CN101892228A

CN101892228A - 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用

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Publication number: CN101892228A
Application number: CN 201010188495
Authority: CN
Inventors: 于慧敏; 马玉超; 沈忠耀
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: CN101892228B

Abstract

本发明公开了一种属于工业微生物技术领域的高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌、该工程菌的构建方法及其在微生物法生产丙烯酰胺中的应用。该工程菌是以高产腈水合酶且利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株为出发菌株，在该工程菌中额外表达突变的RNA聚合酶sigma因子基因，工程菌优选赤红球菌Rhodococcus ruber TH-5(amdA-)/pNV18A^M CGMCC No.3725。该工程菌对丙烯腈和丙烯酰胺的耐受性比出发菌株提高了一倍以上，在40％丙烯酰胺溶液中浸泡时腈水合酶半衰期延长了1.3倍。本发明还公开了该工程菌的构建方法及其在生产丙烯酰胺中的应用。利用本发明菌株生产丙烯酰胺，分批水合产物浓度高，反应批次增加，浓缩负担减少，从而显著降低生产成本。

Description

一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体地说涉及一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌、该工程菌的构建方法及其在微生物法生产丙烯酰胺中的应用。

背景技术

聚丙烯酰胺(PAM)被称为“百业助剂”，在三次采油、水处理、造纸、采矿、冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产领域具有非常广泛的应用。聚丙烯酰胺的单体-丙烯酰胺(Acrylamide，分子式为C₃H₅NO，结构式为H₂C＝CHCONH₂)的生产一般是以丙烯腈为原料，进行催化水合而成。微生物生产的腈水合酶，可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺，因此，微生物法生产丙烯酰胺已经逐渐取代化学转化法，成为丙烯酰胺生产的主要方法，具有反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等一系列优点。

利用微生物法生产丙烯酰胺研究的一个重要方面是对高产腈水合酶的天然菌株的发现、筛选、驯化和改造。

日本化学工业株式会社在专利《利用微生物制备酰胺的方法》(专利号：ZL86100062)公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；日本山田秀明研究组在专利《生物学生产酰胺的方法》(专利号：ZL88106735))中公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1；英国西巴特殊化学水处理有限公司在专利《紫红红球菌菌株NCIMB 41164及其生产腈水合酶的用途》(申请号：200480035487.1)中公开了一种了紫红红球菌NCIMB 41164菌株或其突变体；美国亚什兰许可和知识产权有限公司在专利《腈水合酶生产菌株紫红红球菌M33的培养方法》(申请号：200480043243.8)中公开了一种紫红红球菌M33；清华大学在专利《提高腈水合酶产物耐受性的定向培育法》(专利号为：ZL03130658)中公开了获得高耐受性腈水合酶的方法。清华大学在专利“一种腈水合酶基因工程菌的构建方法以及基因工程菌株和应用”中还公开了一种基因工程诺卡氏菌，具有高腈水合酶活性(申请号：200710122047.5)；日本三菱丽阳株式会社公开了《改良型腈水合酶》(申请号：200580016665.0)，提供了对腈水合酶基因进行定点突变来提高耐热性的方法。

在微生物法生产丙烯酰胺的实际过程中，通常存在的主要问题之一是有副产物丙烯酸生成。在利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株中，除腈水合酶外，还都存在酰胺酶(amidase)，在水合温度较高时可以将腈水合酶催化产生的丙烯酰胺进一步转化生成副产物丙烯酸，从而严重影响丙烯酰胺的质量和产量，同时增加分离纯化的难度和生产成本。清华大学在公开专利《敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用》中成功构建了敲除副产物基因的重组红球菌TH3(Rhodococcus ruber TH3(amdA-)，WO 2009/117843，保藏号为CGMCCNo.2381，解决了丙烯酰胺生产中的副产物积累问题。

在微生物法生产丙烯酰胺过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的产物耐受性较差，水合反应结束时产物浓度通常为280-330g/L，必须通过高温浓缩工序进一步浓缩后才能获得400g/L或500g/L的水剂丙烯酰胺产品，以及600g/L的结晶用母液。

细胞从脱氧核糖核酸(DNA)到信使核糖核酸(mRNA)的转录过程是由RNA聚合酶完成的。RNA聚合酶全酶中包含有一个σ转录因子，负责所有基因启动子的识别。在原核生物中σ⁷⁰是主要的sigma因子，可以同时负责成百上千个功能基因的转录，包括各种强化细胞对恶劣环境耐受性的功能基因的转录。Alper等2006年在Science上首次报道，在酿酒酵母Saccharomycescerevisiae中筛选、表达具有优选突变的转录因子spt15的基因，可以获得葡萄糖和乙醇耐受性显著改善的基因工程酵母菌(Alper et al.，Engineering yeasttranscription machinery for improved ethanol tolerance and production.Science，2006，314：1565-1568)。因此，过表达一种具有优选突变的转录因子，可以获得高环境耐受性的工程菌。

为了满足进一步提升丙烯酰胺产物浓度、减少浓缩工序能耗的生产需求，因此从转录水平上全局强化细胞的耐受性，构建了高丙烯酰胺/丙烯腈耐受性的产腈水合酶基因工程菌株是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种包含上述DNA分子的表达载体。

本发明的第三个目的在于提供一种包含上述DNA分子或上述表达载体的工程菌。该工程菌是具有高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌。

本发明的第四个目的在于提供一种上述产腈水合酶工程菌的构建方法。

本发明的第五个目的在于提供上述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。

一种碱基序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子，该DNA分子中包括表达RNA聚合酶sigma因子的突变基因sigA^M(即112-1455bp)和该基因的上游序列(第1-111bp)，具体突变信息如下：T85C，A122C，A288G，G320C，A399G，C532A，A604G，G616C，T673A，T718C，A1006G，T1245C，A1252C，C1217T。

一种包含上述DNA分子的表达载体，其中，原始表达载体为pNV18、pPHU281、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒。

一种包含上述DNA分子或上述表达载体的工程菌，该工程菌是具有高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌。所述工程菌的原始菌株是具有高腈水合酶酶活、并利用腈水合酶生产丙烯酰胺的野生菌株及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株，如红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌，尤其是指红球菌。

所述宿主菌的原始菌株优选为红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)CGMCC No.2381。

所述具有高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌最优选：赤红球菌(Rhodococcus ruber)TH-5(amdA-)/pNV18A^M，简称红球菌R.ruber TH-5(或TH5)，红球菌R.ruber TH-5于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.3725。红球菌R.ruber TH-5是以R.ruber TH3(amdA-)为出发菌，在敲除酰胺酶基因的基础上进一步过表达突变基因sigA^M后获得的高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌。该菌株同时携带四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因。

上述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌的构建方法，主要针对负责红球菌基因转录起始过程的RNA聚合酶sigma 70因子基因sigA，采用易错PCR或其它随机突变方法进行基因突变；优选的突变基因sigA^M由红球菌-大肠杆菌穿梭质粒载体携带，在产腈水合酶的原始菌中进行额外表达，即可获得耐受性显著强化的基因工程新菌株。按照如下步骤进行：

(1)以PS772和PS1670为引物，以高产腈水合酶的红球菌的基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应；所述上游引物PS772的碱基序列如SEQ ID No：3所示；所述下游引物PS1670的碱基序列如SEQ ID No：4所示；再通过热不对称基因扩增方法获得sigma 70因子全长sigA基因及其上游序列，其碱基序列如SEQ ID No：2所示；所述热不对称基因扩增方法所用三个嵌套引物分别为sigA5sp1、sigA5sp2、sigA5sp3，其碱基序列依次如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7所示；所述热不对称基因扩增方法所用四个简并引物依次为AD1、AD2、AD3、AD4，其碱基序列分别为SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11，序列中N指A、T、G、C任意一种碱基，I指次黄嘌呤；

(2)将目标sigA基因及其上游序列与红球菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行EcoR I和HindIII双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4DNA连接酶将两种酶切产物在3～5℃条件下进行连接反应14～16h，得到连接产物；

(3)将连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布的LB平板(卡那霉素抗性，Kan⁺)，挑选阳性克隆，进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得到带有sigA基因及上游序列的重组质粒；

(4)采用商用随机突变试剂盒(S trategene)构建sig A基因随机突变质粒文库；

(5)将步骤(4)所得随机突变质粒文库以电穿孔转化法转入原始宿主菌中，采用含有卡那霉素及致死浓度(4～6mg/mL)的丙烯酰胺的LB平板上筛选重组菌株，获得高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的工程菌。

步骤(1)中所述高产腈水合酶的红球菌优选为红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)CGMCC No.2381。

步骤(2)中所述红球菌-大肠杆菌穿梭质粒是pNV18、pPHU281、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒(Chiba K.，Hoshino Y.，Ishino K.et al.Construction of a pairof practical Nocardia-Escherichia coli shuttle vectors.Jpn.J.Infect.Dis.2007，60：45-47)，以及其它可用的红球菌-大肠杆菌穿梭质粒。

步骤(5)所述原始宿主菌是具有高腈水合酶酶活、并利用腈水合酶生产丙烯酰胺的野生菌株及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株，如红球菌、诺卡氏菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、丙酸棒杆菌或其它产腈水合酶的革兰氏阳性菌，尤其是指红球菌。

LB固体培养基的组成和配制方法参见J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著的《分子克隆指南》。

上述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。

利用上述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶基因工程菌催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺的方法，按照如下步骤进行：

(1)将在4℃保藏的高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶基因工程菌接入种子培养基中，在28～30℃、转速为150～250rpm的摇床上培养32～56小时，得到该腈水合酶工程菌的种子液；所述的种子培养基的组成及其比例为：葡萄糖10～30g/L，酵母膏1～5g/L，蛋白胨5～10g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.75g/L，K₂HPO₄ 0.5～0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，pH 7～8，四环素：10～60mg/L，其余为水；

(2)按照0.5～10％的体积百分比将步骤(1)的种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，在28～30℃、pH7.5～8.5条件下培养36～72小时，得发酵液；对发酵液进行离心，得产腈水合酶工程菌；所述发酵培养基的组成比例为：葡萄糖10～40g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，尿素5.0～10.0g/L，KH₂PO₄0.5～1.0g/L，K₂HPO₄ 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g/L，味精0.5～1.5g/L，CoCl₂ 0.04～0.12mM，pH 7.5～8.5，其余为水；

(3)按照8～20g干细胞/L的浓度配制步骤(2)所得产腈水合酶工程菌细胞的水悬浮液，其中，细胞悬浮液中腈水合酶活力为1500～4000U/ml；

(4)将步骤(3)得到的细胞悬浮液加入水合反应釜或锥形瓶中，然后向釜内或瓶中流加丙烯腈，在15℃～30℃，pH 6.5～9.0条件下反应1～6小时，检测丙烯酰胺浓度，丙烯酰胺浓度达到20～50％(W/V)时结束水合反应，得丙烯酰胺；

(5)采用中空纤维膜反应器分离丙烯酰胺水合液和细胞，回收利用产腈水合酶工程菌细胞催化剂，然后重新开始上述步骤(2)所述的水合反应过程，细胞可以反复使用4-12批次。

上述方法步骤(4)中所述的反应温度可通过液氨、低温冷冻盐水、冷却水或低温乙醇等调节。

上述方法步骤(5)中所述的中空纤维膜反应器分离丙烯酰胺和回收利用细胞催化剂的方法，详见中国发明专利ZL 03109806.1：“一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法”。

本发明的优点和有益效果：(1)本发明所得高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性强化型基因工程红球菌，具有高腈水合酶酶活、高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性以及无副产物积累等复合性能。与出发菌株相比，工程菌对丙烯酰胺和丙烯腈的耐受性分别提高1倍以上。在40％丙烯酰胺溶液中浸泡的工程菌腈水合酶半衰期延长了1.3倍。(2)本发明构建的高耐受性基因工程菌，其细胞生长和腈水合酶表达不受额外引入的多拷贝突变sigA^M基因的影响。(3)利用本发明菌株生产丙烯酰胺，分批水合产物浓度高，反应批次增加，浓缩负担减少，从而显著降低生产成本，且产品质量高，适于大规模工业化生产。

附图说明

图1是PCR扩增红球菌R.ruber TH3(amdA-)的sigA基因部分片断电泳图；

其中，M为DNA分子量标准，1为获得的sigA基因部分片段，长度约为899bp(碱基对)

图2是TAIL-PCR克隆红球菌sigA基因全长及其上游片段的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M为DNA分子量标准，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表引物SP1、SP2、SP3参与的3轮PCR产物；AD4代表由该简并引物完成的TAIL-PCR

图3是插入了红球菌R.ruber TH3(amdA-)的sigA基因及上游序列的重组穿梭质粒pNV18A的示意图；

图4是突变菌株在添加4mg/mL丙烯酰胺的12孔板培养基中的生长情况；

箭头所示均为丙烯酰胺耐受性显著提高的突变株，其中，耐受性最高、生长最好的菌株为工程菌R.ruber TH-5(amdA-)/pNV18A^M，简写为TH5

图5是工程菌R.ruber TH5在添加4mg/mL丙烯酰胺培养基中的生长情况；

其中，TH3为对照株R.ruber TH3(amdA-)；TH3A为携带未突变sigA基因的对照株R.ruber TH3(amdA-)/pNV18A；TH5为携带突变sigA^M基因的高耐受性工程菌R.ruber TH5(amdA-)/pNV18A^M

图6是工程菌R.ruber TH5在添加0.15％丙烯腈培养基中的生长情况；

图7是工程菌R.ruber TH5游离细胞浸泡40％丙烯酰胺的腈水合酶失活曲线。

具体实施方式

实施例1克隆红球菌Rhodococcus ruber TH3(amdA-)中编码sigma 70的sigA基因和上游序列

(1)红球菌Rh odococcus ruber TH3(amdA-)的培养及基因组总DNA的提取

用无菌的接种环挑取红球菌Rhodococcus ruber TH3(amdA-)(本实验室保存，并于2008年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.2381)单菌落，接种于50mL LB液体发酵培养基(LB液体发酵培养基的组成及其比例为：葡萄糖10g/L；酵母膏5g/L；蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L，其余为水)的三角瓶中；然后在温度为28℃、转速为200rpm的摇床中培养72小时，再在10000rpm下离心5min，收集菌体沉淀，10ml无菌水重悬，10000rpm下离心5min，收集菌体，酚/氯仿法(见：《分子克隆指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)提取菌体的总DNA，用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification Kit提取和纯化该红球菌总DNA。

(2)红球菌Rhodococcus ruber TH3(amdA-)的sigA基因部分片段的克隆

比较Nocardia farcinica IFM10152和Rhodococcus jostii RHA1的sigma 70型转录因子的基因序列，在蛋白质比较保守的位置设计了上游引物PS772(碱基序列见SEQ ID No：3)和下游引物PS1670(碱基序列见SEQ ID No：4)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成；然后用无菌水溶解引物至浓度为10μmol/L。PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均购自宝生物工程(大连)有限公司。以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以上述两条引物PS772和PS1670进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。

上游引物PS772：5′-CTCAAGCAGATCGGCAAG-3′(SEQ ID No：3)；

下游引物PS1670：5′-CGCGTTCAGTCCAGGTAGT-3′(SEQ ID No：4)；

PCR反应体系为：

扩增缓冲液 5μL

dNTP 5μL

引物P1 1μL

引物P2 1μL

总DNA溶液 1μL

EX Taq DNA聚合酶 0.5μL

无菌水 36.5μL

总体积 50μL；

反应条件为：94℃，10min；94℃1min、58℃1.5min、72℃1min，循环30次；最后72℃10min。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳显示了899bp的阳性条带(结果如图1所示)。按凝胶回收试剂盒方法回收PCR目标产物，并按连接试剂盒说明方法将其克隆至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)上。连接产物转化DH5α感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，最后在含有IPTG和X-gal的LB/Amp抗性平板上蓝白筛选阳性克隆，挑取白色菌落作为模板，分别以pMD18-T载体上的通用RV-M和M13-47为引物，进行菌落PCR扩增筛选。筛选出的目的菌株用LB液体培养基培养过夜，然后送菌液给北方诺赛基因组研究中心测序。结果(见图1)表明该片长899bp，是红球菌Rhodococcus ruber TH3(amdA-)中包含3′末端的部分sigA基因片段。

(3)采用TAIL-PCR(热不对称PCR)方法反向扩增获得红球菌Rhodococcusruber TH3(amdA-)的sigA基因全长及上游片段序列

根据步骤(2)已经获得的部分sigA基因序列，在5′末端分别设计三个嵌套引物sigA5sp1-sigA5sp3。所述的引物分别为：

sigA5sp1：5′-CGAGCAGATG GTTCTTGG-3′；(SEQ ID No：5)

sigA5sp2：5′-TGGCGAGTGAGACGACGAGT-3′；(SEQ ID No：6)

sigA5sp3：5′-TGGAGAACTTGTAACCCTTG GTG-3′。(SEQ ID No：7)

根据TAIL-PCR方法原理设计四个简并引物AD1-AD4，所述的引物序列分别为：

AD1：5′-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3′；(SEQ ID No：8)

AD2：5′-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3′；(SEQ ID No：9)

AD3：5′-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3′；(SEQ ID No：10)

AD4：5′-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3′。(SEQ ID No：11)

其中，N指A、T、G、C任意一种碱基；I指次黄嘌呤。

第一轮以Rhodococcus ruber TH3(amdA-)的基因组DNA为模板，以sigA5sp1为下游引物，分别以四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4为上游引物，进行如下TAIL-PCR变温循环：95℃，2min；5个循环(94℃，30s，60℃，1min，72℃，2min 30s)；94℃，30s，25℃，1min，72℃，2min 30s；10个循环(94℃，30s，44℃，1min，72℃，2min 30s)；15个循环(94℃，15s，62℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，15s，62℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，15s，44℃，1min，72℃，2min 30s)；72℃，10min。获得四种TAIL-PCR产物分别标记为PⅠ1-PⅠ4。依次类推，第二轮TAIL-PCR的以为sigA5sp2为下游引物，分别以四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4为上游引物；模板分别为第一轮获得产物PⅠ1-PⅠ4；第三轮TAIL-PCR以sigA5sp3为下游引物，分别以四个简并引物AD1、AD2、AD3和AD4为上游引物，模板即为第二轮的产物PⅡ1-PⅡ4，从而获得第三轮的TAIL-PCR产物PⅢ1-PⅢ4。第二轮和第三轮TAIL-PCR的条件为：15个循环(94℃，30s，58℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，30s，58℃，1min，72℃，2min 30s，94℃，30s，44℃，2min 30s，72℃，1min 30s)，72℃(10min)。三轮TAIL-PCR结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物的大小分布，结果如图2所示，简并引物AD4与3个嵌套引物sigA5sp1-sigAsp3进行TAIL-PCR时，第Ⅰ轮、第Ⅱ轮和第Ⅲ轮产物都有一条清晰的扩增带，而且第Ⅲ轮的条带比第Ⅱ轮略小，第Ⅱ条带比第Ⅰ轮略小，与嵌套引物在DNA序列上结合位置的差别相一致。然后按照步骤(2)的方法纯化第三轮TAIL-PCR产物，将此阳性条带回收后连接pMD18-T载体，再验证后送诺赛生物工程有限公司测序。用DNAMAN软件与步骤(2)获得的已知序列拼接起来。拼接后的含sigA基因片段及上游序列的全长为1947bp(见SEQ IDNo.2)，包含一个1344bp的sigA开放阅读框(从501bp到1942bp)。

实施例2 sigA基因随机突变文库的构建

(1)用于随机突变的重组质粒的构建

根据实施例1获得的包含sigA基因片段序列信息，设计了扩增产物包含sigA基因全长及上游序列的引物EsigAup和HsigAdown。上述引物序列如下：

EsigAup：5′-TCAGAATTCTCGTTACAATGGTGCACAG-3′(下划线为EcoRI酶切位点)；(SEQ ID No：12)

HsigAdown：5′-ACAAAGCTTCGCGTTCAGTCCAGGTAGT-3′(下划线为HindIII酶切位点)。(SEQ ID No：13)

以红球菌R.ruber TH3(amdA-)基因组DNA为模板，分别以EsigAup和HsigAdown为上下游引物，进行PCR扩增，反应体系及扩增条件同实施例1的步骤(2)。用EcoRI和HindIII分别对扩增产物(产物中包含sigA基因片断)和红球菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pNV18.1进行双酶切，37℃反应过夜；将酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，然后采用T4DNA连接酶将纯化后的两个酶切产物在4℃进行连接反应16h；将连接反应产物转化宿主菌E.coli JM109的感受态细胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性，Kan⁺)，挑选阳性克隆，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行酶切和电泳验证，得到含有sigA基因全长及上游片断的重组质粒pNV18A，全长5.9kb，如图3所示。

(2)sigA基因随机突变文库的构建

引物sigAupRM(5′-CGATCGTTACAATGGTGCACA-3′，SEQ ID No：14)和PS1670(碱基序列见(SEQ ID No：4)可以扩增出sigA基因及上游之间的序列作为完整的sigA基因。片段突变用Genemorph II随机突变试剂盒(Stratagene)按照其说明进行。试剂盒(Strategene)回收上述PCR产物后，继续以重组质粒pNV18A为模板，在EZClone enzyme作用下进行EZClone反应合成sigA基因突变质粒库。

实施例3丙酰胺生长耐受性强化突变株的筛选

将实施例2构建的sigA基因随机突变质粒文库以电穿孔法转化酰胺酶基因敲除的工程红球菌R.ruber TH3(amdA-)的感受态细胞，以卡那霉素抗性和致死丙烯酰胺浓度(4mg/ml)条件下筛选丙烯酰胺耐受性强化突变株。同时也将实施例2步骤(2)制备的含有内源性天然sigA基因的重组质粒pNV18A转入R.ruberTH3(amdA-)构建菌株TH3A做为对照参比菌株。其中，红球菌感受态细胞的制备采用《分子克隆指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔著)中革兰氏阳性菌感受态细胞的制备方法。取1μl纯化后的质粒于一个1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电转杯一起置于冰上预冷；将50μl制备好的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；打开电转仪，调节电压为1250V；将自杀质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，轻轻敲击使得混合物均匀进入电转杯的底部，同时注意混合物中不能有气泡。将电转杯放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入800μl的SOC液体培养基(配方见《分子克隆指南》)，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。置于28℃，220rpm摇床培养2h；取200μl菌液涂布于含有14μg/ml四环素的LB固体培养基平板，放入28℃培养箱培养48小时后出现重组红球菌的单菌落。挑取100个单菌落在含有4mg/ml丙烯酰胺和25μg/ml卡那霉素的12孔板中进行液体培养(28℃，48h)，筛选耐受性强化突变株，其中，液体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨7g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，味精1.0g/L，pH值为7.5，从中挑选出携带突变sigA^M基因的高耐受性优选突变株R.ruber TH-5(amdA-)/pNV18A^M，简称TH5，如图4所示。

将优选工程菌TH5与对照株TH3和TH3A在添加了丙烯酰胺(4mg/ml)和丙烯腈(0.15％)的LB液体培养基中进行摇瓶培养(30ml培养基/300ml瓶，含有25μg/ml卡那霉素，28℃培养48h)。结果表明，高耐受性突变株TH5对丙烯酰胺和丙烯腈的耐受性分别为出发菌株的2.1倍和2.0倍，如图5和图6所示。

测序分析优选工程菌TH5携带的sigA突变基因序列，其碱基序列见SEQ IDNo：1。

实施例4优选工程菌TH5的腈水合酶表达

采用500ml带挡板的三角摇瓶，装50ml培养基。将实施例3所得丙烯酰胺耐受性强化型重组红球菌TH5和出发红球菌TH3及对照株TH3A在28℃摇床分批培养，摇床转速为200rpm，培养48小时。所述培养基的组成比例为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH值为7.5，二价钴离子浓度为12mM，其余为水。结果表明，在分批发酵培养48h时，出发菌株TH3和对照菌株TH3A的酶活基本相同，而高耐受性工程菌TH5的腈水合酶酶活是出发菌株TH3和对照菌株TH3A的酶活的1.2倍。其中，腈水合酶的酶活检测采用标准的气相色谱内标法(王铁钢，罗晖，等，气相色谱法快速定量检测丙烯腈的生物催化产物，分析试验室，2007，26(1)：54-57)，酶活的国际单位(1U)定义为：每分钟催化生成1μmol丙烯酰胺所需的酶量。

实施例5优选工程菌TH5在40％丙烯酰胺溶液中浸泡过程中腈水合酶的失活曲线

在8000rmp离心收获如实施例4所述条件下摇瓶发酵培养48h的优选工程菌TH5的游离细胞，经50mM PBS(pH7.0)洗涤两次后，于40％(400g/L)丙烯酰胺溶液中浸泡，并放于脱色摇床上不停摇动。定时取样，再经50mM PBS(pH 7.0)洗两次后测量腈水合酶活性变化(将细胞在40％丙烯酰胺溶液中浸泡前的酶活定义为100％)，结果如图7所示。TH5的腈水合酶失活速率都小于对照菌株TH3和TH3A，而且半衰期也有所延长。优选工程菌TH5的失活速率显著下降，酶活降低到50％所用的时间大约为60分钟，而对照菌株TH3和TH3A在20-30分钟，腈水合酶活性就降低到50％。优选工程菌TH5耐受40％丙烯酰胺的腈水合酶半衰期分别延长了130％。

实施例6利用优选工程菌TH5生产丙烯酰胺的反应釜试验

在搅拌式夹套反应釜(上海联环生物工程设备有限公司)中配制细胞悬浮液，对TH5进行催化水合反应。反应体系中游离细胞含量为15g干重/L，其余为水，pH7.5。重悬液腈水合酶酶活为2500U/mL。向反应釜中连续滴加丙烯腈，滴加速度以控制反应温度为20℃来调节。反应5h，测定反应体系内丙烯酰胺产物浓度达到408g/L。说明工程菌TH5具有优良的丙烯腈和丙烯酰胺耐受性，可以在分批水合反应中直接获得高浓度的丙烯酰胺产物。

SEQUENCE LISTING

<110>清华大学

<120>一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用

<130>1

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1460

<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber

<400>1

cgatcgttac aatggtgcac agccggctgc gaaccggcct gatcccgaca gacctctccg 60

ccggaacccc tctggcgcga cgccgtacta cctcgtcacg aaagggcgta cgtggcagcc 120

acagacatcc acacggctga ttcccccaac gaatcggcag cctccgcgga cgccgcggaa 180

tccgcgaccg gtaccgcacc cgccacgaag cggccggcga agaaggcccc ggccaagaag 240

gcggccgcca agaaggcccc ggcgaagaag gccgccgcca agaagacgac ggcgaagaag 300

gccgccgcca agaaggcggg gaagccggcc ggcgacgagt tcgagggcga ggaagccgcg 360

ctcgaggaca tcgacgtcgc cgaggccgaa ctcgaaggca ccgaggacgt ggtcgtggag 420

gcggcggacg ccgacgacga gcccagcgac aaggacaagg cgtcgggcga cttcgtctgg 480

gacgaagagg agtcggaggc gctgcggcag gcccgcaagg acgccgagct gaccgcctcc 540

gccgactcgg tgcgcgccta cctcaagcag atcggcaagg ttgccctgct caacgccgag 600

gaggaggtcg agctcggcaa gcgcatcgag gccggcctgt acgcgaccta ccggctgcag 660

gagtacgccg acatgggcga gaagctgccg gtcgcgcagc gccgcgacct gaactggatc 720

tgccgcgacg gcaaccgcgc caagaaccat ctgctcgagg ccaacctgcg actcgtcgtc 780

tcactcgcca agcgctacac cggccggggg atggccttcc tggatctcat ccaggagggc 840

aatctcggtc tgatccgcgc ggtggagaag ttcgactaca ccaagggtta caagttctcc 900

acgtacgcca cctggtggat ccggcaggcc atcacccgcg ccatggcgga tcaggcccgc 960

accatccgca tcccggtcca catggtcgag gtgatcaaca agctcgaccg catccagcgt 1020

gagctcctcc aggacctcgg gcgcgagccc actccggagg aactggccaa ggagatggac 1080

atcacgccgg agaaggtact ggagatccag cagtacgccc gggagccgat ctcgctcgac 1140

cagaccatcg gcgacgaggg cgacagccag ctcggcgact tcatcgagga cagcgaggcc 1200

gtggtggcgg tggacgcggt gtcgttcacg ctgctgcagg atcagttgca gtaggtactc 1260

gagacactgt ccgaacgtga ggccggggtg gtccggctgc ggttcggcct gaccgacggt 1320

cagccgcgga ccctcgacga gatcgggcag gtctacgggg tcacccgcga gcggatccgg 1380

cagatcgagt cgaagaccat gtcgaagctg cggcacccgt cgcggtcgca ggtgctgcgc 1440

gactacctgg actgaacgcg 1460

<210>2

<211>1947

<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber

<400>2

tccgccgttg accatgattc cgaattcgag ctcggtaccc ggggtatcct ctagagattc 60

gtgcggacgt tggttaactt gtaacccatg gtgtggtcgt cctgctcacc ttcggaacag 120

ggatcggctc ggcggtgctg cacaacggcg ttctgttgcc gaacaccgag ttcgggcaca 180

tggaggtcga cgggatggaa gccgagcacc gcgcggcgtc gtcggtcaag gagagcgacg 240

agtggtcgta caagcggtgg gccaaggagg tctcgctggt gctgtcgcgg ttcgaggccc 300

tgctgtggcc cgacctgttc atcgccggcg gcggcaccag ccgcaagcac gagaagtgga 360

tcccgctgct gaccaaccgc acgcccgtcg ttccggccgc gttgcgcaac accgccggca 420

tcatcggggc cgcgtgggct gcgaaaacag gcgtccaccc ctgagtcctg cacatcgcgc 480

acgacggcga tcgttacaat ggtgcacagc cggctgcgaa ccggcctgat cccgacagac 540

ctctccgccg gaacccctct ggcgcgacgc cgcactacct cgtcacgaaa gggcgtacgt 600

ggcagccacc gacatccaca cggctgattc ccccaacgaa tcggcagcct ccgcggacgc 660

cgcggaatcc gcgaccggta ccgcacccgc cacgaagcgg ccggcgaaga aggccccggc 720

caagaaggcg gccgccaaga aggccccggc gaagaaggcc gccgccaaga agacggcggc 780

gaagaaggcc gccgccaaga aggcgggcaa gccggccggc gacgagttcg agggcgagga 840

agccgcgctc gaggacatcg acgtcgccga ggccgaactc gaaggcgccg aggacgtggt 900

cgtggaggcg gcggacgccg acgacgagcc cagcgacaag gacaaggcgt cgggcgactt 960

cgtctgggac gaagaggagt cggaggcgct gcggcaggcc cgcaaggacg ccgagctgaa 1020

cgcctccgcc gactcggtgc gcgcctacct caagcagatc ggcaaggttg ccctgctcaa 1080

cgccgaggag ggggtcgagc tcgccaagcg catcgaggcc ggcctgtacg cgacctaccg 1140

gctgcaggag tacgccgaca agggcgagaa gctgccggtc gcgcagcgcc gcgacctgaa 1200

ctggacctgc cgcgacggca accgcgccaa gaaccatctg ctcgaggcca acctgcgact 1260

cgtcgtctca ctcgccaagc gctacaccgg ccgggggatg gccttcctgg atctcatcca 1320

ggagggcaat ctcggtctga tccgcgcggt ggagaagttc gactacacca agggttacaa 1380

gttctccacg tacgccacct ggtggatccg gcaggccatc acccgcgcca tggcggatca 1440

ggcccgcacc atccgcatcc cggtccacat ggtcgaggtg atcaacaagc tcggccgcat 1500

ccagcgtgag ctcctccagg acctcgggcg cgagcccact ccggaggaac tggccaagga 1560

gatggacatc acgccggaga aggtactgga gatccagcag tacgcccggg agccgatctc 1620

gctcgaccag accatcggcg acgagggcga cagccagctc ggcgacttca tcgaggacag 1680

cgaggccgtg gtggcggtgg acgcggtgtc gttcacgctg ctgcaggatc agctgcagtc 1740

ggtactcgag acactgtccg aacgtgaggc cggggtggtc cggctgcggt tcggcctgac 1800

cgacggtcag ccgcggaccc tcgacgagat cgggcaggtc tacggggtca cccgcgagcg 1860

gatccggcag atcgagtcga agaccatgtc gaagctgcgg cacctgtcgc ggtcgcaggt 1920

gctgcgcgac tacctggact gaacgcg 1947

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因的部分片段的上游引物

<400>3

ctcaagcaga tcggcaag 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因部分片段的下游引物

<400>4

cgcgttcagt ccaggtagt 19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的嵌入引物1

<400>5

cgagcagatg gttcttgg 18

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的嵌入引物2

<400>6

tggcgagtga gacgacgagt 20

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的嵌入引物3

<400>7

tggagaactt gtaacccttg gtg 23

<210>8

<211>15

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的简并引物1

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n is a，c，g，or t

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>n is a，c，g，ort

<400>8

tg(a/t)gnag(a/t)anc(g/c)aga 15

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的简并引物2

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n is a，c，g，or t

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>n is a，c，g，or t

<400>9

ag(a/t)gnag(a/t)an ca(a/t)agg 16

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的简并引物3

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n is a，c，g，or t

<400>10

ca(a/t)cgicnga ia(g/c)gaa 16

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增sigA基因5′端序列的简并引物4

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n is a，c，g，ort

<400>11

tc(g/c)ticgnac it(a/t)gga 16

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增包含sigA基因全长及上游序列的上游引物

<400>12

tcagaattct cgttacaatg gtgcacag 28

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于扩增包含sigA基因全长及上游序列的下游引物

<400>13

acaaagcttc gcgttcagtc caggtagt 28

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<223>用于sigA基因片段突变的PCR的上游引物

<400>14

cgatcgttac aatggtgcac a 21

Claims

1.一种DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包含权利要求1所述DNA分子的表达载体。

3.包含权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述表达载体的工程菌。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的原始菌株是具有高腈水合酶酶活、并利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的原始菌株是红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是具有高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌：赤红球菌(Rhodococcus ruber)TH-5(amdA-)/pNV18A^M CGMCC No.3725。

7.一种权利要求3、4、5或6所述工程菌的构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)以PS772和PS1670为引物，以高产腈水合酶的红球菌的基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应；所述上游引物PS772的碱基序列如SEQ ID No：3所示；所述下游引物PS1670的碱基序列如SEQ ID No：4所示；再通过热不对称基因扩增方法获得sigma 70因子全长sigA基因及其上游序列，其碱基序列如SEQ IDNo：2所示；所述热不对称基因扩增方法所用三个嵌套引物分别为sigA5sp1、sigA5sp2、sigA5sp3，其碱基序列依次如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7所示；所述热不对称基因扩增方法所用四个简并引物依次为AD1、AD2、AD3、AD4，其碱基序列分别为SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ IDNo：11，序列中N指A、T、G、C任意一种碱基，I指次黄嘌呤；

(2)将目标sigA基因及其上游序列与红球菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行EcoRI和HindIII双酶切，36～38℃反应过夜；然后将酶切产物纯化，再用T4DNA连接酶将两种酶切产物在3～5℃条件下进行连接反应14～16h，得到连接产物；

(3)将连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，挑选阳性克隆，进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得到带有sigA基因及上游序列的重组质粒；

(4)采用商用随机突变试剂盒构建sigA基因随机突变质粒文库；

(5)将步骤(4)所得随机突变质粒文库以电穿孔转化法转入原始菌株中，采用含有卡那霉素及致死浓度4～6mg/mL的丙烯酰胺的LB平板上筛选重组菌株，获得高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的工程菌。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述高产腈水合酶的红球菌是红球菌(Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述红球菌-大肠杆菌穿梭质粒是pNV18、pPHU281、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒。

10.权利要求6所述高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。