CN116769808A - 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 - Google Patents

一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116769808A
CN116769808A CN202310168797.5A CN202310168797A CN116769808A CN 116769808 A CN116769808 A CN 116769808A CN 202310168797 A CN202310168797 A CN 202310168797A CN 116769808 A CN116769808 A CN 116769808A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fucosyllactose
breast milk
milk oligosaccharide
samt
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310168797.5A
Other languages
English (en)
Inventor
沐万孟
朱莺莺
陈逸晗
王浩
王芬
陈柔霖
张文立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Bloomage Biotech Co Ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University, Bloomage Biotech Co Ltd filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202310168797.5A priority Critical patent/CN116769808A/zh
Publication of CN116769808A publication Critical patent/CN116769808A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/16—Agglomerating or granulating milk powder; Making instant milk powder; Products obtained thereby
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种专一生产2′‑岩藻糖基乳糖的菌株及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明公开了一种编码SAMT蛋白的核酸分子，核酸分子包括如SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。该核酸分子编码的SAMT蛋白来源于Azospirillumlipoferum，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白具有优越的α1,2‑岩藻糖基转移酶催化活性和严格的底物特异性，在摇瓶发酵实验过程中，重组大肠杆菌BSS2生产2′‑岩藻糖基乳糖的能力为8.03g/L，在5L发酵罐中，2′‑岩藻糖基乳糖的产量达到112.56g/L，为目前报道的最高产量，具备工业化应用的潜力。

Description

一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用，属于微生物代谢工程技术领域。
背景技术
母乳是为新生儿量身定制的有益营养，其成分是由人类数千年的进化形成的，旨在促进婴儿的健康和发育。母乳有一个显著的特点，即具有复杂而丰富的未结合聚糖，即人乳寡糖(HMOs)，在婴儿胃肠道中被最低限度消化，可直达到远端肠道，促进益生菌定殖和利用，产生短链脂肪酸，为发育中的婴儿提供许多健康价值，如认知发展和免疫调节特性。2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)作为HMOs中含量最多的成分，已在临床前研究中得到广泛证实，具有调节免疫系统、预防坏死性小肠结肠炎、促进大脑发育、增强益生菌定殖、改善肠道健康等多方面益处。在一项观察性研究中，将2′-岩藻糖基乳糖引入含有益生菌乳酸双歧杆菌Bb12或罗伊氏乳酸菌DSM 17938的婴儿配方奶粉中，对发育中的婴儿显示出令人满意的胃肠道耐受性。此外，观察到含有2′-岩藻糖基乳糖的婴儿配方奶粉与母乳喂养的婴儿相比，循环细胞因子浓度没有差异，显示出良好的安全性。因此，2′-岩藻糖基乳糖不仅具有不可替代的生理作用，而且具有广泛的商业应用价值。迄今为止，2′-岩藻糖基乳糖已获得美国食品药品监督管理局(FDA)和欧盟的认可，并被批准为商业婴儿配方奶粉的有效成分。
目前，2′-岩藻糖基乳糖可以通过化学法、酶法催化法合成以及微生物发酵法生产。化学法合成2′-岩藻糖基乳糖涉及到复杂的生产条件且步骤严苛繁冗，并且原料成本较高；酶法合成虽温和可控,可较快的获得目标产物，但鉴于合成前体物质的价格高昂，使得生产成本较高。相比之下，微生物发酵法可通过直接在培养基中添加底物乳糖即可实现大规模的生产，步骤简便得率较高，适宜工业化应用。
在2′-岩藻糖基乳糖的生产过程中，ɑ1,2-糖基转移酶扮演着决定性的作用，但这取决于该酶的催化活性。目前，众多已报道的编码ɑ1,2-糖基转移酶的异源基因在从头合成2′-岩藻糖基乳糖的生产过程中，微生物发酵法虽已能实现高效价的2′-岩藻糖基乳糖合成，但产物中发现存在有其他岩藻糖基化母乳寡糖的特点，如3-岩藻糖基乳糖(3-FL)和双岩藻糖基乳糖(DFL)这给生产后期的分离纯化带来一定的困难。
发明内容
针对目前已报道的ɑ1,2-糖基转移酶及其在微生物发酵产物中存在其他岩藻糖基化母乳寡糖的问题，本发明提供了一种用于制备母乳寡糖的核酸分子、表达载体和微生物，可高效转化乳糖生产2′-岩藻糖基乳糖且不存在其他岩藻糖基化母乳寡糖产生，便于下游的分离纯化工作。
本发明的第一个目的是提供了一种编码SAMT蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。
优选的，所述核酸分子包括与SEQ ID NO.2具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列。
更优选的，所述核酸分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述SAMT蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列或与SEQ IDNO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
更优选的，所述SAMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为Azospirillumlipoferum来源的ɑ-1,2-糖基转移酶，GeneBank号为SMH41196.1。
本发明的第二个目的是提供了一种含上述核酸分子的转化子和表达载体。
优选的，所述表达载体为pET表达载体和/或pRSF表达载体。
在一种优选的实施方式中，所述pET表达载体为pET-AB-SAMT，所述pET-AB-SAMT的构建方法为：以质粒pET-ABW为模板，以SAMT(序列如SEQ ID NO.2)为目的片段替代pET-ABW中的wbgL基因，最终获得表达载体pET-AB-SAMT。
质粒pET-ABW可见公开号为CN114874964A的中国专利文件，一种高产2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用中记载。
本发明的第三个目的是提供了一种微生物，所述微生物含有上述核酸分子和/或上述表达载体。
优选的，所述微生物含有上述核酸分子和上述表达载体。
进一步的，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种或多种；优选的，所述微生物为大肠杆菌。
在一种实施方式中，基于大肠杆菌BL21(DE3)中GDP-L-fucose通路代谢通量增强的策略下进行改造，删除了2′-岩藻糖基乳糖从头合成过程中的竞争分支，即降解乳糖的β-半乳糖苷酶(lacZ)和合成细胞壁荚膜酸的UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(wcaJ)，避免前体物质GDP-L-fucose和乳糖被用于菌体自身生长代谢。在GDP-L-fucose通路代谢途径中，关键基因元件如甘露糖1-鸟苷酸转移酶(manC)、磷酸甘露糖酶(manB)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(wcaG)的表达对关键供体GDP-L-fucose的蓄积和2′-岩藻糖基乳糖的最终产能尤为重要。因而在从头合成途径中，选择性强化GDP-L-fucose通路的关键基因用以提升工程菌中GDP-L-fucose池的蓄积(图1)。
在一种优选的实施方式中，所述重组大肠杆菌敲除了基因组中β-半乳糖苷酶编码基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaJ，游离表达Azospirillum lipoferum来源的ɑ1,2-糖基转移酶编码基因，并游离表达GDP-L-fucose通路的关键基因以强化供体GDP-L-fucose在宿主中蓄积和转化。
在一种优选的实施方式中，所述重组大肠杆菌整合表达了组成型启动子PJ23119强化的Azospirillum lipoferum来源的ɑ1,2-糖基转移酶编码基因。
在一种优选的实施方式中，在recA位点整合表达组成型启动子PJ23119强化的Azospirillum lipoferum来源的ɑ1,2-糖基转移酶编码基因。
在一种优选的实施方式中，所述GDP-L-fucose通路的关键基因包括磷酸甘露糖酶编码基因manB、甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶编码基因wcaG。
在一种优选的实施方式中，利用强启动子PJ23119取代基因组上manC-manB基因簇前的启动子。
在一种优选的实施方式中，利用pRSFDuet-1载体表达manB、manC、gmd和wcaG。
在一种优选的实施方式中，以pETDuet-1为表达载体，将密码子优化后Azospirillum lipoferum来源的ɑ1,2-糖基转移酶编码基因SAMT克隆至质粒的多克隆位点二号位(MCS2)，并引入rcsA、rcsB至质粒的多克隆位点一号位(MCS1)以间接强化GDP-L-foucose通路下关键基因的表达。
在一种优选的实施方式中，所述SAMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种优选的实施方式中，优化后的Azospirillum lipoferum来源的ɑ1,2-糖基转移酶基因SAMT的具体序列如SEQ ID NO.2所示
在一种优选的实施方式中，所述manC的具体序列如SEQ ID NO.4所示、所述manB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5所示、所述gmd的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6所示，所述wcaG的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示。
在一种优选的实施方式中，所述强启动子PJ23119的具体序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种优选的实施方式中，所述rcsA、rcsB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、SEQID NO.10所示。
在一种优选的实施方式中，所述β-半乳糖苷酶的NCBI序列号为NP_414878.1，所述UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ的NCBI序列号为NP_416551.1。
在一种优选的实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第四个目的是提供了一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包括上述微生物。
本发明的第五个目的是提供了上述核酸分子，或上述表达载体，或上述微生物，或上述全细胞催化剂在制备母乳寡糖中的应用；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
本发明的第六个目的是提供了一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法是以所述微生物或所述全细胞催化剂生产母乳寡糖。
优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖。
更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
在一种实施方式，以甘油为碳源，以乳糖为底物，以IPTG为诱导剂。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/L甘油的分批发酵体系中，37℃，220rpm，培养至OD6000.6～0.8，加入终浓度为0.1～0.5mM IPTG，同时加入终浓度为5～10g/L乳糖，25℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。
在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到5L发酵罐体系中(甘油浓度为30g/L)，发酵体系的发酵温度37℃，搅拌转速300～600r/min，通气量2.2vvm，pH 6.6±0.05时，生长至OD60015～20时加入终浓度为5g/L乳糖和终浓度为0.1～0.5mM的IPTG，在25℃下诱导培养不少于100h。
在一种实施方式中，发酵过程应间歇性的补充乳糖和甘油，以维持乳糖和甘油的浓度在5g/L，以维持稳定的菌体生产速率。
在一种实施方式中，发酵体系中还含有13.5g/L磷酸二氢钾、4.0g/L磷酸氢二氨、1.7g/L柠檬酸、1.4g/L七水硫酸镁和10ml/L微量金属元素；微量金属元素包括：10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。
本发明的第七个目的是提供了一种由上述方法制备得到的母乳寡糖；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
本发明的第八个目的是提供了一种组合物，所述组合物包括上述母乳寡糖；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
本发明的第九个目的是提供了上述母乳寡糖或上述组合物在制备含母乳寡糖的药品、食品或化妆品中的应用；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
有益效果：
本发明以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，利用本发明筛选到新的特异性编码ɑ1,2-糖基转移酶的基因SAMT构建特异性高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌。本发明通过pEcCpf1/pcrEG基因编辑系统(自CRISPR-Cpf1系统衍生)整合SAMT至大肠杆菌recA位点，以及一系列改造，获得了可特异性高产2′-岩藻糖基乳糖的菌株，在5L发酵罐中可高效生产112.56g/L的2′-岩藻糖基乳糖，产物单一无其他岩藻糖基化产物形成，是目前报道最高的产量，具有很大的工业应用潜力。
附图说明
图1为2′-岩藻糖基乳糖代谢通路图；
图2为来源于Azospirillum lipoferum的ɑ1,2-糖基转移酶SAMT与其他ɑ1,2-糖基转移酶的基因序列比对结果；
图3为工程菌的LC-MS谱图结果；
图4为工程菌BSS2和BWW2的离子色谱图结果。
具体实施方式
2′-岩藻糖基乳糖的发酵培养基说明：
LB液体培养基(种子培养基)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)。
甘油定量培养基(发酵培养基)：20g/L甘油(摇瓶发酵)或30g/L甘油(发酵罐发酵)，13.5g/L磷酸二氢钾，4.0g/L磷酸氢二氨，1.7g/L柠檬酸，1.4g/L七水硫酸镁，10ml/L10g/L硫酸亚铁，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L无水硫酸铜，0.35g/L一水硫酸锰，0.23g/L十水硼酸钠，0.11g/L钼酸铵，2.0g/L二水氯化钙。
菌株摇瓶发酵：挑取单菌落于4mL带有1‰氨苄和卡那霉素抗生素的液体LB培养基中，置于摇床37℃过夜培养，吸取2mL培养液接种于含有1‰氨苄和卡那霉素抗生素的100mL的甘油定量培养基中，在37℃摇床中振荡培养至OD600处于0.6～0.8，随即加入0.1～0.5mMIPTG进行诱导重组表达，并注入5g/L或8g/L的乳糖作为底物用以生成2′-岩藻糖基乳糖。更改培养温度为25℃，继续培养72h后取发酵液进行HPLC检测2′-岩藻糖基乳糖的生成情况。
检测2′-岩藻糖基乳糖(HPLC)：
检测器：示差检测器；流动相：0.5mmol/L,H2SO4；流速：0.6mL/min；色谱柱：Carbohydrate Analysis(Rezex ROA-organic acid H+(8％))；柱温：60℃；进样量：10μL；
离子色谱检测参数：
采用CarboPac PA10色谱柱(4mm×250mm)测定2′-岩藻糖基乳糖、乳糖、3-岩藻糖基乳糖和双岩藻糖基乳糖的浓度。梯度洗脱采用三种溶液：洗脱液A：超纯水；洗脱液B：1M醋酸钠；洗脱液C：250mM NaOH；以1.0mL/min的流速线性梯度洗脱；
质谱检测参数：
使用MALDI SYNAPT Q-TOF质谱仪(Waters,Milford,MA,USA)进行质谱分析，毛细管：3.5kV；圆锥，20v；源块温度，100℃；脱溶温度，400℃；脱溶气流量：700L/h；锥气流量：50L/h；碰撞能量：6eV；质量范围(m/z):50～1000；检测器电压：2000V。
实施例1
SAMT的原始核苷酸序列(SAMT1)如SEQ ID NO.3所示，对前述序列进行密码子优化，获得的SAMT的优化核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(图2)。
以质粒pET-W和pET-ABW作为模板，分别将SAMT1和SAMT克隆至上述载体二号位替换wbgL基因片段为SAMT1和SAMT基因片段，构建得到重组质粒pET-SAMT1与pET-AB-SAMT，均交付苏州金唯智生物科技有限公司完成。以pET-AB-SAMT质粒为模板，以HP-Pet-SA-F1/R1为引物进行扩增环P，胶回收DNA片段，获得pET-SAMT。
HP-Pet-SA-F1：CCATGGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTGC
HP-Pet-SA-R1：CAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAG
质粒pET-ABW、pET-W公开于公开号为CN114874964A的专利文献中。
质粒pRSF-CBGW公开于公开号为CN112342176A的专利文献中。
实施例2
敲除大肠杆菌BL21中编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ(NCBI序列号为NP_416551.1)的基因wcaJ，编码β-半乳糖苷酶LacZ(NCBI序列号为NP_414878.1)的基因lacZ，基因的敲除方法具体参见公开号为CN110804577A的专利，得到重组菌BWL。
利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在重组菌BWL基因组中manC-manB的原生启动子替换为组成型启动子PJ23119，替换方法及引物信息具体参见公开号为CN114874964A的专利，得到重组菌BCB。
利用pEcCpf1/pcrEG基因编辑系统在重组菌BCB基因组中recA位点整合带有PJ23119启动表达的SAMT，得到菌株BS。
操作如下：
以大肠杆菌BL21基因组为模板，使用引物UP-S-F/R和Down-ZH-F/R，通过PCR分别扩增recA位点的上下目标片段UP和Down。以实施例1构建的质粒pET-SAMT为模板，使用引物SAMT-ZH-F/R，通过PCR扩增出PJ23119-SAMT-T7 term片段。将UP、Down及PJ23119-SAMT-T7 term三片段通过引物recA-UH-OVER-F/R进行组装构建，通过胶回收得到最终片段UP-PJ23119-SAMT-T7 term-Down作为供体模板。
在recA位点上找到带有识别该域的N23序列，用以识别定位切割recA来整合SAMT。以原始商品化质粒pEcgRNA为模板，通过引物pTarget-recA-N23-F/R环P获得pTarget-F-SAMT，将所获得的pTarget-F-SAMT(800ng)和供体模板(200ng)一同电转入带有Cpf1电转感受态的目标菌株BCB中，电转仪电压设为2.5kv(2mm电转杯)，电转之后立即加入冰上预冷的900μL LB，37℃孵育1h后涂卡那霉素(Kan)和壮观霉素(Spc)双抗板，于37℃烘箱过夜培养。测序成功后即获得带有SAMT的重组菌株BS。
将验证成功的菌，接种在4mL含终浓度10mM的鼠李糖和2μL卡那霉素的LB试管中37℃培养过夜，结束后在LB固体平板(含卡那霉素)上划线，37℃培养；平板长出单菌落后，分别在含有卡那霉素或含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上划线，37℃培养。在含有卡那霉素的平板上生长，但在含有卡那霉素和壮观霉素的平板不生长的菌即为成功去除pTarget-F-SAMT；随后将单菌落进一步接种到含有5g/L葡萄糖的LB液体培养基中，在37℃，200rpm培养10-12h。之后取10μL左右的菌液划线在含5g/L葡萄糖和10g/L蔗糖的LB平板上37℃培养10-12h。随机挑选单菌落分别在无抗LB平板上及含卡那霉素的LB平板上划线，在无抗板上生长且在含有卡那霉素的LB平板上不生长的菌即为最终成功去除质粒的宿主。所用引物序列如表1。
表1用于构建重组工程菌的引物序列
实施例3
将实施例1中的质粒pRSF-CBGW和pET-SAMT(或pET-AB-SAMT)共同转入目标工程菌，并在相同的组合条件下以来源于编码大肠杆菌O126的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL作为对照来考察SAMT的发酵生产情况，具体菌株质粒组合信息见表2。
将重组质粒以pRSF-CBGW和pETDuet-SAMT或pRSF-CBGW和pETDuet-AB-SAMT的组合转入工程菌感受态中，置于冰上冰浴20min，随后在42℃下热激90s，立即转入冰上冰浴5min；在超净工作台中加入900μL的LB培养基在37℃振荡培养1h，待培养结束后低速离心2min，取100μL菌液均匀涂布于LB固体平板上，37℃培养过夜。随后挑取单菌落进行摇瓶发酵，HPLC测定2′-岩藻糖基乳糖的产量。各菌株发酵结果见表2。
表2用于2′-岩藻糖基乳糖生产的工程菌株信息
结果如表2所示，表达密码子优化后的SAMT菌株BS1比未优化密码子的SAMT1菌株BS2产量增加了3.51倍；说明异源蛋白表达进行密码子优化，选择高丰度的tRNA对应的同义密码子，有利于提升该蛋白表达，从而使其具有更高的生产潜力。
除此之外，整合SAMT至菌株基因组后，BSS2菌株的2′-岩藻糖基乳糖的产量可达到8.03g/L的效价，同等条件下2′-岩藻糖基乳糖的效价高于表达wbgL的菌株BSW2。
实施例4
为验证SAMT的发酵产物，将实施例3中的菌株BSS2和BWW2菌株的发酵产物进行LC-MS检测，结果显示，与2′-岩藻糖基乳糖和双岩藻糖基乳糖标准品相比(图3)，BWW2菌株的发酵产物中同时存在有2′-岩藻糖基乳糖和双岩藻糖基乳糖，而BSS2菌株的发酵产物中只含有2′-岩藻糖基乳糖产物。因3-岩藻糖基乳糖分子量与2′-岩藻糖基乳糖一致，因而在LC-MS中无法准确区分。
为了进一步验证实施例3中的菌株BSS2和BWW2菌株的发酵产物的特异性，将四种标准品进行离子色谱检测，检测发酵液中的组分，结果如图4所示，菌株BSS2的发酵产物中除2′-岩藻糖基乳糖外不存在其他的岩藻糖基化乳糖产物，专一性良好。而BWW2菌株的发酵产物中存在有3-岩藻糖基乳糖和双岩藻糖基乳糖产物。
实施例5
为进一步验证实施例3中构建的菌株BSS2在5L发酵罐中的生产效果，将菌株BSS2种子液以10％(v/v)的接种比例接种到含1.5L甘油定量培养基(甘油为30g/L)的5L发酵罐中，设定溶氧为30％，生长温度37℃，搅拌速度800rpm，通气量2vvm，pH 6.6±0.05。生长过程中的pH用氨水调控以维持全程发酵的pH稳定；待罐体菌株的OD600生长至17时，加入终浓度为0.1mM的IPTG和5g/L的乳糖，调整温度为25℃，期间不定时检测乳糖和甘油的消耗情况，通过补加乳糖(200g/L乳糖包含1‰氨苄抗生素和卡那抗生素)和甘油(600g/L甘油包含20g/L的七水硫酸镁、0.2g/L的硫胺素和1‰氨苄抗生素和卡那抗生素)以维持发酵体系中的乳糖和甘油的浓度在5g/L。全程发酵时间不少于100h，最终2′-岩藻糖基乳糖的产量达到112.56g/L，乳糖转化率为0.98mol/mol。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种编码SAMT蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。
2.一种含权利要求1所述核酸分子的表达载体。
3.一种微生物，其特征在于，所述微生物含有权利要求1所述核酸分子和/或权利要求2所述表达载体。
4.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌中的一种或多种；优选的，所述微生物为大肠杆菌。
5.一种全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂包括权利要求3或4所述微生物。
6.权利要求1所述核酸分子，或权利要求2所述表达载体，或权利要求3或4所述微生物，或权利要求5所述全细胞催化剂在制备母乳寡糖中的应用；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
7.一种生产母乳寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述核酸分子，或权利要求2所述表达载体，或权利要求3或4所述微生物，或权利要求5所述全细胞催化剂生产母乳寡糖；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
8.一种由权利要求7所述方法制备得到的母乳寡糖；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求8所述母乳寡糖；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
10.权利要求8所述母乳寡糖或权利要求9所述组合物在制备含母乳寡糖的药品、食品或化妆品中的应用；优选地，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖；更优选的，所述母乳寡糖为2'-岩藻糖基乳糖。
CN202310168797.5A 2023-02-27 2023-02-27 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用 Pending CN116769808A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310168797.5A CN116769808A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310168797.5A CN116769808A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116769808A true CN116769808A (zh) 2023-09-19

Family

ID=87984857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310168797.5A Pending CN116769808A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116769808A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117089503A (zh) * 2023-10-17 2023-11-21 保龄宝生物股份有限公司 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106795484A (zh) * 2014-05-15 2017-05-31 格里康辛有限责任公司 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种
KR101972925B1 (ko) * 2018-09-05 2019-04-26 (주)에이피테크놀로지 2'-푸코실락토오스를 함유하는 자극 완화용 화장료 조성물
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106795484A (zh) * 2014-05-15 2017-05-31 格里康辛有限责任公司 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种
KR101972925B1 (ko) * 2018-09-05 2019-04-26 (주)에이피테크놀로지 2'-푸코실락토오스를 함유하는 자극 완화용 화장료 조성물
CN112342176A (zh) * 2020-10-15 2021-02-09 江南大学 产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN114874964A (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 江南大学 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VARGHESE, N.等: "Azospirillum lipoferum strain R1C genome assembly, contig: Ga0048941_13, whole genomeshotgun sequence", 《GENBANK》, 21 April 2017 (2017-04-21), pages 59684 - 60532 *
VARGHESE, N.等: "Glycosyl transferase family 11 [Azospirillum lipoferum]", 《GENBANK》, 21 April 2017 (2017-04-21) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117089503A (zh) * 2023-10-17 2023-11-21 保龄宝生物股份有限公司 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用
CN117089503B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 保龄宝生物股份有限公司 一种大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109402158B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
CN114480240B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法
CN114774343B (zh) 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用
CN117568249A (zh) L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
CN113684164B (zh) 一种高产乳酰-n-新四糖的微生物的构建方法及应用
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN113186142B (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN116121161B (zh) 一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116555145A (zh) 重组大肠杆菌及其构建方法和生产2′-岩藻糖基乳糖的方法
CN116769808A (zh) 一种专一生产2′-岩藻糖基乳糖的菌株及应用
US20190203236A1 (en) Method of producing d-xylonate and coryneform bacterium
CN113151133B (zh) 一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用
CN117305211A (zh) 一种高效合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的构建及其应用
US20210324391A1 (en) Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10
CN114806991B (zh) 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法
CN116555147A (zh) 一种高产n-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及应用
JP2024513834A (ja) 酵素処理を用いた２’－フコシルラクトースの生産性増大方法
CN115948314A (zh) 一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株
CN110872595B (zh) 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用
CN117586937B (zh) 一种提高乳酰-n-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用
CN116200360B (zh) 一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法
CN116286575B (zh) 一种利用枯草芽孢杆菌高效表达生淀粉α-淀粉酶的方法
CN118064339A (zh) 一种无质粒合成3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌的构建及应用
CN115029289B (zh) 高产l-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN118440916A (zh) 载体、转化子、唾液酸转移酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination