CN110872595B - 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 - Google Patents

抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与合成生物学领域。具体地说，本发明涉及大肠杆菌的抗酸表达盒及其在工业微生物生产中的应用，可提高工业微生物在工业条件下的抗酸和发酵生产性能。

Description

抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程与合成生物学领域。具体地说，本发明涉及大肠杆菌的抗酸表达盒及其在工业微生物生产中的应用，可提高工业微生物在工业条件下的抗酸和发酵生产性能。
背景技术
随着生物技术的迅猛发展，微生物被广泛应用于发酵工业中。其中，有机酸和氨基酸发酵产业作为我国生物产业的重要组成，经济价值巨大。然而，在生产的经济性、环保性等方面尚存在诸多亟待解决的问题。如工业微生物在发酵过程中会逐渐积累大量的酸性产物或副产物，不断酸化发酵环境，不利于细胞生长和维持正常代谢活性，并最终影响生产过程中的经济性。因此，在实际工业生产过程中，需要使用大量的碱调节pH以维持中性发酵条件以维持应用微生物所需的生存和生产能力。而下游产物提取则需要重新加大量的酸将pH调至酸性，从而产生大量的能耗和下游污染。若能将生产菌株的耐酸胁迫性能提高，即可在较酸性条件下发酵，则能显著减低发酵过程的中和剂使用量和下游过程酸化剂使用量，进而减排节能。而且，酸性pH发酵也有助于抑制杂菌污染，提高发酵的稳定性。由此，耐酸工业菌株可以有效地降低发酵生产成本，提高生产的经济性，促进节能减排，在庞大的发酵工业中产生巨大的经济效益。
本领域仍然迫切需要耐酸的发酵微生物。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种表达盒，其由选自dsrA基因和hfq基因的至少一个抗酸调控基因、与所述抗酸调控基因可操作地连接的启动子和与所述抗酸调控基因可操作地连接的终止子组成。本发明的表达盒，在被导入至宿主细胞后能够提高宿主细胞的抗酸性。
在一些实施方式中，本发明的表达盒中的dsrA基因编码SEQ ID NO：1所示的非编码小RNA序列。在一些实施方式中，本发明的表达盒中的hfq基因编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的表达盒中的启动子选自SEQ ID NO：2、5-10所示的启动子。
在一些实施方式中，本发明的表达盒中的终止子为SEQ ID NO：3所示dsrA基因终止子或SEQ ID NO：11所示rrnB终止子。
在本发明一些实施方式中，所述表达盒从5’到3’由选自SEQ ID NO：2、6-7的启动子，编码SEQ ID NO：1所示的非编码小RNA序列的dsrA基因，以及SEQ ID NO：3所示dsrA基因终止子组成。在一些具体的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：12-14任一所示。在一些优选的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO：12。在一些优选的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO：13。
在本发明一些实施方式中，所述表达盒从5’到3’由选自SEQ ID NO：5、8-10的启动子，编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的hfq基因，以及SEQ ID NO：11所示rrnB终止子组成。在一些具体的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15-18任一所示。在一些优选的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO：15。在一些优选的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO：18。
在本发明另外一些实施方式中，所述表达盒由两部分组成，第一部分从5’到3’包含选自SEQ ID NO：2、6-7的启动子、编码SEQ ID NO：1所示的非编码小RNA序列的dsrA基因和SEQ ID NO：3所示dsrA基因终止子，第二部分从5’到3’包含选自SEQ ID NO：5、8-10的启动子、编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的hfq基因和SEQ ID NO：11所示rrnB终止子。在一些具体的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19-30任一所示。在一些优选的实施方式中，所述表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO：19、22、26。
在第二方面，本发明提供了表达构建体，其包含本发明的表达盒。
在第三方面，本发明提供了重组宿主细胞，其包含本发明的表达盒或本发明的表达构建体。所述重组宿主细胞优选是原核生物细胞，更优选细菌细胞，最优选大肠杆菌细胞。本发明的重组宿主细胞，与相应的不含所述表达盒或表达构建体的细胞相比，其抗酸性被提高。所述抗酸性能包括在酸冲击下的存活率和在酸压力条件下的生长率。
在第四方面，本发明提供了通过微生物发酵生产有机酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含本发明的表达盒或经本发明的表达构建体转化的产有机酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的有机酸。
本发明通过微生物发酵生产有机酸的方法中使用的产有机酸微生物优选原核微生物，更优选细菌，最优选大肠杆菌。可以通过本发明的方法产生的有机酸包括氨基酸(例如赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸)、丁二酸、柠檬酸和乳酸。
附图说明
图1.示出Pnat-DsrA抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pnatd-DsrA-rrnBT的构建。
图2.示出Pcad600-DsrA和Pcad290-DsrA抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pcad600-DsrA和pACYC184-Pcad290-DsrA-rrnBT的构建。
图3.示出Pnath-Hfq抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pnath-Hfq-rrnBT的构建。
图4.示出Pstat374-Hfq/Pstat52-Hfq/Pstat38-Hfq抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT/pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT/pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT的构建。
图5.示出Pnatd-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pnatd-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq-rrnBT的构建。
图6.示出Pcad-dsrA-Pnath/Pstat-hfq抗酸表达盒表达质粒pACYC184-Pcad-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq-rrnBT的构建。
图7.示出dsrA抗酸表达盒在酸压力冲击的存活结果。
图8.示出hfq抗酸表达盒在酸压力冲击的存活结果。
图9.示出dsrA-hfq双基因抗酸表达盒在酸压力冲击的存活结果。
图10.示出dsrA抗酸表达盒在酸压力生长测试的结果(左边为LBG培养基，右边为LBG-lysine)。
图11.示出hfq抗酸表达盒在酸压力生长测试的结果(左边为LBG培养基，右边为LBG-lysine)。
图12.示出dsrA-hfq双基因抗酸表达盒在酸压力生长测试的结果(左边为LBG培养基，右边为LBG-lysine)。
发明详述
本发明提供了由至少一个抗酸调控基因、与所述抗酸调控基因可操作连接的启动子和终止子组成的表达盒。所述表达盒在宿主细胞中能够表达其中的抗酸调控基因，从而提高宿主细胞的抗酸性，如酸冲击存活率、酸压力环境的生长率和酸压力环境下的发酵性能。
在本发明的表达盒中，启动子、抗酸调控基因和终止子可操作地连接以实现希望的抗酸调控基因在宿主细胞的表达。
如本文所用，“抗酸调控基因”指的是编码大肠杆菌的抗酸蛋白或非编码小RNA的基因，例如编码抗酸调控非编码小分子RNA的基因如dsrA基因，以及编码抗酸调控蛋白的基因如hfq基因。
在一些实施方式中，本发明的表达盒中的抗酸调控基因是大肠杆菌的抗酸调控基因dsrA。在一具体实施方式中，dsrA基因编码SEQ ID NO：1所示的野生型非编码小分子RNADsrA或其功能性变体。
在一些实施方式中，本发明的表达盒中的抗酸调控基因是大肠杆菌的野生型抗酸调控基因hfq。在一具体实施方式中，hfq基因编码SEQ ID NO：4所示的野生型Hfq或其功能性变体。
本发明的表达盒的启动子包括序列示于SEQ ID NO：2的dsrA基因天然启动子、序列示于SEQ ID NO：5的hfq基因天然启动子和序列分别示于SEQ ID NO：6-10的5个启动子Pcad290、Pcad600、Pstat374、Pstat52、Pstat38。上述Pcad290和Pcad600启动子是具有酸压力响应的启动效率不同的启动子，Pstat374、Pstat52、Pstat38启动子是强度和诱导时间不同的人工稳定期启动子。
本发明的表达盒的终止子包括序列示于SEQ ID NO：3的dsrA基因终止子，和序列示于SEQ ID NO：11的16S核糖体RNA rrnB操纵子的终止子rrnB。本领域已知各种可以在宿主细胞中终止靶基因转录的终止子，这样的终止子也涵盖在本发明的范围内。
在一些实施方式中，本发明提供了一种利用大肠杆菌调控基因dsrA构建的单基因抗酸表达盒，其由启动子、调控基因dsrA和dsrA基因终止子组成。在一些具体的实施方式中，使用选自dsrA的天然启动子Pnatd、酸压力响应启动子Pcad290和Pcad600的启动子来启动dsrA表达，并使用dsrA基因天然终止子终止dsrA转录。在一些具体的实施方式中，本发明的dsrA单基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：12-14任一所示。
在另一些实施方式中，本发明提供了一种利用大肠杆菌调控基因hfq构建的单基因抗酸表达盒，其由启动子、调控基因hfq和rrnB终止子组成。在一些具体的实施方式中，使用选自hfq的天然启动子Pnath、人工稳定期启动子Pstat38、Pstat52、Pstat374的启动子来启动hfq表达，并使用终止子rrnB终止hfq转录。在一些具体的实施方式中，本发明的hfq单基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15-18任一所示。
在另一些实施方式中，本发明提供组合了调控基因dsrA和hfq双基因抗酸表达盒。在一些具体实施方案中，双基因抗酸表达盒包含两部分：第一部分为与dsrA可操纵连接的选自dsrA的天然启动子Pnatd、酸压力响应启动子Pcad290和Pcad600的启动子，dsrA和dsrA基因的天然终止子；第二部分为与hfq可操纵连接的选自hfq的天然启动子Pnath、人工启动子Pstat38、Pstat52、Pstat374的启动子，hfq和rrnB终止子。
在一些具体实施方案中，双基因抗酸表达盒包含两部分：第一部分为与dsrA可操纵连接的dsrA的天然启动子Pnatd，dsrA和dsrA基因的天然终止子；第二部分为与hfq可操纵连接的选自hfq的天然启动子Pnath、人工启动子Pstat38、Pstat52、Pstat374的启动子，hfq和rrnB终止子。
在一些具体实施方案中，双基因抗酸表达盒包含两部分：第一部分为与dsrA可操纵连接的酸压力响应启动子Pcad290，dsrA和dsrA基因的天然终止子；第二部分为与hfq可操纵连接的选自hfq的天然启动子Pnath、人工启动子Pstat38、Pstat52、Pstat374的启动子，hfq和rrnB终止子。
在一些具体实施方案中，双基因抗酸表达盒包含两部分：第一部分为与dsrA可操纵连接的酸压力响应启动子Pcad600，dsrA和dsrA基因的天然终止子；第二部分为与hfq可操纵连接的选自hfq的天然启动子Pnath、人工启动子Pstat38、Pstat52、Pstat374的启动子，hfq和rrnB终止子。
在一些具体的实施方式中，本发明的双基因抗酸表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO：19-30任一所示。
本发明在另一方面提供了一种表达构建体，其包含本发明的表达盒。本发明的表达构建体可以基于任意合适的载体。用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一具体实施方案中，本发明的表达构建体基于商业质粒pACYC184(New Englend Biolab)构建。
本发明在另一方面还提供了重组宿主细胞，其包含本发明的表达盒或本发明的表达构建体。本领域已知通过密码子优化等手段，来自一种生物体的基因也能在其他生物体中起作用。因此，本发明的表达盒并不限于在大肠杆菌中使用。本发明重组宿主细胞优选是原核生物细胞，更优选细菌细胞，最优选大肠杆菌细胞例如E.coli MG1655菌株。本领域熟知各种将表达盒或表达构建体导入宿主细胞的方法，例如CaCl2法、电转法等。如实施例5和6所例证的，包含本发明的表达盒的重组宿主细胞，与相应的不含所述表达盒或表达构建体的对照细胞相比，其抗酸性被提高。
如本文所用，“抗酸性”包括在酸冲击下的存活率和/或在酸压力条件下的生长率。微生物例如大肠杆菌在酸冲击下的存活率或在酸压力条件下的生长率可如本申请实施例所描述的方法进行测定。如本文所用，“酸冲击”是指将微生物置于能够影响微生物存活的极端酸性条件下培养一段合适的时间。本领域技术人员能够确定对于微生物的酸冲击条件。例如，对于大肠杆菌，酸冲击是指在pH 2.0-pH 3.0，优选pH 2.5下培养例如1、2、3、4、5小时，优选培养2小时。“酸压力”是指主要影响微生物生长的酸性条件。本领域技术人员能够确定对于微生物的酸压力条件。例如，对于大肠杆菌，酸压力是指pH低于7.0但高于4.5，例如pH 6.0。
本发明另一方面还提供了本发明的表达盒在赋予微生物提高的抗酸性中的用途。
本发明另一方面还提供了产生具有提高的抗酸性的微生物的方法，包括将本发明的表达盒导入所述微生物。
本发明在另一方面提供了通过微生物发酵生产有机酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含本发明的表达盒或经本发明表达构建体转化的产有机酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的有机酸。
在一些实施方案中，所述步骤a)包括向产有机酸微生物导入本发明的表达盒或本发明的表达构建体。本发明的通过微生物发酵生产有机酸的方法中使用的产有机酸微生物优选原核微生物，更优选细菌，最优选大肠杆菌。可以通过本发明的方法产生的有机酸包括氨基酸(例如赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸)、丁二酸、柠檬酸和乳酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产赖氨酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产赖氨酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的赖氨酸。
优选地，所述表达盒选自SEQ ID NO：12、18、19、22、23、26、27、28和30。优选地，所述表达盒选自SEQ ID NO：12、18、19、22和26。更优选地，所述表达盒是SEQ ID NO：26所示表达盒。优选地，所述产赖氨酸微生物是产赖氨酸大肠杆菌。更优选地，所述产赖氨酸微生物是大肠杆菌SCEcL3(pSLL1)菌株。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产苏氨酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产苏氨酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的苏氨酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产色氨酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产色氨酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的色氨酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产谷氨酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产谷氨酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的谷氨酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产丁二酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产丁二酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的丁二酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产柠檬酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产柠檬酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的柠檬酸。
在一具体实施方式中，本发明提供了通过微生物发酵生产乳酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含SEQ ID NO：12-30中任一所示的表达盒或经包含所述表达盒的表达构建体转化的产乳酸微生物；
(b)对所述微生物进行发酵；和
(c)收获所产生的乳酸。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围内。
实施例1、构建dsrA抗酸表达盒
1.1构建Pnat-DsrA抗酸表达盒的pACYC184表达载体
本申请实施例中所使用的Pnat-DsrA表达载体pACYC184-Pnat-DsrA的构建过程，如图1所示。
首先使用试剂盒(Promega，A1125)提取大肠杆菌MG1655(Novagen)基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得含基因上下游包括天然启动子和终止子的Pnat-DsrA多核苷酸片段：上游引物5'-TATCTCAAGCTTGACGTCCATAGTCGCGCAGTACTCCT-3'(HindIII-AatII-DsrA-for，SEQ ID NO：31，带下划线碱基为限制性内切酶Hind III和Aat II识别位点)，和下游引物5'-TATCTAGTCGACCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'(DsrA-rev，SEQ ID NO：32，带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Hind III和Sal I进行双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pACYC184(New Englan Biolab，NEB)进行连接，将连接产物转化到E.coli MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB(Luria-Bertani培养基)平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pnat-DsrA序列正确。
1.2构建Pcad600-DsrA的pACYC184表达载体的抗酸表达盒
本申请实施例中所使用的Pcad600-DsrA表达载体pACYC184-Pcad-DsrA的构建过程，如图2所示。
PCR扩增Pcad600多核苷酸片段：以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增：上游引物5'-ACACCTGACGTCTAGATGCCGGAATTGAACAACCTG-3'(Pcad600-for，SEQ ID NO：33，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-CTGATGTGTTGCATGCAAGATTACTCACGAAAAAAG-3'(Pcad-rev，SEQ IDNO：34)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，60℃30sec，72℃1min，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
PCR扩增dsrA多核苷酸片段(包括dsrA基因转录起始位置到终止子区域)：以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增：上游引物5'-TAATCTTGCATGCAACACATCAGATTTCCTGGTGTA-3(Pcad-DsrA-for，SEQ ID NO：35)，和5'-TATCTAGTCGACCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'(DsrA-rev，SEQ ID NO：32，带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，60℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
重叠PCR扩增Pcad-DsrA多核苷酸片段：以前述获得的Pcad、DsrA为模板，进行重叠PCR反应。先在不加入引物的情况下，使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，65℃20sec，72℃1min 30sec，共10个循环。然后加入上游引物(Pcad600-for，SEQ ID NO：34)和下游引物(DsrA-rev，SEQ ID NO：32)，使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，62℃30sec，72℃1min 30sec，共25个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
将得到重叠PCR产物Pcad600-DsrA用限制性内切酶Aat II和Sal I进行双酶切后，将质粒pACYC184-Pnat-DsrA经同样酶双酶切，切胶回收纯化，然后将酶切后的Pcad600-DsrA和pACYC184进行连接，将连接产物转化到E.coli MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pcad600-DsrA序列正确。
1.3构建Pcad290-DsrA的pACYC184表达载体的抗酸表达盒
本申请实施例中所使用的Pcad-DsrA表达载体pACYC184-Pcad290-DsrA的构建过程，如图2所示。
PCR扩增Pcad290多核苷酸片段：以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增：上游引物5'-ACACCTGACGTCTAGAAGTAACTCCGGGTTGATTTA-3'(Pcad290-for，SEQ ID NO：36，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-CTGATGTGTTGCATGCAAGATTACTCACGAAAAAAG-3'(Pcad-rev，SEQ IDNO：34)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，60℃20sec，72℃1min，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
PCR扩增dsrA多核苷酸片段(包括dsrA基因转录起始位置到终止子区域)：以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增：上游引物5'-TAATCTTGCATGCAACACATCAGATTTCCTGGTGTA-3(Pcad-DsrA-for，SEQ ID NO：36)，和5'-TATCTAGTCGACCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'(DsrA-rev，SEQ ID NO：32，带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，60℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
重叠PCR扩增Pcad290-DsrA多核苷酸片段：以前述获得的Pcad290、DsrA为模板，进行重叠PCR反应。先在不加入引物的情况下，使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，65℃20sec，72℃1min30sec，共10个循环。然后加入上游引物(Pcad290-for，SEQ ID NO：36)和下游引物(DsrA-rev，SEQ ID NO：32)，使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，65℃20sec，72℃1min 30sec，共25个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带，并进行凝胶分离回收。
将得到重叠PCR产物Pcad290-DsrA用限制性内切酶Aat II和Sal I进行双酶切后，将质粒pACYC184-Pnat-DsrA经同样酶双酶切，切胶回收纯化，然后将酶切后的Pcad290-DsrA和pACYC184进行连接，将连接产物转化到E.coli MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pcad290-DsrA序列正确。
实施例2、构建Hfq抗酸表达盒
2.1构建Pnath-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体pACYC184-Pnath-Hfq-rrnB
本申请实施例中所使用的Pnat-Hfq表达载体pACYC184-Pnath-Hfq-rrnB的构建过程，如图3所示。
以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得含hfq基因天然启动子和hfq基因的Pnath-Hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AGCTTGACGTCGGATCCCACTGT TAGTGGG-3'(Pnath-Hfq-F，SEQ ID NO：37,带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：38，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Aat II和Xho I进行双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pACYC184-ParaBAD-Hfq-rrnBT(此载体为发明人在pACYC184的基础上构建的载体，所述质粒的全长序列可见于SEQ ID NO：39)进行连接，将连接产物转化到E.coli MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pnath-Hfq-rrnBT序列正确。
2.2构建Pstat374-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pstat374-Hfq表达载体pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT的构建过程，如图4所示。
以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从Hfq的RBS到终止密码子之间的hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AATATTGTTCTATACTGTATTGATCGATAAGCTTGATATCTATCGTGCGCAATTTTTTC-3'(374-Hfq-F1，SEQID NO：40)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：38，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
以上述纯化的hfq产物作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得完整的Pstat374-hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AGCTTGACGTCGAGCTCGGTACCTCCCGACAAATCCATAATATTGTTCTATACTGTATT-3'(374-Hfq-F2，SEQ ID NO：41,带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：38，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Aat II和Xho I进行双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pACYC184-ParaBAD-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到E.coli MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT序列正确。
2.3构建Pstat52-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pstat52-Hfq表达载体pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT的构建过程，如图4所示。
以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从Hfq的RBS到终止密码子之间的hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AAGTTGTGCTATACTGTATCGATCGATAAGCTTGATATCTATCGTGCGCAATTTTTTCA-3'(52-Hfq-F1，SEQID NO：42)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：38，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
以上述纯化的hfq产物作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得完整的Pstat374-hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AGCTTGACGTCGAGCTCGGTACCTCTTGTCAAATTCTTAATTTTGTGCTATACTGTATC-3'(52/38-Hfq-F2，SEQ ID NO：43,带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：39，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Aat II和Xho I进行双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pACYC184-ParaBAD-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT序列正确。
2.4构建Pstat38-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pstat38-Hfq表达载体pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT的构建过程，如图4所示。
以大肠杆菌MG1655基因组作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从Hfq的RBS到终止密码子之间的hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AAGTTGTGCTATACTGTATCGATCGATAAGCTTGATATCTATCGTGCGCAATTTTTTCA-3'(52/38-Hfq-F1，SEQ ID NO：42)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ IDNO：38，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
以上述纯化的hfq产物作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得完整的Pstat38-hfq多核苷酸片段：上游引物5'-AGCTTGACGTCGAGCTCGGTACCTCTTGTCAAATTTTTAAAGTTGTGCTATACTGTATC-3'(38-Hfq-F2，SEQ ID NO：44,带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-TGCCTCTCGAGCGTGTAAAAAAACAGCCCGA-3'(Hfq-R，SEQ ID NO：39，带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Aat II和Xho I进行双酶切后，与经同样酶双酶切的质粒pACYC184-ParaBAD-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT序列正确。
实施例3、构建DsrA-Hfq抗酸表达盒
3.1构建Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq和Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体：pACYC184-Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pnatd-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq表达载体pACYC184-Pnatd-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq-rrnBT的构建过程，如图5所示。
以实施案例1构建的pACYC184-Pnatd-DsrA载体作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从dsrA的包含基因上游区域序列，天然启动子和开放阅读框之间的Pnatd-DsrA多核苷酸片段：上游引物5'-TGCATGTCTAGACATAGTCGCGCAGTACTCCTCTTA-3'(XbaI-DsrA-for，SEQ ID NO：45，带下划线碱基为限制性内切酶Xba I识别位点)，和下游引物5'-TGCATGGACGTCCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'、(AatII-DsrA-rev，SEQ ID NO：46，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fast pfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Xba I和Aat II进行双酶切后，与经同样酶双酶切的实施例2构建的质粒pACYC184-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT和pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT序列正确。
3.2构建Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq和Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体：pACYC184-Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pcad600-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq表达载体pACYC184-Pcad600-DsrA-Pnat/Pstat-Hfq-rrnBT的构建过程，如图6所示：
以实施案例1构建的pACYC184-Pcad600-DsrA载体作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从dsrA启动子和开放阅读框之间的Pcad600-DsrA多核苷酸片段：上游引物5'-ACACCTGACGTCTAGATGCCGGAATTGAACAACCTG-3'(Pcad600-for，SEQ ID NO：33，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)，和下游引物5'-TGCATGGACGTCCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'(AatII-DsrA-rev，SEQ ID NO：46，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fastpfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Xba I和Aat II进行双酶切后，与经同样酶双酶切的实施例2构建的质粒pACYC184-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT和pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT序列正确。
3.3构建Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq和Pcad290-DsrA-Pstat38-Hfq抗酸表达盒的pACYC184表达载体：pACYC184-Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT
本申请实施例中所使用的Pcad290-DsrA-Pnath/Pstat-Hfq表达载体pACYC184-Pcad290-DsrA-Pnat/Pstat-Hfq-rrnBT的构建过程，如图6所示：
以实施案例1构建的pACYC184-Pcad290-DsrA载体作为模板，利用如下正向引物和反向引物，按照常规方法进行PCR扩增获得包含从dsrA启动子和开放阅读框之间的Pcad290-DsrA多核苷酸片段：上游引物5'-ACACCTGACGTCTAGAAGTAACTCCGGGTTGATTTA-3'(Pcad290-for，SEQ ID NO：36，带下划线碱基为限制性内切酶Xba I识别位点)，，和下游引物5'-TGCATGGACGTCCATACATGGCGTGAATTGGCGGAT-3'(AatII-DsrA-rev，SEQ ID NO：46，带下划线碱基为限制性内切酶Aat II识别位点)。PCR反应使用全式金(transgen)公司的Fastpfu聚合酶，PCR反应条件为：95℃，5min；95℃20sec，58℃60sec，72℃30sec，共30个循环；72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出与预期相符的正确条带。之后使用Tiangen公司的高纯度DNA片段小提试剂盒进行凝胶分离回收。
将得到PCR产物用限制性内切酶Xba I和Aat II进行双酶切后，与经同样酶双酶切的实施例2构建的质粒pACYC184-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pstat52-Hfq-rrnBT和pACYC184-Pstat38-Hfq-rrnBT进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌MG1655感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有34μg/mL氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的pACYC184-Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq-rrnBT、pACYC184-Pcad290-DsrA-Pstat38-Hfq-rrnBT序列正确。
实施例4、抗酸表达盒对大肠杆菌MG1655的极端酸冲击存活的影响
通过氯化钙法将由实施例1中获得的dsrA抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-rrnBT)，由实施例2中获得的hfq抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnath/Pstat374/Pstat52/Pstat38-hfq-rrnBT)，由实施例3中获得的DsrA-Hfq双基因抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pnath-hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pstat374-hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pstat52-hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pstat38-hfq-rrnBT)，以及对照质粒(pACYC184-rrnBT，此载体为发明人构建的载体，所述质粒的全长序列可见于SEQ ID NO：47)分别转化入大肠杆菌MG1655感受态细胞，通过菌落PCR和质粒测序鉴定得到阳性克隆。分别接菌到LB培养基37℃、250rpm过夜培养，以0.8mL菌液和0.2mL60％甘油的比例混匀，冻存在-80℃冰箱。所对应菌株分别命名为：对照空白菌株MG1655、包含对照质粒pACYC184-rrnBT菌株MG1655/pACYC184；含dsrA抗酸表达盒菌株MG1655/Pnatd-DsrA、MG1655/Pcad290-DsrA、MG1655/Pcad600-DsrA；含hfq抗酸表达盒菌株MG1655/Pnath-Hfq、MG1655/Pstat374-Hfq、MG1655/Pstat52-Hfq、MG1655/Pstat38-Hfq；含DsrA-Hfq双基因抗酸表达盒菌株MG1655/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Psta38-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq。
将上述冻存的含抗酸表达盒质粒的菌株、对照质粒的菌株和大肠杆菌MG1655恢复到LB固体培养基平板上(对于大肠杆菌MG1655，不添加抗生素；对于含抗酸表达盒质粒、对照质粒的菌株，添加34μg/mL的氯霉素；下同)，37℃过夜培养。分别接菌到添加有2％葡萄糖的LB培养基、LBG培养基添加10mM赖氨酸(LBG-lys)中37℃、250rpm过夜培养。以1:100比例转接到新鲜的LBG培养基中37℃、250rpm培养约1.5小时，当菌液OD600达到0.5～0.6时转接到新鲜的LBG-pH 2.5培养基(通过盐酸调节LBG培养基至pH 2.5)进行酸冲击2小时，初始OD600均为0.05。将冲击后的菌液用新鲜的无抗性的LBG培养基进行1:10、1:100、1:1000、1:10000的梯度稀释，并分别取4μL点样在无抗性的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养，观测平板菌落生长情况。
结果：
4.1对于dsrA抗酸表达盒，冲击后存活如图7所示。
(1)对照菌株MG1655和MG1655/pACYC184，酸冲击后存活几乎为零。
(2)含天然启动子的dsrA抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA：酸冲击后，在LBG的培养基中存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约102-103倍。在LBG-lys的培养基中存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10倍。
(3)含Pcad启动子的dsrA抗酸表达盒的菌株MG1655/Pcad600-DsrA和MG1655/Pcad290-DsrA在LBG中，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高102倍。在LBG培养基(pH 4.5)添加10mM赖氨酸的培养条件下，MG1655/Pcad600-DsrA和MG1655/Pcad290-DsrA的存活率是对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184的10-102倍。
4.2对于hfq抗酸表达盒，冲击后存活如图8所示。
(1)含天然启动子的hfq抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnath-Hfq：在LBG和LBG-lys酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10倍。
(2)含Pstat启动子的hfq抗酸表达盒的菌株MG1655/Pstat374-Hfq和MG1655/Pstat52-Hfq抗酸调控模块，在LBG和LBG-lys培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10倍。
(3)含Pstat38启动子的hfq抗酸表达盒的菌株MG1655/Pstat38-Hfq抗酸调控模块在LBG中，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高102倍，在LBG-lys中，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高10倍。
4.3对于dsrA-hfq双基因抗酸表达盒，冲击后存活如图9所示。
(1)含双基因抗酸表达盒的菌株MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq，在LBG培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10-102倍。在LBG-lysine培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10倍。
(2)含双基因抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Psta38-Hfq，在LBG培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约102-103倍。在LBG-lysine培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约10倍。
(3)含双基因抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq，在LBG培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约102-103倍。在LBG-lysine培养条件下，酸冲击后存活比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184提高约102-103倍。
本实施例说明：不同启动子调控的dsrA抗酸表达盒带来菌株不同程度的酸冲击存活的提高，天然Pnatd-DsrA调控模块，在酸冲击中表现更好；不同启动子调控的hfq抗酸表达盒带来菌株不同程度的酸冲击存活的提高，单独的Pstat38-Hfq调控模块，在酸冲击中表现略好；dsrA-hfq双基因抗酸表达盒带来菌株酸冲击存活的提高，可以带来比对应dsrA或hfq单基因抗酸表达盒提高的菌株酸冲击存活，尤其是Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq和Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq提高效果更好。
实施例5、抗酸表达盒对酸压力生长的效果
将由实施例4获得的含抗酸表达盒质粒的菌株、对照质粒的菌株和大肠杆菌MG1655分别接菌到添加有LBG培养基中37℃、250rpm过夜培养，以初始OD600～0.05转接到300μL新鲜的LBG-pH4.5培养基(或同时添加10mM赖氨酸：LBG-lys-pH4.5)中，使用全自动生长曲线分析仪Bioscreen C(芬兰，Oy Growth Curves Ab Ltd)和100孔板(HoneycompbPlate，可同时使用2块)，进行高通量生长测试。
结果:
5.1对于dsrA抗酸表达盒，酸压力生长测试结果如图10所示。
在LBG培养基中生长24小时后，各菌株的生长(Bioscreen C所测初始时刻与24小时时刻的ΔOD600)如表1所示。
表1含dsrA抗酸表达盒菌株酸压力生长测试
(1)含Pnatd-DsrA抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA，24小时生长在LBG-lysine培养基中均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中比对照菌株MG1655提高1.2％。24小时生长在LBG培养基中均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184略低，其中比对照菌株MG1655降低5.3％。
(2)含不同酸压力诱导的启动子的dsrA抗酸表达盒的菌株MG1655/Pcad600-DsrA、MG1655/Pcad290-DsrA，24小时生长均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中在LBG培养基中比对照菌株MG1655分别提高3.8％/1.5％；在LBG-lysine培养基中比对照菌株MG1655分别提高3.4％/0.2％。
(3)dsrA抗酸表达盒能够提高酸压力生长耐受性，不同表达强度的dsrA抗酸表达盒带来菌株不同程度的酸压力生长耐受性的提高，其中抗酸表达盒Pcad600-DsrA，能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在LBG培养基中的酸压力生长耐受性，24小时时刻的生长有3.8％的提高。
5.2对于hfq抗酸表达盒，酸压力生长测试结果如图11所示。
在LBG或LBG-lysine的发酵培养基(图11)中生长24小时后，各菌株的生长(Bioscreen C所测初始时刻与24小时时刻的ΔOD600)如表2所示。
表2含hfq抗酸表达盒菌株酸压力生长测试
(1)在LBG培养基中培养时，含hfq抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnath-Hfq、MG1655/Pstat374-Hfq、MG1655/Pstat52-Hfq、MG1655/Pstat38-Hfq)，24小时生长均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中比对照菌株MG1655分别提高26.6％/33.5％/82.5％/85.2％。
(2)在LBG-lysine培养基中培养时，含hfq抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnath-Hfq、MG1655/Pstat374-Hfq、MG1655/Pstat52-Hfq、MG1655/Pstat38-Hfq，24小时生长均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中比对照菌株MG1655分别提高27.6％/35.5％/65.5％/71.7％。
(3)hfq抗酸表达盒在LBG和LBG-lysine培养基，均能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在上述培养基中的酸压力生长耐受性。其中抗酸表达盒Pstat38-Hfq，能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在LBG/LBG-lysine培养基中的酸压力生长耐受性，24小时时刻的生长有85.2％/71.1％的提高。
5.3对于dsrA-hfq双基因抗酸表达盒，酸压力生长测试结果如图12所示。
在LBG或LBG-lysine的发酵培养基(图12)中生长24小时后，各菌株的生长(Bioscreen C所测初始时刻与24小时时刻的ΔOD600)如表3所示。
表3含dsrA-hfq双基因抗酸表达盒菌株酸压力生长测试
(1)在LBG培养基中培养时，含dsrA-hfq双基因抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Psta38-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq，24小时生长均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中比对照菌株MG1655分别提高54.4％/92.8％/158.9％/158.6％/36.5％/19.8％/93.5％/109.1％/41.8％/42.6％/107.2％/106.5％。
(2)在LBG-lysine培养基中培养时，含dsrA-hfq双基因抗酸表达盒的菌株MG1655/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad600-DsrA-Psta38-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Pstat52-Hfq、MG1655/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq，24小时生长均比对照菌株MG1655、MG1655/pACYC184高，其中比对照菌株MG1655分别提高47.9％/49.1％/75.8％/76.8％/35.5％/24.9％/84.6％/95.1％/39.6％/38.6％/92.9％/95.4％。
(3)dsrA-hfq双基因抗酸表达盒在LBG和LBG-lysine培养基中生长时，均能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在上述培养基中的酸压力生长耐受性。其中抗酸表达盒Pnatd-DsrA-Pstat52-Hfq/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq，能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在LBG培养基中的酸压力生长耐受性，24小时时刻的生长有158.9％/158.6％的提高。抗酸表达盒Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq/Pcad290-DsrA-Pstat38-Hfq，能够提高对照菌株大肠杆菌MG1655在LBG-lysine培养基中的酸压力生长耐受性，24小时时刻的生长有95.1％/95.4％的提高。
实施例6、抗酸表达盒对赖氨酸发酵的效果
通过电转化法将由实施例1中获得的dsrA抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-rrnBT)，由实施例2中获得的hfq抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnath/Pstat374/Pstat38-hfq-rrnBT)，由实施例3中获得的DsrA-Hfq双基因抗酸表达盒表达质粒(pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pnath-hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pstat374-hfq-rrnBT、pACYC184-Pnatd/Pcad600/Pcad290-dsrA-Pstat38-hfq-rrnBT)，以及对照质粒pACYC184-rrnBT分别转化入一株经改造的产赖氨酸大肠杆菌MG1655菌株(该菌株为以MG1655菌株为基础，根据中国专利申请CN103773745A所公开的方法进行改造获得的产赖氨酸菌株SCEcL3(pSLL1))电转感受态细胞中，通过菌落PCR和质粒测序鉴定得到阳性克隆。分别接菌到LB培养基37℃、250rpm过夜培养，以0.8mL菌液和0.2mL 60％甘油的比例混匀，冻存在-80℃冰箱。所对应菌株分别命名为：亲本产赖氨酸菌株PSLL1、含dsrA抗酸表达盒菌株pSLL1/Pnatd-DsrA、pSLL1/Pcad290-DsrA、pSLL1/Pcad600-DsrA；含hfq抗酸表达盒菌株pSLL1/Pnath-Hfq、pSLL1/Pstat374-Hfq、pSLL1/Pstat38-Hfq；含DsrA-Hfq双基因抗酸表达盒菌株pSLL1/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、pSLL1/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、pSLL1/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq、pSLL1/Pcad600-DsrA-Psta38-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq。
将上述冻存的含抗酸表达盒质粒的产赖氨酸菌株和亲本产赖氨酸菌株恢复到LB固体培养基平板上(对于亲本产赖氨酸菌株，添加50μg/mL氨苄青霉素mL；对于含抗酸表达盒质粒的产赖氨酸菌株，添加50μg/mL氨苄青霉素mL和34μg/mL的氯霉素)，37℃过夜培养。分别接菌到2mL LB培养基中37℃、200rpm过夜培养。以1:10的比例转接到1.2mL发酵培养基中，使用微型生物反应器BioLector(德国m2p-labs Gmbs)、48孔梅花型(MTP-48-Flowerplate，LOT 1401-hc-Temp37)板进行高通量酸压力发酵测试。
发酵培养基如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵10g/L，磷酸0.6mL/L，氯化钾0.8g/L，甜菜碱0.4g/发酵培养基如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵10g/L，磷酸0.6mL/L，氯化钾0.8g/L，甜菜碱0.4g/L，硫酸镁1.2g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.03g/L，玉米浆有机氮0.4g/L，5％消泡剂0.5mL/L，苏氨酸0.2g/L。培养基用氨水调节pH至7.0，其中葡萄糖、硫酸镁单独进行灭菌后添加入培养基中。发酵测试中发酵培养基初始pH 7.0，发酵约6小时后pH降至6.0，之后通过补加氨水控制pH维持在6.0，在BioLector中发酵共48小时。使用生物传感分析仪SBA-40E(山东省科学院生物研究所)分析发酵液中赖氨酸·HCl含量。
结果：
对于dsrA抗酸表达盒，发酵48小时后结果(以亲本产赖氨酸菌株PSLL1的赖氨酸·HCl产量为100％)如表4所示。
表4含dsrA抗酸表达盒的产赖氨酸菌株酸压力发酵测试
在上述发酵培养基和pH 6.0的酸压力发酵条件下，含dsrA抗酸表达盒的产赖氨酸菌株pSLL1/Pnatd-DsrA、Pcad290-DsrA/Pcad600-DsrA的48小时赖氨酸·HCl产量分别为亲本产赖氨酸菌株P的184.2％/166.2％/151.6％，高于亲本产赖氨酸菌株PSLL1。对于hfq抗酸表达盒，发酵48小时后结果(以亲本产赖氨酸菌株PSLL1的赖氨酸·HCl产量为100％)如表5所示。
表5含hfq抗酸表达盒的产赖氨酸菌株酸压力发酵测试
在上述发酵培养基和pH 6.0的酸压力发酵条件下，含hfq抗酸表达盒的产赖氨酸菌株pSLL1/Pnath-Hfq、pSLL1/Pstat374-Hfq、pSLL1/Pstat38-Hfq的48小时赖氨酸·HCl产量分别为亲本产赖氨酸菌株P的279.7％/293.4％/297.7％，高于亲本产赖氨酸菌株PSLL1。
对于dsrA-hfq抗酸表达盒，发酵48小时后结果(以亲本产赖氨酸菌株PSLL1的赖氨酸·HCl产量为100％)如表6所示。
表6含dsrA-hfq抗酸表达盒的产赖氨酸菌株酸压力发酵测试
在上述发酵培养基和pH 6.0的酸压力发酵条件下，含hfq抗酸表达盒的产赖氨酸菌株Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq的48小时赖氨酸·HCl产量分别为亲本产赖氨酸菌株P的89.7％。含hfq抗酸表达盒的产赖氨酸菌株pSLL1/Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pnatd-DsrA-Pstat374-Hfq、pSLL1/Pnatd-DsrA-Pstat38-Hfq、pSLL1/Pcad600-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Pnath-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Pstat374-Hfq、pSLL1/Pcad290-DsrA-Psta38-Hfq的48小时赖氨酸·HCl产量分别为亲本产赖氨酸菌株P的316.2％/311.9％/312.2％/311.3％/324.4％/311.3％/288.5％/307.4％，显著高于亲本产赖氨酸菌株PSLL1。
结论：尽管实施例构建的大部分抗酸表达盒在转化大肠杆菌后均能提高大肠杆菌的抗酸性，然而，令人惊奇的是，不同的启动子、抗酸调控基因和终止子的不同组合对大肠杆菌发酵有不同的影响。对于赖氨酸的微型发酵生产，表达盒Pcad600-DsrA-Pstat38-Hfq、和Pnatd-DsrA-Pnath-Hfq获得了意想不到的优良效果。Pcad600-DsrA-Pstat374-Hfq表达盒对赖氨酸生产没有效果。
说明书中使用的序列：
SEQ ID No:1dsrA mRNA
SEQ ID No:2 dsrA promoter and its upstream sequence
SEQ ID No:3 dsrA native terminator
SEQ ID No:4 hfq
SEQ ID No:5 hfq native promoter
SEQ ID No:6 Pcad290 promoter
SEQ ID No:7 Pcad600
SEQ ID No:8 Pstat374
1 TCCCGACAAA TCCATAATAT TGTTCTATAC TGTATTG
SEQ ID No:9 Pstat52
1 TCTTGTCAAA TTCTTAATTT TGTGCTATAC TGTATCG
SEQ ID No:10 Pstat38
1 TCTTGTCAAA TTTTTAAAGT TGTGCTATAC TGTATCG
SEQ ID No:11 rrnB
SEQ ID No:12 Pnatd-DsrA
SEQ ID No:13 Pcad600-DsrA
SEQ ID No:14 Pcad290-DsrA
SEQ ID No:15 Pnath-Hfq
SEQ ID No:16 Pstat374-Hfq
SEQ ID No:17 Pstat52-Hfq
SEQ ID No:18 Pstat38-Hfq
SEQ ID No:19 Pnatd-DsrA-Pnath-hfq
SEQ ID No:20 Pnatd-DsrA-Pstat374-hfq
SEQ ID No:21 Pnatd-DsrA-Pstat52-hfq
SEQ ID No:22 Pnatd-DsrA-Pstat38-hfq
SEQ ID No:23 Pcad600-DsrA-Pnath-hfq
/>
SEQ ID No:24 Pcad600-DsrA-Pstat374-hfq
SEQ ID No:25 Pcad600-DsrA-Pstat52-hfq
SEQ ID No:26 Pcad600-DsrA-Pstat38-hfq
SEQ ID No:27 Pcad290-DsrA-Pnat-hfq
SEQ ID No:28 Pcad290-DsrA-Pstat374-hfq
SEQ ID No:29 Pcad290-DsrA-Pstat52-hfq
SEQ ID No:30 Pcad290-DsrA-Pstat38-hfq
SEQ ID No:31 HindIII-AatII-DsrA-for
1 TATCTCAAGC TTGACGTCCA TAGTCGCGCA GTACTCCT
SEQ ID No:32 DsrA-rev
1 TATCTAGTCG ACCATACATG GCGTGAATTG GCGGAT
SEQ ID No:33 Pcad600-for
1 ACACCTGACG TCTAGATGCC GGAATTGAAC AACCTG
SEQ ID No:34 Pcad-rev
1 CTGATGTGTT GCATGCAAGA TTACTCACGA AAAAAG
SEQ ID No:35 Pcad-DsrA-for
1 TAATCTTGCA TGCAACACAT CAGATTTCCT GGTGTA
SEQ ID No:36 Pcad290-for
1 ACACCTGACG TCTAGAAGTA ACTCCGGGTT GATTTA
SEQ ID No:37 Pnath-Hfq-F
1 AGCTTGACGT CGGATCCCAC TGTTAGTGGG
SEQ ID No:38 Hfq-R
1 TGCCTCTCGA GCGTGTAAAA AAACAGCCCG A
SEQ ID No:39 pACYC184-ParaBAD-Hfq-rrnBT
/>
/>
SEQ ID No:40 374-Hfq-F1
1 AATATTGTTC TATACTGTAT TGATCGATAA GCTTGATATC TATCGTGCGC
51 AATTTTTTC
SEQ ID No:41 374-Hfq-F2
1 AGCTTGACGT CGAGCTCGGT ACCTCCCGAC AAATCCATAA TATTGTTCTA
51 TACTGTATT
SEQ ID No:42 52/38-Hfq-F1
1 AAGTTGTGCT ATACTGTATC GATCGATAAG CTTGATATCT ATCGTGCGCA
51 ATTTTTTCA
SEQ ID No:43 52-Hfq-F2
1 AGCTTGACGT CGAGCTCGGT ACCTCTTGTC AAATTCTTAA TTTTGTGCTA
51 TACTGTATC
SEQ ID No:44 38-Hfq-F2
1 AGCTTGACGT CGAGCTCGGT ACCTCTTGTC AAATTTTTAA AGTTGTGCTA
51 TACTGTATC
SEQ ID No:45 XbaI-DsrA-for
1 TGCATGTCTA GACATAGTCG CGCAGTACTC CTCTTA
SEQ ID No:46 AatII-DsrA-rev
1 TGCATGGACG TCCATACATG GCGTGAATTG GCGGAT
SEQ ID No:47 pACYC184-rrnBT
/>
/>

Claims (13)

1.一种表达盒，其由抗酸调控基因dsrA基因和抗酸调控基因hfq基因、与所述抗酸调控基因可操作地连接的启动子和与所述抗酸调控基因可操作地连接的终止子组成，其中与dsrA基因可操作地连接的启动子选自dsrA的天然启动子Pnatd、Pcad600和Pcad290，其中与hfq基因可操作地连接的启动子选自Pstat52和Pstat38，且其中所述表达盒在被导入至宿主细胞后能够提高宿主细胞在LBG-lysine培养基中的抗酸性。
2.权利要求1的表达盒，其中所述dsrA基因编码SEQ ID NO：1所示的非编码小RNA序列。
3.权利要求1的表达盒，其中所述hfq基因编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的表达盒，其中所述与dsrA基因可操作地连接的启动子选自SEQ ID NO：2、6和7所示的启动子。
5.权利要求1的表达盒，其中所述与hfq基因可操作地连接的启动子选自SEQ ID NO：9和10所示的启动子。
6.权利要求1的表达盒，其中所述终止子为SEQ ID NO：3所示dsrA基因终止子或SEQ IDNO：11所示rrnB终止子。
7.权利要求1的表达盒，其由两部分组成，第一部分从5’到3’包含选自SEQ ID NO：2和6-7的启动子、编码SEQ ID NO：1所示的非编码小RNA序列的dsrA基因和SEQ ID NO：3所示dsrA基因终止子，第二部分从5’到3’包含选自SEQ ID NO：9和10的启动子，编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的hfq基因，以及SEQ ID NO：11所示rrnB终止子。
8.权利要求7的表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21、22、25、26、29和30任一所示。
9.表达构建体，其包含权利要求1-8任一项的表达盒。
10.重组细菌宿主细胞，其包含权利要求1-8任一项的表达盒或权利要求9的表达构建体。
11.权利要求10的重组细菌宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。
12.权利要求10或11的重组细菌宿主细胞，与相应的不含所述表达盒或表达构建体的细胞相比，其抗酸性能被提高。
13.权利要求12的重组宿主细胞，所述抗酸性能包括在酸冲击下的存活率和在酸压力条件下的生长率。
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