CN112375726B - 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01039—Homoserine kinase (2.7.1.39)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
Abstract
本发明涉及一种高产L‑高丝氨酸的基因工程菌，其中所述菌中L‑高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达被减弱或消除，进一步强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC、高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom、过表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA以及转运蛋白基因。本发明构建的L‑高丝氨酸高产菌株能够产生较高水平L‑高丝氨酸，在最佳实施例中本发明的基因工程菌经过72 h发酵，L‑高丝氨酸含量可达63.2±5.4g/L。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学和代谢工程技术领域，具体涉及通过代谢工程的策略高产L-高丝氨酸的方法。
背景技术
高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，参与体内多种生理生化反应和生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。由于高丝氨酸及其衍生物具有丰富的生物活性，在食品、农业和医药等领域具有广泛的应用。高丝氨酸可作为抗真菌药物，有效制止分枝杆菌结核病等；作为医药中间体，可用于制备多种生物活性药物；此外，高丝氨酸还可作为重要中间体用于合成丙烯酸、3-羟基丙酰-CoA、聚-3-羟基丙酸酯和1，2-丙二醇等高附加值化学品。近年来，高丝氨酸被开发用于广谱除草剂L-草铵膦的合成过程。近年来，随着对高丝氨酸研究的不断深入，多种高丝氨酸及其衍生物产品被开发并应用于工业生产中，需求量逐年增加，具有广阔的应用前景。
目前，高丝氨酸主要通过以L-甲硫氨酸或天冬氨酸为原料的化学法合成。然而化学合成过程中需要使用碘化物和大量有机溶剂，并且生成硫化物，从而造成极大的环境污染。相比之下，微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等许多优点，已成为生产各类氨基酸的首选工艺。近年来，利用微生物发酵法生产高丝氨酸越来越引起人们的广泛关注。Li等利用大肠杆菌构建了一株产高丝氨酸的工程菌株，高丝氨酸产量达到39.54 g/L（Li H, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli W3110 for L-homoserine production, Process Biochemistry, 2016, 51: 1973-1983.）。然而由于高丝氨酸对大肠杆菌具有较高的细胞毒性，目前高丝氨酸产量仍然较低，难以满足工业化生产需求。因此，开发一株高产高丝氨酸的工业菌株对推动高丝氨酸产业发展具有重要意义。本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，利用代谢工程和合成生物学的方法，构建了一株高产高丝氨酸的工程菌株，为发酵法工业生产高丝氨酸提供了重要的理论基础和示范。
发明内容
目前，高丝氨酸主要通过化学合成的方法进行生产，存在工艺复杂、技术壁垒高、安全性低、环境污染大等问题，也限制了产品在食品、医药等行业中应用。利用环境友好的微生物发酵法制备L-高丝氨酸提供了一条绿色可行的替代方案，但目前也存在菌种资源缺乏，生产技术水平相对落后等限制因素。针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法。
本发明所提供的一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于在基因组水平上敲除或弱化L-高丝氨酸降解途径相关基因，利用穿梭载体和在基因组水平过表达或强化多个L-高丝氨酸生物合成途径相关基因，并且生产菌株中多个与L-高丝氨酸合成代谢相关的基因被突变，获得产L-高丝氨酸的基因工程菌。
本发明首先提供一种高产L-高丝氨酸的基因工程菌，其中所述菌选自埃希氏属（Escherichia）、棒杆菌属（Corynebacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）或短杆菌属（Brevibacterium），其中所述菌中L-高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达被减弱或消除。优选地，所述菌为棒杆菌属。更优选地，所述菌为谷氨酸棒杆菌。
优选地，所述菌中强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC，更优选地，所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC存在C932T的突变。
另一优选方式中，所述菌中强化表达高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom，更优选地，所述高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom存在G1133A的突变。
在优选实施方式中，所述强化表达是采用利用Psod启动子使得所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC和/或所述高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom在基因组水平上强化表达。
在进一步优选方式中，所述菌中还过表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA，更优选地，所述天冬氨酸激酶解的原始基因来源于大肠杆菌的，且所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA存在C1034T突变。
在进一步优选方式中，所述菌中进一步强化表达来源于大肠杆菌的转运蛋白RhtA、RhtB，或来源谷氨酸棒杆菌的转运蛋白NCgl0580。
在更进一步优选方式中，所述菌中进一步强化表达异源天冬氨酸激酶基因thrA。
本发明还提供本发明上述的基因工程菌在生产L-高丝氨酸中的应用。
在一个更具体的实施方式中，本发明所提供的一种L-高丝氨酸生产的基因工程菌的构建方法步骤如下：
（1）本发明首先通过敲除L-高丝氨酸激酶编码基因thrB，消除L-高丝氨酸的下游降解途径，实现L-高丝氨酸积累。
（2）在（1）获得的菌株的基础上，利用谷氨酸棒杆菌Psod强启动子在基因组水平上强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC*（C932T），增强菌株天冬氨酸前体支路代谢通量。
（3）在（2）获得菌株的基础上，利用谷氨酸棒杆菌Psod强启动子在基因组水平上强化表达高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom*（G1133A），提高菌株L-高丝氨酸生物合成能力。
（4）在（3）获得菌株的基础上，为进一步提高天冬氨酸向高丝氨酸转化，过表达来源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA*（C1034T）。
（5）在（4）获得菌株的基础上，比较不同来源的高丝氨酸转运蛋白，包括来源于大肠杆菌转运蛋白基因yeaS、rhtA和rhtB，来源于谷氨酸棒杆菌的转运蛋白候选基因，确定最优的L-高丝氨酸转运蛋白，构建L-高丝氨酸高产菌株。
本发明以食品安全级菌种谷氨酸棒杆菌为出发菌株，提供了一种L-高丝氨酸高效生产的基因工程菌及其应用。本发明通过敲除或弱化L-高丝氨酸降解途径相关基因，过表达或强化多个不同来源的L-高丝氨酸生物合成途径相关基因，因而首次利用食品安全级菌种实现了L-高丝氨酸的高效发酵生产，在最佳实施例中本发明的基因工程菌经过72 h发酵，L-高丝氨酸含量可达63.2 ± 5.4 g/L。本发明提供的L-高丝氨酸生产的基因工程菌用生产L-高丝氨酸，相较于传统化学合成法，具有产量高、无毒、无污染、条件温和、环境污染少等诸多优点，因采用食品安全级菌种进行发酵制造，在食品、医药等行业中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 为代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-高丝氨酸策略示意图。
图2 为工程菌株HSE7-thrA*-rhtA生产L-高丝氨酸发酵轮廓示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，无特殊说明。均可从商业途径得到。
实施例 1谷氨酸棒杆菌L-高丝氨酸激酶基因thrB缺失菌株的构建
（1）以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，分别利用引物thrB1-F/thrB1-R，thrB2-F/thrB2-R进行PCR获得片段thrB1和thrB2。然后以上述获得PCR产物为模板，以thrB1-F /thrB2-R为引物，通过融合PCR的方法获得完整DNA片段，将上述获得DNA片段通过BamHI 和 XbaI双酶切后，连接至载体pCRD206上，获得敲除质粒pCRD-thrB。其中，本实施例中的L-高丝氨酸激酶基因thrB的氨基酸和核苷酸序列（GenBank: CAF19888.1）。
所用引物信息如下：
thrB1-F：CGCGGATCCTTGAGGTTATCGGCGGCATTG
thrB1-R：GACTCACGAGCATCTTCCGACCGACGTTCAGTTCAATTG
thrB2-F：TGAACTGAACGTCGGTCGGAAGATGCTCGTGAGTCTGGC
thrB2-R：GCTCTAGATTCTCCGCACCAGTTGGATAC
thrB-CF：CACCTGAGCTGCTCACTGAGGAC
thrB-CR：TCCTCACAAGCCCCCTAGTTAATCTCAGG。
（2）thrB基因敲除步骤：将质粒pCRD-thrB电转至C. glutamicum ATCC13032 细胞中。电转条件为：将100 μl感受态细胞置于冰上，加入200 ng重组质粒，冰上放置30分钟，使用MicroPulser（Bio-Rad公司）电穿孔仪电击转化，迅速用1 ml LBHIS培养基吹打5-10次后转移至EP管中，46 ºC热击6分钟，将菌液涂布在含有氯霉素的LBHIS平板上。挑取单菌落转接至LBHIS固体培养基中，37 ºC培养1天。挑取单菌落至A培养基中（10 g/L葡萄糖，7 g/L酪蛋白水解物, 5 g/L 硫酸铵, 2 g/L yeast extract, 2 g/L 尿素, 0.5 g/L KH2PO4,0.5 g/L K2HPO4•3H2O, 0.5 g/L MgSO4•7H2O, 6 mg/L Fe2SO4•7H2O, 4.2 mg/L Mn2SO4•H2O, 0.2 mg/L biotin, 0.2 mg/L thiamine, 4% 葡萄糖，10%蔗糖），过夜培养，然后置于A+10%蔗糖培养基中，继续培养1~2天。然后划线至A+蔗糖固体培养基中。挑单菌落在A+卡那霉素和A固体培养基中对点划线。挑选在A培养基中生长，在A+卡那霉素培养基中不能生长的菌株。随后，以野生型菌株为对照，使用引物thrB-CF/thrB-CR对获得菌株进行PCR验证，获得高丝氨酸生产菌株HSE-1。
PCR体系：ddH2O 30μL，模板 1μL，Fastpfu 缓冲液 10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。
PCR条件：步骤 1 94ºC 4min，步骤 2 94ºC 30 s，步骤 3 60 ºC 30 s，步骤 4 72ºC 1min，步骤 5 72ºC 10min，步骤 6 4 ºC保温。
融合PCR条件及方法：（1）ddH2O 28μL，模板1 3μL，模板2 3μL，Fastpfu 缓冲液 10μL，Fastpfu 1μL，dNTP 5μL。步骤1 94ºC 4min，步骤2 94ºC 30 s，步骤3 53 ºC 30 s，步骤4 72ºC 1.5min，10个循环，步骤5 72ºC 10min。（2）ddH2O 30μL，模板 1μL，Fastpfu缓冲液10μL，Fastpfu 1μL，引物1 1.5μL，引物2 1.5μL，dNTP 5μL。步骤1 94ºC 4min，步骤2 94ºC30 s，步骤3 53 ºC 30 s，步骤4 72ºC 1.5min，30个循环，步骤 5 72ºC 10min。
双酶切体系：DNA片段或质粒pCRD206 20μL，BamHI 1μL，XbaI1μL，10×缓冲液 5μL，ddH2O 23μL，37ºC 反应1 h。
连接体系：DNA片段片段 16μL， pCRD206片段 1μL，T4连接酶 0.5μL， 10×缓冲液2μL，22ºC反应1 h。
实施例 2 染色体水平强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC*（C932T）和高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom*（G1133A）。
（1）为实现染色体水平lysC基因C932T点突变，首先以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用分别利用引物对lysC1-F/ lysC1-R，lysC2-F/ lysC2-R进行PCR获得DNA序列lysC1和lysC2。利用融合PCR的方法，利用引物对lysC1-F/ lysC2-R获得DNA片段lysC*。将上述获得DNA片段通过BamHI和speI双酶切后，连接至载体pCRD206上，获得点突变质粒pCRD- lysC*。将点突变质粒pCRD-lysC*电转至谷氨酸棒杆菌L-高丝氨酸激酶基因thrB缺失菌株HSE-1细胞中。电转条件如实施例1所示。挑取单菌落转接至LBHIS固体培养基中，37 ºC培养1天。挑取单菌落至A培养基中，过夜培养，然后置于A+10%蔗糖培养基中，继续培养1~2天。然后划线至A+蔗糖固体培养基中。挑单菌落在A+卡那霉素和A固体培养基中对点划线。挑选在A培养基中生长，在A+卡那霉素培养基中不能生长的菌株。测序验证后，获得高丝氨酸生产菌株HSE-2。其中，本实施例中的野生型的天冬氨酸激酶解基因lysC的氨基酸和核苷酸序列（GenBank：CAF18822.1）；野生型的高丝氨酸脱氢酶解hom的氨基酸和核苷酸序列（GenBank：CAF19887）。
所用的引物信息如下：
lysC1-F：CGGACTAGTATGGCCCTGGTCGTACAG
lysC1-R：CGCGGCGGCCGTCGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGAT
lysC2-F：ATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCGACGGCCGCCGCG
lysC2-R：CGCGGATCCTCTGCTCTTCATCGGTTTCG。
（2）利用Psod强启动子实现lysC基因染色体水平的强化表达。首先以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用分别利用引物对lysCp1-F/lysCp1-R，SodP-F1/SodP-R1，lysCp2-F/ lysCp2-R进行PCR获得DNA序列lysCp1, Sod和lysCp2。利用融合PCR的方法，利用引物对lysCp1-F/ lysCp2-R获得DNA片段Sod-lysC*。将上述获得DNA片段通过BamHI和speI双酶切后，连接至载体pCRD206上，获得整合质粒pCRD-Sod-lysCp。将整合质粒pCRD-Sod-lysCp电转至谷氨酸棒杆菌HSE-2细胞中。电转条件和整合过程如实施例1所示。测序验证后，获得高丝氨酸生产菌株HSE-3。
所用的引物信息如下：
lysCp1-F：CGGACTAGT CCCAAACTGAAGGCAACA
lysCp1-R：TTGAAGGGCATAAGGCTTCCCGCTCAACTCTACCTTTAT
SodP-F1：TAAAGGTAGAGTTGAGCGGG AAGCCTTATGCCCTTCAA
SodP-R1：CTGTACGACCAGGGCCAT GGGTAAAAAATCCTTTCGTAG
lysCp2-F：CTACGAAAGGATTTTTTACCCATGGCCCTGGTCGTACAG
lysCp2-R：CGCGGATCC GAGGGCAGGTGAAGATGAT
（3）为实现染色体水平hom基因G1133A点突变，首先以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用分别利用引物对hom1-F/ hom1-R，hom2-F/ hom2-R进行PCR获得DNA序列hom1和hom2。利用融合PCR的方法，利用引物对hom1-F/ hom2-R获得DNA片段hom*。将上述获得DNA片段通过BamHI和speI双酶切后，连接至载体pCRD206上，获得点突变质粒pCRD-hom*。将点突变质粒pCRD- hom*电转至谷氨酸棒杆菌L-高丝氨酸菌株HSE-3细胞中。电转条件和整合过程如实施例1所示。测序验证后，获得高丝氨酸生产菌株HSE-4。
所用的引物信息如下：
hom1-F：CGCGGATCCATGACCTCAGCATCTGCCCC
hom1-R：CAGGCTAGCCAATTCAGCCAAAACCTCCACGCGATCTTC
hom2-F：GAAGATCGCGTGGAGGTTTTGGCTGAATTGGCTAGCCTG
hom2-R：TGCTCTAGAATCCAAGAAAGCCTCGGTGA。
（4）利用Psod强启动子实现hom基因染色体水平的强化表达。首先以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用分别利用引物对homp1-F/ homp1-R，SodP-F2/SodP-R2，homp2-F/ homp2-R进行PCR获得DNA序列homp1和homp2。利用融合PCR的方法，利用引物对homp1-F/ homp2-R获得DNA片段Sod-hom*。将上述获得DNA片段通过BamHI和speI双酶切后，连接至载体pCRD206上，获得整合质粒pCRD-Sod-homp。将整合质粒pCRD-Sod-lysCp电转至谷氨酸棒杆菌HSE-2细胞中。电转条件和整合过程如实施例1所示。测序验证后，获得高丝氨酸菌株HSE-5。
其中，本实施例中的Psod启动子的核苷酸序列如下：AAGCCTTATGCCCTTCAACCCTACTTAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGACCCGCTACCCGATAAATAGGTCGGCTGAAAAATTTCGTTGCAATATCAACAAAAAGGCCTATCATTGGGAGGTGTCGCACCAAGTACTTTTGCGAAGCGCCATCTGACGGATTTTCAAAAGATGTATATGCTCGGTGCGGAAACCTACGAAAGGATTTTTTACCC。其中，Sod基因的GenBank: CAF20950.1。
所用的引物信息如下：
homp1-F：CGCGGATCCTAAGGTGTCTAGGGGTCTGCA
homp1-R：GAAGGGCATAAGGCTTGAGCGTTGTTGTCCTATTACTTTG
SodP-F2：AAGTAATAGGACAACAACGCTCAAGCCTTATGCCCTTCAA
SodP-R2：GGGCAGATGCTGAGGTCATGGGTAAAAAATCCTTTCGTAG
homp2-F：TACGAAAGGATTTTTTACCCATGACCTCAGCATCTGCCCC
homp2-R：TGCTCTAGAAAACCTCCACGCGATCTTC。
实施例 3 不同高丝氨酸菌株发酵生产高丝氨酸分析
将谷氨酸棒杆菌野生型ATCC 13032及上述获得的谷氨酸棒杆菌工程菌株HSE-1、HSE-2、HSE-3、HSE-4及HSE-5分别接种至含有20~25mL种子培养基的250 mL三角瓶中，培养12h~16 h至对数中期。然后离心收集细胞，用新鲜的发酵培养基悬浮，接种至含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，起始OD600为0.8~1.2，并加入5~15 g/L CaCO3。发酵条件为30ºC，150~200 rpm，恒温振荡培养。发酵培养基为：葡萄糖50~60 g/L，尿素0.1~0.2 g/L，玉米浆 5~10 g/L，硫酸铵 15~20 g/L，KH2PO4 5~6 g/L，MgSO4·7H2O 2 ~5 g/L，FeSO4·7H2O0.2~0.5 g/L，MnCl2·4H2O 0.2~0.4 g/L，生物素0.2~0.4 mg/L，维生素B1 1~2 mg/L，维生素B6 1~2 mg/L，CaCO3 5~15 g/L用于发酵培养基的缓冲剂。种子培养基包括10~20 g/L葡萄糖，尿素0.1~0.2 g/L，玉米浆 15~20 g/L，硫酸铵 15~20 g/L，IPTG添加浓度0.2 mM。经3-4天发酵，测定各菌株产L-高丝氨酸的产量，具体结果如下。
实施例4 探究不同来源高丝氨酸转运蛋白对L-高丝氨酸的影响
目前，关于微生物L-高丝氨酸转运蛋白的研究尚未有详细报道。因此，探究了来源于不同宿主的转运蛋白对L-高丝氨酸的转运能力。所述宿主包括埃希氏属、棒杆菌属或短杆菌属等。所述转运蛋白包括来源于大肠杆菌的编码基因yeaS、rhtA、rhtB，来源于谷氨酸棒杆菌的编码基因NCgl0580。其中，本实施例中用到的来源于大肠杆菌的基因yeaS（GenBank：NP_416312）、RhtA（GenBank：NP_415334）、RhtB （GenBank：YP_026265），来源于谷氨酸棒杆菌的基因NCgl0580的氨基酸和核苷酸序列为（GenBank：NP_599841）。
具体实例如下：
（1）以E. coli MG1655基因组为模板。分别利用引物对EcyeaS-F/EcyeaS-R，EcRhtA-F/EcRhtA-R，EcRhtB-F/EcRhtB-R，通过PCR获得完整DNA片段yeaS、RhtA、RhtB。（2）以C. glutamicum ATCC13032基因组为模板，利用引物对NCgl0580-F/ NCgl0580-R，通过PCR获得完整DNA片段NCgl0580。（3）以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19为模板，利用引物PXMJ19-F/PXMJ19-R，通过PCR获得质粒骨架。最后，通过GoldenGate的方法将上述DNA片段与载体骨架连接，分别获得重组表达质粒pXMJ19-yeaS、pXMJ19-rhtA、pXMJ19-rhtB和pXMJ19-NCgl0580。
PCR条件：步骤 1 94ºC 4min，步骤 2 94ºC 30 s，步骤 3 60 ºC 30 s，步骤 4 72ºC 1min，步骤 5 72ºC 10min，步骤 6 4 ºC保温。
GoldenGate体系： Thermo Fisher scientific T4 ligase 10x缓冲液 1.5μl，0.1 mg/ml 牛血清蛋白（BSA）1.5μl，Thermo Fisher scientific T4 ligase 1μl，ThermoFisher scientific BsaⅠ1μl， DNA片段 100 ng。反应程序为：37ºC 3min，22ºC 4min （30循环），22ºC 20 min，50ºC 5min，80ºC，25ºC 5min。
所用的引物信息如下：
EcyeaS-F：CACTACGCACCTGCAAAAACATGTGTTCGCTGAATACGGGGTTCTG
EcyeaS-R：CACTACGCACCTGCAAAAATCCTCAGGATTGCAGCGTCGCCAGTCG
EcRhtA-F：
CACTACGCACCTGCAAAAACATATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCCGGTCT
EcRhtA-R：
CACTACGCACCTGCAAAAATCCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTCTCTTTGCGTACTGTCAGCG
EcRhtB-F：
CACTACGCACCTGCAAAAACATATGACCTTAGAATGGTGGTTTGCCTACCTGCT
EcRhtB-R：CACTACGCACCTGCAAAAATCCTCACGCATGCCTCGCCGATGCTAA
NCgl0580-F：
CACTACGCACCTGCAAAAACATATGAATAAACAGTCCGCTGCAGTGTTGATGGT
NCgl0580-R：CACTACGCACCTGCAAAAATCCTTAACTAGGTGTGTGTACTCGCCTCT
PXMJ19-F：CACTACGCACCTGCAAAAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCA
PXMJ19-R：CACTACGCACCTGCAAAAATGTATATCTCCTTCTTAAAGAAGCTTA。
（3）将上述获得的质粒pXMJ19-yeaS、pXMJ19-rhtA、pXMJ19-rhtB和pXMJ19-NCgl0580分别电转至谷氨酸棒杆菌L-高丝氨酸生产菌株HSE-5中，分别得到菌株HSE6-yeaS、HSE6-rhtA、HSE6-rhtB和HSE6-NCgl0580。
（4）按实施例3的方法测试所述的菌株生产L-高丝氨酸的能力。经3-4天发酵测试，结果发现不同来源的转运蛋白均对高丝氨酸有一定的外排能力，如表2所示，其中过表达性能最优的RhtA转运蛋白可以使L-高丝氨酸产量提升了40%。
实施例5 强化表达异源天冬氨酸激酶基因，强化高丝氨酸合成
为进一步强化天冬氨酸支路通量，提高L-高丝氨酸合成能力，进一步强化表达了异源天冬氨酸激酶基因thrA（GenBank：NP_414543）。因此，利用pXMJ19质粒，构建了天冬氨酸激酶基因thrA和高丝氨酸转运蛋白基因rhtA的共表达重组质粒。具体实例如下：
以E. coli MG1655基因组为模板设计引物thrA1-F/thrA1-R，thrA2-F/thrA2-R(thrA2-NR)，利用PCR获得片段thrA1和thrA2，然后用融合PCR方法获得含有点突变的thrA*（C1034T）基因。以E. coli MG1655基因组为模板，利用引物rhtA-F/ rhtA-R进行PCR获得rhtA DNA片段。利用引物19BD-F/19BD-R，以质粒pXMJ19为模板，PCR获得质粒骨架片段。采用GoldenGate的方法，将thrA*（C1034T）基因片段与pXMJ19质粒骨架连接，获得质粒pXMJ-thrA*；将thrA*（C1034T）基因片段、rhtA基因片段与pXMJ19质粒骨架连接，获得质粒pXMJ-thrA*-rhtA。将上述获得的质粒电转至L-高丝氨酸高产菌株HSE-5细胞中，最终获得工程菌株HSE7-thrA*和HSE7-thrA*-rhtA。
所用引物信息如下：
19BD-F：CACCAGGTCTCAGGCTGTTTTGGCGGATGAGAG
19BD-R：CACCAGGTCTCAAGTTAATTAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
thrA1-F：CACCAGGTCTCAAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGG
thrA1-R：ATCAGCACCACGAAAATACGGGCGCGTGACATCG
thrA2-F：CGCGCCCGTATTTTCGTGGTGCTGATTACGC
thrA2-R：CACCAGGTCTCATCAGACTCCTAACTTCCATGAGAGG
thrA2-NR：CACCAGGTCTCAAGCCACTCCTAACTTCCATGAGAGG
rhtA-F：
CACCAGGTCTCACTGAAAGAAAGGAGGACAACCAATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGC
rhtA-R：CACCAGGTCTCAAGCCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTATTTTGCTCTCTTTGCG。
按实施例3的方法测试所述的菌株生产L-高丝氨酸的能力。经3-4天发酵测试，结果如表3所示，表明强化表达异源天冬氨酸激酶基因能够明显促进L-高丝氨酸的生物合成。
实施例 5 L-高丝氨酸菌株HSE7-thrA*-rhtA发酵轮廓分析
将上述获得的最优L-高丝氨酸菌株HSE7-thrA*-rhtA接种至LBHIS培养基中，过夜培养，然后接种至含有50 mL新鲜的种子培养基的500 mL三角瓶中，培养10h~12 h至对数中期。按照10%接种量接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制发酵条件为30 ºC，pH为6.8~7.0，溶氧为20%空气饱和度。发酵培养基为：葡萄糖50~60 g/L，尿素0.1~0.2 g/L，玉米浆 5~10 g/L，硫酸铵 15~20 g/L，KH2PO4 5~6 g/L，MgSO4·7H2O 2 ~5 g/L，FeSO4·7H2O 0.2~0.5 g/L，MnCl2·4H2O 0.2~0.4 g/L，生物素0.2~0.4 mg/L，维生素B1 1~2 mg/L，维生素B6 1~2 mg/L，NH4OH (25% v/v)用于发酵培养基的缓冲剂。种子培养基包括10~20 g/L葡萄糖，尿素0.1~0.2 g/L，玉米浆 15~20 g/L，硫酸铵 15~20 g/L，pH为6.5~7.0。如图2所示，在5L发酵罐条件下经过72 h生物发酵，L-高丝氨酸含量可达63.2 ± 5.4g/L。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用
<130>
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcggatcct tgaggttatc ggcggcattg 30
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactcacgag catcttccga ccgacgttca gttcaattg 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaactgaac gtcggtcgga agatgctcgt gagtctggc 39
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctctagatt ctccgcacca gttggatac 29
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacctgagct gctcactgag gac 23
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcctcacaag ccccctagtt aatctcagg 29
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggactagta tggccctggt cgtacag 27
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgcggcggcc gtcggaacga gggcaggtga agatgat 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atcatcttca cctgccctcg ttccgacggc cgccgcg 37
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgcggatcct ctgctcttca tcggtttcg 29
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggactagtc ccaaactgaa ggcaaca 27
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttgaagggca taaggcttcc cgctcaactc tacctttat 39
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
taaaggtaga gttgagcggg aagccttatg cccttcaa 38
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgtacgacc agggccatgg gtaaaaaatc ctttcgtag 39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctacgaaagg attttttacc catggccctg gtcgtacag 39
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgcggatccg agggcaggtg aagatgat 28
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgcggatcca tgacctcagc atctgcccc 29
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caggctagcc aattcagcca aaacctccac gcgatcttc 39
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaagatcgcg tggaggtttt ggctgaattg gctagcctg 39
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgctctagaa tccaagaaag cctcggtga 29
<210> 21
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aagccttatg cccttcaacc ctacttagct gccaattatt ccgggcttgt gacccgctac 60
ccgataaata ggtcggctga aaaatttcgt tgcaatatca acaaaaaggc ctatcattgg 120
gaggtgtcgc accaagtact tttgcgaagc gccatctgac ggattttcaa aagatgtata 180
tgctcggtgc ggaaacctac gaaaggattt tttaccc 217
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgcggatcct aaggtgtcta ggggtctgca 30
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaagggcata aggcttgagc gttgttgtcc tattactttg 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aagtaatagg acaacaacgc tcaagcctta tgcccttcaa 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gggcagatgc tgaggtcatg ggtaaaaaat cctttcgtag 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tacgaaagga ttttttaccc atgacctcag catctgcccc 40
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgctctagaa aacctccacg cgatcttc 28
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cactacgcac ctgcaaaaac atgtgttcgc tgaatacggg gttctg 46
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cactacgcac ctgcaaaaat cctcaggatt gcagcgtcgc cagtcg 46
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cactacgcac ctgcaaaaac atatgcctgg ttcattacgt aaaatgccgg tct 53
<210> 31
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cactacgcac ctgcaaaaat ccttaattaa tgtctaattc ttttattttg ctctctttgc 60
gtactgtcag cg 72
<210> 32
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cactacgcac ctgcaaaaac atatgacctt agaatggtgg tttgcctacc tgct 54
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cactacgcac ctgcaaaaat cctcacgcat gcctcgccga tgctaa 46
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cactacgcac ctgcaaaaac atatgaataa acagtccgct gcagtgttga tggt 54
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cactacgcac ctgcaaaaat ccttaactag gtgtgtgtac tcgcctct 48
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cactacgcac ctgcaaaagg atccccgggt accgagctcg aattca 46
<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cactacgcac ctgcaaaaat gtatatctcc ttcttaaaga agctta 46
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
caccaggtct caggctgttt tggcggatga gag 33
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
caccaggtct caagttaatt aattctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 50
<210> 40
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
caccaggtct caaactttaa gaaggagata tacatatgcg agtgttgaag ttcggcgg 58
<210> 41
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
atcagcacca cgaaaatacg ggcgcgtgac atcg 34
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgcgcccgta ttttcgtggt gctgattacg c 31
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
caccaggtct catcagactc ctaacttcca tgagagg 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
caccaggtct caagccactc ctaacttcca tgagagg 37
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
caccaggtct cactgaaaga aaggaggaca accaatgcct ggttcattac gtaaaatgc 59
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
caccaggtct caagccttaa ttaatgtcta attcttttat tttgctctct ttgcg 55
Claims (2)
1.一种高产L-高丝氨酸的基因工程菌，其出发菌是谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达被减弱或消除，且所述谷氨酸棒杆菌中强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC和高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom，并过表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA；并且所述谷氨酸棒杆菌中强化表达来源于大肠杆菌的转运蛋白RhtA；所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC存在C932T的突变，其中野生型的基因lysC编码GenBank登录号为CAF18822.1的氨基酸序列；所述高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom存在G1133A的突变，其中野生型的基因hom编码GenBank登录号为CAF19887的氨基酸序列；所述强化表达是采用利用Psod启动子使得所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC和所述高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom在基因组水平上强化表达；所述天冬氨酸激酶解的原始基因来源于大肠杆菌的，且所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA存在C1034T突变，其中野生型的基因thrA编码GenBank登录号为NP_414543的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的基因工程菌在生产L-高丝氨酸中的应用。
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