦制备工艺的开发具有非常重要的意义。

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,EC 1.4.1.2～1.4.1.4)来源丰富且性质多样，在手性L-氨基酸合成领域具有非常大的应用潜力。利用谷氨酸脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)不对称还原胺化制备L-草铵膦，具有立体选择性严格、理论产率能够达到100％、产物易于分离提纯等显著优势。

专利CN106978453A通过筛选得到了酶活较高的谷氨酸脱氢酶，酶活最高达到35.54U/L (0.03554U/mL)，并在额外的辅酶再生体系配合反应下，制备了L-草铵膦，原料PPO转化率高达100％。

专利CN110184246A通过基因工程改造、获得了一种酶活更高的谷氨酸脱氢酶突变体，酶活最高达到11.21U/mL，在葡萄糖脱氢酶的配合下制备L-草铵膦，原料PPO转化率>99％，产品ee值>99％。但目前对PPO具有催化活力的谷氨酸脱氢酶都是NADP⁺/NADPH辅酶依赖型，辅酶NADP⁺/NADPH的价格是辅酶NAD⁺/NADH的2～3倍，导致L-草铵膦生产成本中辅酶的成本占比过高。

来源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶(CdGluDH，NCBI登录号：YP_001086649.1) 是NADH特异性谷氨酸脱氢酶，相较于NADPH特异性的酶来说辅酶成本更低，稳定性更好，但原始CdGluDH不能够还原胺化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成L-草铵膦。

发明内容

本发明针对来源于Clostridium difficile的原始谷氨酸脱氢酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示)对非天然底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸没有酶活的问题，提供了多个酶活显著提高的谷氨酸脱氢酶突变体，这些突变体可以用于制备L-草铵膦。

一种谷氨酸脱氢酶突变体，为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型谷氨酸脱氢酶突变所得，突变方式为以下一种：

(1)A145G、I174S、V352A或I408F；

(2)A145G/A380I、A145G/A380Y、A145G/A380S或A145G/A380C；I174S/A380I、I174S/A380Y、I174S/A380S或I174S/A380C；V352A/A380I、V352A/A380Y、V352A/A380S 或V352A/A380C；I408F/A380I、I408F/A380Y、I408F/A380S或I408F/A380C；

(3)A145G/T99V/I101Y、A145G/T99I/I101Y或A145G/T99V/I101F；I174S/T99V/I101Y、 I174S/T99I/I101Y或I174S/T99V/I101F；V352A/T99V/I101Y、V352A/T99I/I101Y或V352A/T99V/I101F；I408F/T99V/I101Y、I408F/T99I/I101Y或I408F/T99V/I101F；

(4)A145G/T353I/F357Y、A145G/T353S/F357Y或A145G/T353Y/F357C； I174S/T353I/F357Y、I174S/T353S/F357Y或I174S/T353Y/F357C；V352A/T353I/F357Y、 V352A/T353S/F357Y或V352A/T353Y/F357C；I408F/T353I/F357Y、I408F/T353S/F357Y或 I408F/T353Y/F357C；

(5)G72S/A145G/T99V/I101Y、G72C/A145G/T99V/I101Y或G72I/A145G/T99V/I101Y； G72S/I174S/T99V/I101Y、G72C/I174S/T99V/I101Y或G72I/I174S/T99V/I101Y；G72S/V352A/T99V/I101Y、G72C/V352A/T99V/I101Y或G72I/V352A/T99V/I101Y； G72S/I408F/T99V/I101Y、G72C/I408F/T99V/I101Y或G72I/I408F/T99V/I101Y。

本发明利用易错PCR技术对来源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶基因引入随机突变，构建随机突变文库，随后利用高通量筛选方法对该突变库进行筛选，获得的阳性突变株再利用HPLC法对其酶活进行复筛。复筛获得的对PPO催化活力有所提高的突变株通过测序分析其具体的突变情况。

基于上述定向进化获得阳性突变株的突变情况，设计并构建了三个突变文库，包含380 位的饱和突变库、99位与101位的组合突变库、353位与357位的组合突变库。通过高通量筛选技术对这三个突变库进行筛选，获得的阳性突变株再利用HPLC法对其酶活进行复筛，复筛获得的对PPO催化活力有所提高的突变株通过测序分析其具体的突变情况；在上述情况下对72位甘氨酸进行饱和突变，获得的阳性突变株再利用HPLC法对其酶活进行复筛，复筛获得的对PPO催化活力有所提高的突变株通过测序分析其具体的突变情况。

本发明又提供了所述谷氨酸脱氢酶突变体的编码基因。

优选的，野生型谷氨酸脱氢酶基因的NCBI登录号：YP_001086649.1，编码谷氨酸脱氢酶突变体的基因中编码G72氨基酸的密码子由GGT突变为GGG。

本发明又提供了所述谷氨酸脱氢酶突变体或所述编码基因在制备L-草铵膦中的应用。

本发明又提供了包含所述编码基因的表达载体。

本发明又提供了包含所述表达载体的基因工程菌。

本发明又提供了所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。通过对能够表达所述谷氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌进行发酵培养，然后制备酶液，可以用于催化制备L-草铵膦。

本发明还提供了一种制备L-草铵膦的方法，包括以下步骤：

(1)发酵培养所述基因工程菌，制备酶液；

(2)将所述酶液加入含有底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、铵离子及还原型辅酶的体系中，进行还原胺化反应，制得L-草铵膦。

所述还原型辅酶为NADH。

步骤(2)的反应体系中还包括辅酶再生系统，所述辅酶再生系统为以下任一种：

以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；

以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物的醇脱氢酶辅酶再生系统；

或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过定向进化与半理性设计相结合的分子改造方法，显著提高了源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)的催化活力；解决了还原胺化法制备L-草铵膦工艺中NADH特异性谷氨酸脱氢酶酶活几乎没有酶活的问题；本发明谷氨酸脱氢酶突变体对PPO的催化活力显著提高，LB培养基摇瓶发酵的酶活最高达 16.14U/mL；本发明谷氨酸脱氢酶突变体在L-草铵膦的制备中，表现出良好的催化效率，底物转化率>99％，L-草铵膦浓度最高达83.6g/L，ee值>99％，具有非常大的工业应用前景；本发明成功的解决了氨化还原反应制备L-草铵膦过程中的生物催化剂活力低和辅酶稳定性的关键问题，为实现该工艺的工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1为草铵膦的¹H NMR谱图。

图2为草铵膦的¹³C NMR谱图。

图3为D,L-草胺膦标样以及酶催化反应液(反应结束后)样品的柱前衍生化高效液相图谱。

具体实施方式

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：易错PCR的DNA聚合酶(EasyTaq DNA Polymerase)购自北京全式金生物；DNA聚合酶(

Max DNA Polymerase)和Dpn I购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；重组克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coliBL21(DE3)、质粒等购自Novagen公司；引物和全基因合成、基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术及有康生物有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

本发明所涉及带有谷氨酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌，所用载体为pET-28a(+)，所用宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为人工合成；DL- 草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；NAD⁺与NADH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。

谷氨酸脱氢酶酶活标准检测体系：适量的酶液、100mM底物、10mM NADH、500mM NH₄ ⁺((NH₄)₂SO₄)，总体系为400μL，反应介质为pH 7.5 0.1M磷酸盐缓冲液。35℃反应10 min，反应结束后加入40uL 5M NaOH终止反应。样品中生成的L-草铵膦浓度通过柱前衍生化HPLC进行定量。

酶活单位(U)的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol L-草铵膦所需要的酶量。

本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析反应液中底物的浓度，监测反应的进行。HPLC 分析方法为：色谱柱型号：

QS-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：50mM(NH₄)₂HPO₄, 加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸(质量分数)调pH至3.6，加入8％乙腈。检测波长：205nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃。

L-草铵膦的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：

QS-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：50mM 乙酸钠溶液:乙腈＝8:0.5。检测波长：338nm。流速：0.85mL/min。柱温：30℃。

(2)衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1g N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用 (不超过4天)。

(3)衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min。加入1mL纯水进行稀释，过膜，进样20μL进行分析。

实施例1基于易错PCR的Clostridium difficile来源谷氨酸脱氢酶(CdGluDH)定向进化

步骤一：CdGluDH重组菌的活化及质粒提取

来源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶(CdGluDH，基因的NCBI登录号：YP_001086649.1，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)基因为人工全基因合成，然后克隆到质粒pET-28a(+)中，插入到酶切位点BamHI和XhoⅠ之间，获得重组质粒pET-28a(+)-CdGluDH，将重组质粒pET-28a(+)-CdGluDH转染到宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组基因工程菌。

将带有pET-28a(+)-CdGluDH重组质粒的大肠杆菌工程菌使用LB培养基进行活化与培养。

LB培养基的具体配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。

将保存有重组菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-CdGluDH的甘油管划线至含有LB固体培养基(50μg/mL卡那霉素)的平皿上，37℃静置培养12h。从平皿上挑取单菌落接入含50μg/mL 卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12h。在获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。

步骤二：随机突变库的构建

以步骤一中提取的pET-28a(+)-CdGluDH质粒为模版，通过易错PCR(Error-pronePCR)向 CdGluDH基因引入随机突变，所用引物及PCR反应体系分别见表1、表2。

表1易错PCR所用引物

引物	序列(5’to 3’)<sup>a</sup>
		CdGluDH-F	cagcaaatgggtcgcgGATCCATGAGTGGTAA(BamHI)
CdGluDH-R	tggtggtggtgctcgaGTTAATACCAGCCACG(XhoⅠ)

^a注：在上、下游引物中分别加入限制性内切酶切位点，如下划线所示，具体限制性内切酶见引物序列括号内。

表2 PCR扩增体系

组分	体积(μL)
		EasyTaq DNA Polymerase	1
CdGluDH-F(10uM)	1.5
		CdGluDH-R(10uM)	1.5
10×EasyTaq buffer	5
		dNTPs(2.5mM)	4
质粒模板	1
		Mn<sup>2+</sup>溶液(5mM)	6
ddH<sub>2</sub>O	28

易错PCR扩增条件：

1)预变性94℃3min；

2)变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃2min(此阶段循环35次)；

3)后延伸72℃8min；

4)4℃保存。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，目标条带用DNA回收纯化试剂盒进行纯化回收。回收后的PCR扩增产物及表达载体pET-28a(+)分别用相应的限制性内切酶在37℃双酶切3h。酶切体系如下表所示：

表3酶切体系

试剂	体积(μL)
		PCR扩增产物/质粒	15
BamHI	2
		XhoⅠ	2
dd H<sub>2</sub>O	17
		10×Buffer	4

酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用T4 DNA连接酶将酶切产物连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如表4所示。将酶连产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂平板，置于37℃倒置培养至长出合适大小的单菌落。

表4酶接体系

试剂	体积(μL)
		PCR扩增产物	10
载体	7
		T4连接酶	1
10×连接酶Buffer	2

步骤三：随机突变库的高通量筛选-初筛

在灭菌的96深孔板中加入200μL的LB培养基(50μg/mL的卡那霉素)，使用灭菌枪头挑取单菌落至96深孔板。然后将深孔板置于37℃，200rpm培养8h，称之为一级板。在另外的灭菌的96孔板中加入400μL的LB培养基(50μg/mL的卡那霉素)作为二级板，在一级板中吸取50μL菌液至二级板，一级板加入20％的甘油放置于-80℃冰箱长期保藏。然后将二级板置于37℃进行震荡培养3h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，然后将二级板置于18℃，200rpm培养18h。

二级板在4000rpm，4℃下离心20min收集菌体，然后置于-80℃进行冷冻3h以上。将二级板从-80℃取出，室温下放置0.5h解冻，之后在每孔加入300μL溶菌液(10mM pH 7.5磷酸盐缓冲液，750mg/L溶菌酶，10mg/L DNaseⅠ)，震荡使细胞悬浮，并置于摇床 37℃，200rpm孵育1h。孵育结束后，4000rpm，4℃离心20min，取上清进行酶活测定。

配制筛选用测活混合溶液：pH 7.5磷酸盐缓冲液(0.1M)，2mM NADH，10mM底物PPO，1M NH₄ ⁺。向新的96孔板(反应板)各孔中加入200μL测活混合液，并置于37℃保温15min。吸取200μL酶液加入反应板中开始反应，分别于20min，40min和60min取样100uL加入到已经预先加好100μL pH 7.5磷酸缓冲液(0.1M)的酶标板中，用酶标仪测定340nm处吸光值。吸光值越低代表其催化活力越高，挑选吸光值较对照(野生型)显著降低的突变株作为候选菌株进行复筛。

步骤四：复筛

利用HPLC对初筛表现出酶活显著提高的突变体进行复筛。将一级板上相应的突变株经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50mL同样含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃下诱导培养 16h。培养结束后，将培养液12000g 4℃离心10min，弃上清，收集菌体。将收集到的菌体，用50mMpH 7.5的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，重悬于磷酸盐缓冲液中，400W功率超声破碎 30次，每次超声持续3s，间歇7s。将此细胞破碎液12000g 4℃离心10min去除沉淀，得到的上清为粗酶液。按照标准酶活检测体系对各突变株对PPO的粗酶液酶活进行测定。最终获得6株酶活具有显著提高的突变体，单位体积发酵液酶活为0.39-2.14U/mL。如表5所示。

表5通过定向进化获得的阳性突变总结

实施例2突变体A145G聚焦饱和突变库的构建及筛选

对CdGluDH的单点突变体中的A145G再进行二次突变，选取99、101、353、357及380位氨基酸残基进行饱和突变。设计引物(表6)，以pET-28a(+)-CdGluDH-A145G质粒为模版，以A380X-F、T99X/I101X-F或T353X/F357X-F与Fz-R为引物对进行PCR获得线性化短片段，再以A380X-R、T99X/I101X-R或T353X/F357X-R与Fz-F为引物对进行PCR获得线性化长片段。参考重组克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)使用说明书进行后续的DpnⅠ消化、胶回收、重组及转化操作，构建了380位的饱和突变库(A380X)、99位与101 位的组合突变库(T99X/I101X)、353位与357位的组合突变库(T353X/F357X)3个突变库。

表6聚焦饱和突变库构建所用引物

引物	序列(5’to 3’)
		A380X-F	AAGAAATTNNKATGGTGAAAGCATTTGAAA
A380X-R	TTCACCATMNNAATTTCTTCTTTCTGTTCC
		T99X/I101X-F	AGTGTGNDTGGCNDTCCGTATGGTGGCGGCAAAGG
T99X/I101X-R	ATACGGAHNGCCAHNCACACTGCATTTAAAGGTCA
		T353X/F357X-F	GGTGTTNDTGTGAGTTATNDTGAATGGGTTCAGAATCTGTATGGT
T353X/F357X-R	CCATTCAHNATAACTCACAHNAACACCACCGGCATTGGTCAGAAT
		Fz-F	TGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGG
Fz-R	CATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGA

通过实施例1所述高通量筛选方法对这3个突变库进行初筛，再通过HPLC法进行复筛。最终从380位的饱和突变库(A380X)中筛选获得四株对PPO酶活显著提高的突变株：A380I、A380Y、A380S、A380C；从99位与101位的组合突变库(T99X/I101X)中筛选出3株对PPO酶活显著提高的突变株：T99V/I101Y、TT99V/I101F、T99I/I101Y；从353位与357位的组合突变库(T353X/F357X)中筛选出3株对PPO酶活显著提高的突变株：T353I/F357Y、 T353S/F357Y、T353Y/F357C。具体的突变及酶活变化情况见表7。

表7 A145G突变体二次突变库的筛选结果

在表7结果的基础上，对三点突变株(A145G/T99V/I101Y)第72位的甘氨酸进行饱和突变，复筛结果如表8所示，发现其同义突变GGT→GGG，粗酶酶活提高为1.93±0.11U/ml。同义突变的氨基酸序列相同(蛋白质相同)，但基因序列不同。不同的基因序列会导致转录过程(从DNA到信使RNA)具有不同的效率；同时翻译过程(从信使RNA到蛋白质)也会有不同的效率；这些过程综合影响了最终的蛋白表达效率，有可能会提高蛋白的表达量。非同义突变的酶(蛋白质不同，氨基酸序列不相同)主要是单位酶量的酶活提高了。

表8对三点突变株(A145G/T99V/I101Y)的72位饱和突变库的筛选结果

实施例3突变体I174S聚焦饱和突变库的构建及筛选

对CdGluDH的单点突变体中的I174S再进行二次突变，选取99、101、353、357及380位氨基酸残基进行饱和突变。设计引物和实验操作与实施例2相同。通过实施例1所述高通量筛选方法对这3个突变库进行初筛，再通过HPLC法进行复筛。具体的突变及酶活变化情况见表9。

表9 I174S突变体二次突变库的筛选结果

在表9结果的基础上，对三点突变株(I174S/T99V/I101Y)第72位的甘氨酸进行饱和突变，复筛结果如表10所示，发现其同义突变GGT→GGG，粗酶酶活提高为16.14±0.5U/ml。

表10对三点突变株(I174S/T99V/I101Y)的72位饱和突变库的筛选结果

实施例4突变体V352A聚焦饱和突变库的构建及筛选

对CdGluDH的单点突变体中的V352A再进行二次突变，选取99、101、353、357及380位氨基酸残基进行饱和突变。引物T353X/F357X-F和T353X/F357X-R如表11所示，其他引物和实验操作与实施例2相同。

表11聚焦饱和突变库构建所用引物

引物	序列(5’to 3’)
		T353X/F357X-F2	GGTGCCNDTGTGAGTTATNDTGAATGGGTTCAGAATCTGTATGGT
T353X/F357X-R2	CCATTCAHNATAACTCACAHNGGCACCACCGGCATTGGTCAGAAT

通过实施例1所述高通量筛选方法对这3个突变库进行初筛，再通过HPLC法进行复筛。具体的突变及酶活变化情况见表12。

表12 V352A突变体二次突变库的筛选结果

在表12结果的基础上，对三点突变株(V352A/T99V/I101Y)第72位的甘氨酸进行饱和突变，复筛结果如表13所示，发现其同义突变GGT→GGG，粗酶酶活提高为1.37±0.09U/ml。

表13对三点突变株(V352A/T99V/I101Y)的72位饱和突变库的筛选结果

实施例5突变体I408F聚焦饱和突变库的构建及筛选

对CdGluDH的单点突变体中的I408F再进行二次突变，选取99、101、353、357及380位氨基酸残基进行饱和突变。设计引物和实验操作与实施例2相同。通过实施例1所述高通量筛选方法对这3个突变库进行初筛，再通过HPLC法进行复筛。具体的突变及酶活变化情况见表14。

表14 I408F突变体二次突变库的筛选结果

在表14结果的基础上，对三点突变株(I408F/T99V/I101Y)第72位的甘氨酸进行饱和突变，复筛结果如表15所示，发现其同义突变GGT→GGG，粗酶酶活提高为7.92±0.25U/ml。

表15对三点突变株(I408F/T99V/I101Y)的72位饱和突变库的筛选结果

实施例6谷氨酸脱氢酶(CdGluDH-A145G)、醇脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

菌体的培养及粗酶液制备：将表达CdGluDH-A145G谷氨酸脱氢酶突变体基因和醇脱氢酶基因(NCBI登录号：NZ_JYNW01000069.1，碱基序列克隆到表达质粒pET-28a(+)上，插入酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ，转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中。)的工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1L同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.6左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃下诱导培养16h。培养结束后，将培养液12000g 4℃离心10min，收集菌体，超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有100mM底物PPO，120mM异丙醇，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5 mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，醇脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加氨水控制pH为7.5。反应36h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余0.2mM，转化率99.8％。L-草铵膦的生成浓度为17.5g/L， ee值>99％。

实施例7谷氨酸脱氢酶突变株(CdGluDH-A145G/T99V/I101Y)，葡萄糖脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例6中同样的方法培养表达谷氨酸脱氢酶突变体(CdGluDH-T99V/I101Y)和葡萄糖脱氢酶(NCBI登录号：WP_087960837.1，碱基序列克隆到表达质粒pET-28a(+)上，插入酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ，转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中。)的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有500mM底物PPO，600mM葡萄糖，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5 mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，醇脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加氨水控制pH为7.5。反应2.5h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余2.4mM，转化率99.5％。L-草铵膦的生成浓度为80.6g/L， ee值>99％。

实施例8谷氨酸脱氢酶突变株(CdGluDH-A145G/T353I/F357Y)，甲酸脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例6中同样的方法培养表达谷氨酸脱氢酶突变体(CdGluDH-T353I/F357Y)和甲酸脱氢酶(NCBI登录号：P33160.3，碱基序列克隆到表达质粒pET-28a(+)上，插入酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ，转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中。)的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有500mM底物PPO，600mM甲酸铵，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5 mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，甲酸脱氢酶菌体(干重)浓度为10.0 g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加30％甲酸水溶液控制pH为7.5。反应5h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L- 草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余3.4mM，转化率99.3％。L-草铵膦的生成浓度为79.4g/L， ee值>99％。

实施例9谷氨酸脱氢酶突变株(CdGluDH-A145G/A380Y)，醇脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例6中同样的方法培养表达谷氨酸脱氢酶突变体(CdGluDH-A380Y)和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有500mM底物PPO，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，醇脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加氨水控制pH为7.5。分10批加入600mM异丙醇，反应10h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测 L-草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余4.6mM，转化率99.1％。L-草铵膦的生成浓度为78.7g/L， ee值>99％。

实施例10谷氨酸脱氢酶突变株(CdGluDH-A145G/T99V/I101Y/G72G)，醇脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例6中同样的方法培养表达谷氨酸脱氢酶突变体(CdGluDH-A145G/ T99V/I101Y/G72G)和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有500mM底物PPO，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，醇脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加氨水控制pH为7.5。分10批加入600mM异丙醇，反应12h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测 L-草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余0.8mM，转化率99.6％。L-草铵膦的生成浓度为83.6g/L， ee值>99％。

图1为制备的L-草铵膦的¹H NMR谱图。图2为制备的L-草铵膦的¹³C NMR谱图。

图3为D,L-草胺膦标样以及酶催化反应液(反应结束后)样品的柱前衍生化高效液相图谱。

对比例1谷氨酸脱氢酶(CdGluDH)、醇脱氢酶双酶耦联制备L-草铵膦

按实施例6中同样的方法培养表达原始谷氨酸脱氢酶(CdGluDH)和醇脱氢酶的工程菌，离心收集细胞，并超声破胞制备粗酶液。

反应体系为30mL，含有100mM底物PPO，120mM异丙醇，250mM(NH₄)₂SO₄与0.5 mM NAD⁺。谷氨酸脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L，醇脱氢酶菌体(干重)浓度为1.25g/L。通过水浴控制反应温度为35℃，反应过程通过滴加氨水控制pH为7.5。反应72h后利用非手性HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的生成量与ee值。

反应结束数据如下：PPO剩余98.1mM，L-草铵膦的生成浓度为0.0g/L。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L-草铵膦的方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> 艰难梭菌(Clostridium difficile)

<400> 1

Met Ser Gly Lys Asp Val Asn Val Phe Glu Met Ala Gln Ser Gln Val

1 5 10 15

Lys Asn Ala Cys Asp Lys Leu Gly Met Glu Pro Ala Val Tyr Glu Leu

20 25 30

Leu Lys Glu Pro Met Arg Val Ile Glu Val Ser Ile Pro Val Lys Met

35 40 45

Asp Asp Gly Ser Ile Lys Thr Phe Lys Gly Phe Arg Ser Gln His Asn

50 55 60

Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Gln Asn Val

65 70 75 80

Ser Arg Asp Glu Val Lys Ala Leu Ser Ile Trp Met Thr Phe Lys Cys

85 90 95

Ser Val Thr Gly Ile Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Val

100 105 110

Asp Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly

115 120 125

Tyr Ile Asp Gly Ile Tyr Lys Leu Ile Gly Glu Lys Val Asp Val Pro

130 135 140

Ala Pro Asp Val Asn Thr Asn Gly Gln Ile Met Ser Trp Met Val Asp

145 150 155 160

Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Gly Gln Ser Ser Ile Gly Val Ile Thr Gly

165 170 175

Lys Pro Val Glu Phe Gly Gly Ser Leu Gly Arg Thr Ala Ala Thr Gly

180 185 190

Phe Gly Val Ala Val Thr Ala Arg Glu Ala Ala Ala Lys Leu Gly Ile

195 200 205

Asp Met Lys Lys Ala Lys Ile Ala Val Gln Gly Ile Gly Asn Val Gly

210 215 220

Ser Tyr Thr Val Leu Asn Cys Glu Lys Leu Gly Gly Thr Val Val Ala

225 230 235 240

Met Ala Glu Trp Cys Lys Ser Glu Gly Ser Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu

245 250 255

Asn Gly Leu Asp Gly Gln Ala Met Leu Asp Tyr Met Lys Glu His Gly

260 265 270

Asn Leu Leu Asn Phe Pro Gly Ala Lys Arg Ile Ser Leu Glu Glu Phe

275 280 285

Trp Ala Ser Asp Val Asp Ile Val Ile Pro Ala Ala Leu Glu Asn Ser

290 295 300

Ile Thr Lys Glu Val Ala Glu Ser Ile Lys Ala Lys Leu Val Cys Glu

305 310 315 320

Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Glu Ala Asp Glu Val Phe Ala Glu

325 330 335

Arg Gly Ile Val Leu Thr Pro Asp Ile Leu Thr Asn Ala Gly Gly Val

340 345 350

Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Leu Tyr Gly Tyr Tyr Trp

355 360 365

Ser Glu Glu Glu Val Glu Gln Lys Glu Glu Ile Ala Met Val Lys Ala

370 375 380

Phe Glu Ser Ile Trp Lys Ile Lys Glu Glu Tyr Asn Val Thr Met Arg

385 390 395 400

Glu Ala Ala Tyr Met His Ser Ile Lys Lys Val Ala Glu Ala Met Lys

405 410 415

Leu Arg Gly Trp Tyr

420

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcaaatgg gtcgcggatc catgagtggt aa 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtggtggt gctcgagtta ataccagcca cg 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

aagaaattnn katggtgaaa gcatttgaaa 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

ttcaccatmn naatttcttc tttctgttcc 30

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

agtgtgndtg gcndtccgta tggtggcggc aaagg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

atacggahng ccahncacac tgcatttaaa ggtca 35

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

ggtgttndtg tgagttatnd tgaatgggtt cagaatctgt atggt 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

ccattcahna taactcacah naacaccacc ggcattggtc agaat 45

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgcagatccg gaacataatg gtgcaggg 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cattatgttc cggatctgca tcgcagga 28

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

ggtgccndtg tgagttatnd tgaatgggtt cagaatctgt atggt 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

ccattcahna taactcacah nggcaccacc ggcattggtc agaat 45

Claims (10)

1.一种谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型谷氨酸脱氢酶突变所得，突变方式为以下一种：

（1）A145G、I174S、V352A或I408F；

（2）A145G/A380I、A145G/A380Y、A145G/A380S或A145G/A380C；I174S/A380I、I174S/A380Y、I174S/A380S或I174S/A380C；V352A/A380I、V352A/A380Y、V352A/A380S或V352A/A380C；I408F/A380I、I408F/A380Y、I408F/A380S或I408F/A380C；

（3）A145G/T99V/I101Y、A145G/T99I/I101Y或A145G/T99V/I101F；I174S/T99V/I101Y、I174S/T99I/I101Y或I174S/T99V/I101F；V352A/T99V/I101Y、V352A/T99I/I101Y或V352A/T99V/I101F；I408F/T99V/I101Y、I408F/T99I/I101Y或I408F/T99V/I101F；

（4）A145G/T353I/F357Y、A145G/T353S/F357Y或A145G/T353Y/F357C；I174S/T353I/F357Y、I174S/T353S/F357Y或I174S/T353Y/F357C；V352A/T353I/F357Y、V352A/T353S/F357Y或V352A/T353Y/F357C；I408F/T353I/F357Y、I408F/T353S/F357Y或I408F/T353Y/F357C；

（5）G72S/A145G/T99V/I101Y、G72C/A145G/T99V/I101Y或G72I/A145G/T99V/I101Y；G72S/I174S/T99V/I101Y、G72C/I174S/T99V/I101Y或G72I/I174S/T99V/I101Y；G72S/V352A/T99V/I101Y、G72C/V352A/T99V/I101Y或G72I/V352A/T99V/I101Y；G72S/I408F/T99V/I101Y、G72C/I408F/T99V/I101Y或G72I/I408F/T99V/I101Y。

2.如权利要求1所述谷氨酸脱氢酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，野生型谷氨酸脱氢酶基因的NCBI登录号：YP_001086649.1，谷氨酸脱氢酶突变体的突变方式为A145G/T99V/I101Y、I174S/T99V/I101Y、V352A/T99V/I101Y或I408F/T99V/I101Y时，编码谷氨酸脱氢酶突变体的基因中编码G72氨基酸的密码子由GGT突变为GGG。

4.如权利要求1所述谷氨酸脱氢酶突变体、如权利要求2所述编码基因、或如权利要求3所述编码基因在制备L-草铵膦中的应用。

5.包含如权利要求2或3所述编码基因的表达载体。

6.包含如权利要求5所述表达载体的基因工程菌。

7.如权利要求6所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

8.一种制备L-草铵膦的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）发酵培养如权利要求6所述基因工程菌，制备酶液；

（2）将所述酶液加入含有底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、铵离子及还原型辅酶的体系中，进行还原胺化反应，制得L-草铵膦。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述还原型辅酶为NADH。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）的反应体系中还包括辅酶再生系统，所述辅酶再生系统为以下任一种：

以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；

以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物的醇脱氢酶辅酶再生系统；

或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

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