CN116515802A - 天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本方案公开了基因工程技术和生物催化领域的一种天冬氨酸酶突变体，及其作为生物催化剂催化丙烯酸制备β‑丙氨酸的应用。所述的天冬氨酸酶突变体是以来源于Lysinibacillus halotolerans(耐盐赖氨酸芽胞杆菌)菌株的野生型天冬氨酸酶(氨基酸序列SEQ ID NO:2)作为亲本酶进行4～6个氨基酸位点组合突变而获得；所述的天冬氨酸酶突变体与野生型天冬氨酸酶相比，具有催化丙烯酸合成β‑丙氨酸的功能，可用于生物催化合成β‑丙氨酸规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术和生物催化领域，特别涉及一种天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用。
背景技术
β-丙氨酸(β-alanine)，又名3-氨基丙酸，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸是一种非蛋白质氨基酸，与蛋白质氨基酸α-丙氨酸互为同分异构体。β-丙氨酸可以在微生物、植物和昆虫体内合成，而哺乳动物需从外界环境中摄取。β-丙氨酸可用于合成泛醇、辅酶A、肌肽和鹅肌肽等多种高附加值产品，在生物体内具有许多重要的生理作用。因而，β-丙氨酸在医药、食品、化工和环境等领域具有广泛的应用价值。首先，β-丙氨酸作为一种营养因子，被广泛用作运动营养补充剂或食品添加剂。澳大利亚体育学院的膳食补充剂分类系统根据对运动表现有益的证据水平将β-丙氨酸描述为A类补充剂，已被确定为肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)合成的限速前体，并一直被证明能增加人类骨骼肌肌肽的水平。此外，工业上很多重要化合物如聚β-丙氨酸、3-羟基丙酸、聚3-羟基丙酸酯和药物巴柳氮等都是以β-丙氨酸为重要前体或中间体制备的。β-丙氨酸系列产品的全球需求量约为6万吨，且需求量仍在不断增加，预计到2025年全球市场需求可达10万吨，被认为是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。
目前，合成β-丙氨酸的方法可分为化学法和生物法。化学法是以丙烯腈为原料，通过液氨胺化得到β-氨基丙腈中间体，该反应在100-109℃，1Mpa压力的反应条件下进行；β-氨基丙腈进一步通过氢氧化钠碱解生产β-丙氨酸钠，再经盐酸中和获得β-丙氨酸，该步反应在90-95℃反应条件下进行，生产1吨β-丙氨酸需2吨氢氧化钠和2吨盐酸。β-丙氨酸化学法合成工艺设计高温、高压，能耗高，副产物多，且产生的三废较多。生物法合成β-丙氨酸包括生物发酵法和生物催化法。Sang Yup Lee等人通过对大肠杆菌的代谢工程改造，β-丙氨酸产量达到32g/L(Metabolic Engineering,2015,30,121-129)。此后，有一系列可用于发酵产生β-丙氨酸的工程菌株的报道。然而，微生物发酵法工业化生产β-丙氨酸仍然面临着效价和生产率适中、发酵成本过高和操作复杂等挑战，目前还较难实现产业化应用。
生物催化法合成β-丙氨酸可根据工艺路线或所使用的酶催化剂的差异分划分为两种。一种生物催化工艺路线是以富马酸为原料，通过天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化的胺化-脱羧生物级联反应制备β-丙氨酸，该工艺原子经济性差，涉及两步酶催化，所使用的生物酶量大，且反应过程和操作相对较复杂。另一种生物催化工艺路线是以丙烯酸为原料，通过酶催化的直接胺化反应制备β-丙氨酸(CN 109385415，CN 110923272)。该技术路线反应步骤短，操作简单，原子经济性高，具有较大的技术优势。然而，天然的天冬氨酸酶具有较高的底物特异性，只能催化天然底物富马酸进行氨化反应，需通过蛋白质工程技术对天冬氨酸酶进行分子改造，来获得可催化非天然丙烯酸类化合物进行氨化反应的突变体酶(ChemCatChem,2014,6,965-968；Nature Chemical Biology，2018，14,664–670)。
发明内容
本发明通过基因工程技术提供了一系列可用于催化丙烯酸制备β-丙氨酸的天冬氨酸酶突变体及其重组基因工程菌。
本方案中的天冬氨酸酶突变体，具体而言，是以来源于Lysinibacillushalotolerans菌株的野生型天冬氨酸酶(氨基酸序列SEQ NO:2，NCBI登录号：WP_122971212.1)作为亲本酶，通过蛋白质定向进化获得一系列活性改良的天冬氨酸酶突变体，由氨基酸序列SEQ ID NO:2中4-6个氨基酸位点组合突变而获得的天冬氨酸酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:10，此处的序列编号是偶数；基因序列SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:9，此处的序列编号是奇数)，具体如下：
天冬氨酸酶突变体，它是由SEQ ID NO:2氨基酸序列进行如下任意一种情况的组合突变得到：
(1)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
(2)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，且第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:6；
(3)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，且第357位谷胺酰氨突变为组氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:8；
(4)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，且第357位谷胺酰氨突变为组氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
本发明还提供了以上任意一种天冬氨酸酶突变体的重组基因工程菌。所述天冬氨酸酶基因工程菌所采用的宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)；对应表达天冬氨酸酶的载体可以是pET-21a(+)，pET-22a(+)，pET-22a(+)，pET-28a(+)，pETDuet-1，优选为pET-28a(+)载体；但不仅限于所述的大肠杆菌宿主和表达载体。
进一步，大肠杆菌发酵产天冬氨酸酶基因工程菌的培养基为LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH中性)，2×YT培养基(蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L，pH中性)，TB培养基(蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L，pH中性)，优选为TB培养基；培养温度为25～37℃，发酵前期的培养温度优选为37℃，产酶阶段培养温度优选为28℃。
进一步，通过离心收集表达重组天冬氨酸酶突变体的大肠杆菌细胞，或通过对大肠杆菌细胞进一步超声破碎而获得含天冬氨酸酶突变体的细胞裂解液，均可置于-20℃环境储存备用；含天冬氨酸酶突变体的大肠杆菌细胞或细胞裂解液也可通过冷冻干燥获得冻干细胞或冻干酶粉，可置于-4℃环境储存备用。含天冬氨酸酶突变体的大肠杆菌细胞或细胞裂解液也可通过冷冻干燥获得冻干细胞或冻干酶粉，可置于-4℃环境储存备用。以上所述的各种形式的天冬氨酸酶突变体均可用作生物催化剂，催化丙烯酸与氨水反应合成β-丙氨酸，反应式如下：
本发明有益的技术效果在于：本发明所提供的天冬氨酸酶突变体相比于野生型天冬氨酸酶(氨基酸序列SEQ ID NO:2)，其具有高效催化丙烯酸合成β-丙氨酸的功能。此外，本发明提供的产天冬氨酸酶突变体的基因工程不仅发酵培养技术成熟，而且获得的重组天冬氨酸酶突变体稳定性高、底物耐受性好，可应用于生物催化合成β-丙氨酸的工业化生产。
附图说明
图1为丙烯酸(保留时间7.25min)与β-丙氨酸(保留时间9.78min)化合物HPLC分析谱图。
具体实施方式
本发明构建的一系列天冬氨酸酶突变体，它们的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～SEQID NO:10(此处的序列编号是偶数)，基因序列SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:9(此处的序列编号是奇数)，是来源于Lysinibacillus halotolerans菌株的天冬氨酸酶(氨基酸序列SEQID NO:2，其对应的基因序列为SEQ ID NO:1)，在4～6个氨基酸位点发生组合突变获得的新蛋白质。这些突变后的蛋白质具有高效催化丙烯酸加氨合成β-丙氨酸的功能。天冬氨酸酶突变体氨基酸序列所对应的基因序列如下表1所示，其中需要强调的是天冬氨酸酶突变所对应的基因序列不仅限于表中所列，也包含通过“同义突变”获得的编码相同氨基酸的基因序列。
所谓“同义突变”即基因碱基发生了替换，但替换后的碱基序列所编码的氨基酸序列与替换前的碱基序列所编码的氨基酸序列一致。
表1：天冬氨酸酶突变体及其对应的氨基酸序列和编码基因碱基序列
| 天冬氨酸酶突变体编号 | 氨基酸序列 | 编码基因碱基序列 |
| ASPM1 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:3 |
| ASPM2 | SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:5 |
| ASPM3 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:7 |
| ASPM4 | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:9 |
为了方便表述，蛋白质的氨基酸缩写既可使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员所熟知的，这些氨基酸缩写对应的氨基酸如下表2所示：
表2：氨基酸缩写及中英文对照表
为了获得具有高活性和高稳定性天冬氨酸酶突变体用于催化丙烯酸加氨制备β-丙氨酸，本发明对编码野生型的天冬氨酸酶SEQ ID NO:2的基因序列SEQ ID NO:1进行点饱和突变，获得突变基因编码的天冬氨酸酶突变库；进一步，通过活性筛选，获得一系列活性提高的天冬氨酸酶突变体ASPM1～ASPM4，其对应氨基酸序列和编码基因序列如表1所示。这些天冬氨酸酶突变体均包含第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，另有ASPM3第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，ASPM4第357位谷胺酰氨突变为组氨酸。这些天冬氨酸酶突变体ASPM1～ASPM4与野生型天冬氨酸酶ASPM0相比，具有高效催化丙烯酸合成β-丙氨酸的功能。
本发明还提供了通过构建基因工程菌来表达这些天冬氨酸酶突变体。当天冬氨酸酶突变体氨基酸序列已知时，本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化子。这些基因、表达盒、质粒和转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程方法构建获得。
实施例中的分子生物学实验包括宿主感受态细胞的制备、质粒的构建、基因的酶切和连接、质粒转化、PCR基因扩增等实验技术，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)进行，必要时可以通过简单预实验确定详细可行的实验条件；本文所涉及的分子克隆相关试剂、质粒、宿主细胞均通过商业化公司获得。
实施例1：野生型天冬氨酸酶表达菌株的构建
对于来源于的天冬氨酸酶ASP0，根据报道的编码基因酸序列SEQ ID NO:1，委托基因合成公司进行全基因序列合成，亚克隆到pGM-T载体，转化至大肠杆菌E.coli DH5α宿主，获得含天冬氨酸酶基因的重组质粒pGM-T-ASP0转化体。
设计克隆引物：
正向引物F1：5’-CATATG ATGATGACGACAGAATTTCG-3’
正向引物R1：5’-CTCGAGTTAATTATTTACTAAAGTTTTG-3’
提取pGM-T-ASP0质粒作为基因模板，以F1和R1正、反向引物，通过PCR扩增ASP0编码基因，扩增片段约1.4kb。PCR反应体系50微升：引物F1和R1各1微升，质粒模板3微升，2×Premix PrimeSTAR 25微升，灭菌蒸馏水10微升。PCR程序：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃，10min。
PCR扩增结束，取5微升PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增出1.4kb片段后，将剩余的PCR产物通过胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增出来的目的基因5’端带有NdeI酶切位点，3’端带有XhoI酶切位点。
进一步，通过NdeI和XhoI消化回收的天冬氨酸酶基因片段，同时消化pET-28a(+)质粒载体。通过胶回收试剂盒回收消化后的ASP0基因片段和载体大片段。
进一步，通过T4 DNA连接酶，在16℃金属浴中连接过夜。基因连接体系20微升：载体片段14微升，ASP0基因片段5微升，T4 DNA连接酶1微升。
进一步，取10微生物过夜连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态宿主细胞，涂布于含有硫酸卡那霉素的固体LB平皿。培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，硫酸卡那霉素50μg/mL。含转化液的平皿倒置于37℃恒温培养箱培养12～16小时，在固体LB培养基上生长出大肠杆菌菌落。
进一步，经菌落PCR验证后，挑去数个重组克隆子培养，对宿主中的重组质粒pET-28-ASP0基因进行测序分析，确定宿主细胞所含质粒中的目的基因完全正确。
进一步，通过质粒抽提试剂盒提取E.coli DH5α宿主中的pET-28-ASP0质粒，将其转化至表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)感受态，涂布于含有硫酸卡那霉素的固体LB平皿。培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，硫酸卡那霉素50μg/mL。含转化液的平皿倒置于37℃恒温培养箱培养12～16小时，在固体LB培养基上生长出大肠杆菌菌落。通过菌落PCR验证，获得可表达野生型天冬氨酸酶ASP0的大肠杆菌基因工程菌。
实施例2：分子改造获得天冬氨酸酶突变体
以含野生型天冬氨酸酶ASP0(基因序列SEQ ID NO:1，氨基酸序列SEQ ID NO:2)为质粒模版，以F2和R2为正反引物，通过定点突变获得发生T189L的突变体。再以该突变体为质粒模版，以F3和R3为正反引物，构建M323、K326M、N328C三个位点组合饱和突变的文库，通过对突变体的筛选和测序，获得具有可催化丙烯酸合成β-丙氨酸功能的天冬氨酸突变体ASPM1(基因序列SEQ ID NO:3，氨基酸序列SEQ ID NO:4)。为了进一步获得催化效率改良的突变体，进一步以ASPM1为质粒模板，以F4和R4为正反引物，构建I105位点定点饱和突变文库，通过对突变体的筛选和测序，获得合成β-丙氨酸催化效率提升的天冬氨酸突变体ASPM2(基因序列SEQ ID NO:5，氨基酸序列SEQ ID NO:6)。同时，以ASPM1为质粒模板，以F5和R5为正反引物，构建Q357位点定点饱和突变文库，通过对突变体的筛选和测序，获得合成β-丙氨酸催化效率提升的天冬氨酸突变体ASPM3(基因序列SEQ ID NO:7，氨基酸序列SEQ ID NO:8)。最后，以ASPM3为质粒模板，以F6和R6为正反引物，对I105V位点进行定点突变体，获得合成β-丙氨酸催化效率进一步提升的天冬氨酸突变体ASPM4(基因序列SEQ ID NO:9，氨基酸序列SEQ ID NO:10)。
表3.突变引物设计
突变PCR体系(50微升)：5×Plus Buffer 10微升，正反引物各0.5微升，模板质粒2微升，dGTP mix 4微升，PrimerSTAR DNA聚合酶0.5微升，无菌水32.5微升。突变PCR一般程序：95℃、5min；98℃、10s，55℃、5s，72℃、8min，30个循环；最后72℃，10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，加入2.0微升NEB Dpn I限制性内切酶，37℃温浴3h，消化甲基化的模板质粒。取10微升消化后的PCR产物转化至表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)感受态。转化液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基的平皿上。
突变体的培养与初步筛选：挑取克隆子单菌落接种至深孔96孔板中，每个孔含0.8mL液体LB培养基的试管中，37℃培养8小时，再向每个孔中加入0.2mL新鲜LB培养基(含IPTG和卡那抗生素)，置于28℃恒温摇床继续培养12小时培养。将培养后的96孔板离心，除去上清液，保留菌体，加入1mL丙烯酸-氨水反应溶液(丙烯酸底物浓度50g/L，pH 8.5)重悬菌体，于40℃搅拌反应4小时，HPLC检测反应结果。
优良突变体活性验证：接种天冬氨酸酶突变体单菌落至含10mL液体LB培养基的试管中，37℃培养12小时，作为种子液。进一步，将种子液按2％体积比分别接种至500mL摇瓶，含有100mL液体LB培养基，置于37℃恒温摇床培养，待细胞浓度OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导重组天冬氨酸酶突变体在细胞内表达，在28℃条件下诱导继续生长12～14小时。将发酵液离心，除去上清液，收集含天冬氨酸酶突变体的大肠杆菌细胞。以湿细胞作为生物催化剂，催化丙烯酸合成β-丙氨酸。生物转化体系如下：向20mL丙烯酸-氨水反应溶液(丙烯酸底物浓度为100g/L，pH 8.5)，加入含天冬氨酸突变体的大肠杆菌细胞0.5g，于40℃搅拌反应12小时，HPLC检测反应结果。
HPLC分析条件：仪器，Thermo UltiMate 3000液相色谱仪；色谱柱，GL SciencesInertsil ODS-3；流动相，A:50mM磷酸二氢钾，0.1％辛烷磺酸钠，用磷酸调pH＝2.5，B:乙腈(A:B＝94:6)；流速：1mL/min。丙烯酸保留时间为7.25min，β-丙氨酸保留时间为9.78min。
表4.天冬氨酸酶合成β-丙氨酸活性验证
实施例3：大肠杆菌基因工程菌表达天冬氨酸酶突变体
将大肠杆菌基因工程菌转入250mL摇甁中培养，含50mL液体TB培养基。培养基组分：蛋白胨12g/L,酵母粉24g/L，甘油4mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL。在37℃恒温摇床培养，待细胞浓度OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导重组天冬氨酸酶突变体ASPM4在细胞内表达，在28℃条件下诱导继续生长12～14小时。发酵结束后，将发酵液离心，收集得到含有天冬氨酸酶突变体ASPM4的微生物细胞，置于-20℃冰箱保存备用；也可将微生物细胞一步冷冻干燥，作为冻干细胞，置于-20℃冰箱保存备用。
以下提供了本发明所述的天冬氨酸酶突变体用作生物催化剂，催化丙烯酸与氨水反应合成β-丙氨酸的具体实施例，反应式如下：
丙烯酸与 β-丙氨酸化合物 HPLC 分析谱图如图 1所示。
实施例4：天冬氨酸酶突变体ASPM4整细胞催化合成β-丙氨酸
以表达天冬氨酸酶突变体ASMP4的大肠杆菌湿细胞作为生物催化剂，生物转化体系如下：用氨水调节含不同丙烯酸浓度的水溶液至pH为8.0～8.5，获得丙烯酸-氨水反应溶液，其中丙烯酸的底物浓度为50～200g/L，氨水与丙烯酸的摩尔比摩尔比约为1.3～1.5：1；取500mL丙烯酸-氨水溶液加入1000mL三口烧瓶中，磁力搅拌400转/分钟；加入1～5g含天冬氨酸酶突变体ASPM4大肠杆菌湿细胞(冻干细胞的加入量为0.2～1.0g)，开始加氨反应。水解反应温度控制35～45℃，优选为40℃。
表5.天冬氨酸酶突变体ASPM4整细胞催化合成β-丙氨酸
| 丙烯酸浓度(g/L) | 细胞用量 | 反应时间(h) | 丙烯酸转化率(％) |
| 50 | 1g(湿重) | 12 | 76 |
| 100 | 3g(湿重) | 12 | >99 |
| 200 | 5g(湿重) | 12 | >99 |
| 50 | 0.2g(干重) | 12 | 84 |
| 200 | 1g(干重) | 12 | >99 |
实施例5：天冬氨酸酶突变体ASPM4细胞裂解液催化合成β-丙氨酸
以含天冬氨酸酶突变体大肠杆菌细胞裂解液作为生物催化剂，生物转化体系如下：用氨水调节含不同丙烯酸浓度的水溶液至pH为8.0～8.5，获得丙烯酸-氨水反应溶液，其中丙烯酸的底物浓度为50～200g/L，氨水与丙烯酸的摩尔比摩尔比约为1.3～1.5：1；取500mL丙烯酸-氨水溶液加入1000mL三口烧瓶中，磁力搅拌400转/分钟；加入5～50mL含天冬氨酸酶突变体ASPM4细胞裂解液，开始加氨反应。水解反应温度控制35～45℃，优选为38℃。
表6.天冬氨酸酶突变体ASPM4细胞裂解液催化合成β-丙氨酸
Claims (8)
1.天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述天冬氨酸突变体由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列突变而得到的如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10中的任一种所示的天冬氨酸突变体氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:4由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸而得。
3.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:6由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第105位异亮氨酸突变为缬氨酸而得。
4.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:8由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第357位谷胺酰氨突变为组氨酸而得。
5.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:10由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，第357位谷胺酰氨突变为组氨酸而得。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的天冬氨酸酶突变体经表达所获得的天冬氨酸酶基因工程菌。
7.一种生物催化剂，其特征在于：所述生物催化剂为通过权利要求6所述的天冬氨酸酶基因工程菌发酵获得的含天冬氨酸酶突变体的整细胞或细胞裂解液，或所述整细胞、细胞裂解液经冷冻干燥获得的冻干细胞或冻干酶粉。
8.根据权利要求7所述的一种生物催化剂应用于催化丙烯酸合成β-丙氨酸。
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|---|---|---|---|---|
| CN115851691A (zh) * | 2022-10-10 | 2023-03-28 | 杭州鑫富科技有限公司 | 一种天冬氨酸氨裂解酶突变体及其应用 |
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