CN117586937B - 一种提高乳酰-n-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用 - Google Patents

一种提高乳酰-n-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高乳酰‑N‑四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用，通过将外源基因NsplgtA、Pbr3GalT及乳酰‑N‑四糖合成途径中的galE整合到宿主大肠杆菌基因组中，并敲除lacZ的表达，构建乳酰‑N‑四糖的完整合成途径，从而达到无需外源质粒及抗生素的添加实现高产乳酰‑N‑四糖的目的。构建得到的重组大肠杆菌能够高效生产乳酰‑N‑四糖，在5 L发酵罐中，产量达到48.3 g/L，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用。
背景技术
人乳寡糖（Human milk oligosaccharide HMOs）是人类母乳中的独特成分，且被认为对婴幼儿肠道健康，形成良好的的肠道微生物环境发挥重要作用。除此以外，HMOs还可以促进婴幼儿大脑免疫系统的发育，减少坏死性小肠结肠炎的发生。乳酰-N-四糖LNT是人乳寡糖中含量较为丰富且具有重要功能的成分之一，LNT也可以进行进一步的岩藻糖基化或唾液酸化，衍生后的寡糖占人乳寡糖的30%。LNT及其衍生物在免疫调节，肠胃益生和抗病毒微生物粘附等方面发挥重要作用。LNT已被美国食品药品管理局（FDA）批准可以作为食品添加剂添加到婴幼儿奶粉中。
目前，LNT的合成方法包括化学合成法、酶法合成和微生物合成法，化学合成法存在步骤复杂、原料成本高及对环境不友好等问题，而酶法合成底物昂贵，这两种均不是较为合适的生产方式。微生物合成方法具有绿色环保、成产成本低廉且高效的特点，是一种更为合适的LNT合成方式。合成前体乳酰-N-三糖II的β- 1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶及转化LNTII为LNT的β- 1,3-半乳糖基转移酶（β- 1,3-GalT）成为利用微生物细胞工厂高效合成的限制因素。因此筛选出更为高效LNT合成方式成为目前微生物生产LNT的关键所在。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用。
本发明采用的技术方案是：一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌，在底盘宿主细胞中敲除lacZ基因，插入NsplgtA和Pbr3GalT基因。
优选地，还包括插入galE。
优选地，敲除基因ackA、pta、adhE和yciA中的一种或多种，并在敲除处分别整合NsplgtA；敲除基因hcp、wzzE、wzzB和nagA中的一种或多种，并在敲除处分别整合Pbr3GalT；敲除waaL基因并在敲除处整合galE；敲除基因lacZ。
优选地，NsplgtA在底盘宿主细胞上整合的拷贝数为单拷贝、双拷贝、三拷贝或四拷贝；Pbr3GalT在底盘宿主细胞上整合的拷贝数为单拷贝、双拷贝、三拷贝或四拷贝。
优选地，敲除基因ackA、pta、adhE和yciA，并在敲除处分别整合NsplgtA；敲除基因hcp、wzzE、wzzB和nagA，并在敲除处分别整合Pbr3GalT；敲除waaL基因并在敲除处整合galE；敲除基因lacZ。
一种乳酰-N-四糖的制备方法，通过提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌培养并发酵得到。
优选地，以甘油作为碳源，以乳糖为底物。
优选地，将重组大肠杆菌在含有DM培养基的发酵罐中培养至菌体OD600达到12，添加乳糖含量至10 g/L，温度调整至30℃，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，补加NH4OH使pH稳定在6.8，通气量为2 vvm ～6 vvm，搅拌转速300-900 r/min。
优选地，培养重组大肠杆菌的培养基中包括甘油15～20 g/L，磷酸二氢钾10～13.5 g/L，柠檬酸1.0～2.0 g/L，磷酸氢二氨3.0～5.0 g/L，七水硫酸镁1.0～2.0 g/L和微量金属元素5～10 ml/L；
微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0 g/L，钼酸铵0.11 g/L。
乳酰-N-四糖的制备方法制备得到的乳酰-N-四糖在食品或药物中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：通过对底盘宿主大肠杆菌的改造，构建乳酰-N-四糖的完整合成途径，从而达到无需外源质粒的加入，发酵过程也无需抗生素的添加，既能够实现高产乳酰-N-四糖的目的，又能够进一步提高制得产物的生物安全性；构建得到的提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌能够高效生产乳酰-N-四糖，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为重组大肠杆菌合成乳酰-N-四糖代谢通路；
图2 为不同整合菌株发酵生产乳酰-N-四糖的产量比较；
图3 为5L发酵罐分批补料发酵B8菌株的产物与底物动态变化以及生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌构建及应用，在底盘宿主大肠杆菌BL21（DE3）中通过λ-Red基因编辑方式敲除旁路基因β-半乳糖苷酶lacZ 并整合插入来源于Neisseria. sp的β- 1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶NsplgtA、来源于Pectobacterium brasiliense的β- 1,3-半乳糖基转移酶Pbr3GalT构建乳酰-N-四糖的完整合成途径。进一步的，再整合插入来源于E. coli K-12的尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶galE，实现不需要通过异源表达，无需抗生素的添加，基因稳定表达，构建出合成乳酰-N-四糖（LNT）的完整通路，乳酰-N-四糖合成途径如图1所示，通过改造，显著提升乳酰-N-四糖合成途径在大肠杆菌中的比重，提高乳酰-N-四糖的产量。
以大肠杆菌BL21（DE3）为底盘宿主，敲除编码β半乳糖苷酶基因lacZ; 敲除编码乙酸激酶基因ackA（NP_416799.1）、敲除编码磷酸乙酰转移酶的基因pta（NP_4168001）、敲除编码乙醛辅酶A脱氢酶和铁依赖性的醇脱氢酶基因adhE（NP_415757.1）、敲除编码酰基辅酶A硫酯酶基因yciA（WP_415769.1），并在以上位点分别整合β-1，3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因NsplgtA（RKV66428.1）；敲除敲除编码蛋白S硝化酶的基因hcp（NP_415394.4）、敲除编码抗原多糖共聚酶的基因wzzE（NP_418232.2）、敲除编码O抗原共聚酶的基因wzzB（NP_416531.4）、敲除编码N-乙酰葡糖氨-6-磷酸脱乙酰酶的基因nagA（NP_415203.1）、并在以上位点分别整合β-1，3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT（WP_205538212.1）；敲除编码O抗原连接酶的基因waaL（NP_418079.1），并在该处整合尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶基因galE（NP_415280.3），构建得到提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌。编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的基因NsplgtA在大肠杆菌上整合的拷贝数为单拷贝、双拷贝、三拷贝和四拷贝，相应的可以替代被敲除基因中的一个或多个；编码β- 1, 3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT在大肠杆菌上整合的拷贝数为单拷贝、双拷贝、三拷贝和四拷贝，相应的可以替代被敲除基因中的一个或多个。
其中，编码β-1，3-乙酰葡萄糖胺转移酶NsplgtA经过密码子优化的核苷酸序列如SQE ID NO.1所示；编码所述β- 1,3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT经过密码子优化的核苷酸序列如SQE ID NO.2所示；编码尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶galE经过密码子优化的核苷酸序列如SQE ID NO.3所示。
SQE ID NO.1
ATGCAGCTGCTGGTGAGCGTGCTGATTTGCGCGTATAACGTGGAAAAATATTTTGCGCAGGCGCTGGATGCGGTGGTGCGCCAGACCTGGCGCAACTTAGAAATTTTTATTGTGGATGATGGCAGCACCGATGGCACCCTGGTGATTGCGAAAGATTTTCAGAAACGCGATAGCCGCATTAAAATTCTGGCGCAGGCCCAGAACAGCGGCCTGATTCCGAGCTTGAATACTGGCCTGGAAGAGATTATTAAGAGCGGCAAAGGCGAATATATTGCGCGCACCGATGCGGATGATATTGCGAGCCCGGATTGGATTGAGAAGATTGTGAGCGCGATGGAAAAAGATCGCGATATTATTGCGATGGGCGCGTGGCTGGAAGTGCTGAGCGAAGAAGGCGATGGCAATCGCTTAGCGCGCCATCATCGTCATGGCGCGATTTGGGATAAACCGACCCGCCATGAAGATATTGCGGCGGTGTTTCCGTTTGGCAACCCGATTCATAACAACACCATGATTATGCGCCGCAGCGTGATTGAAGGCGGCCTGCGCTATGATACCGAATGCGATTGGGCGGAAGATTATAAATTTTGGTACGAAGTGAGCAAACTGGGCCGCCTGGCGTATTATCCGGAAGCGCTGGTGAAATATCGCTTTCATGCGAACCAGGTTAGCAGCAAATATAGCACCCGCCAGCATGAAACCGCGCAGGGCATTCAGAAGACCATTCGCAACGATTTTCTGCAAAGCATTGGCTTTAAAACCCGCTTTGATAGCCTGGAATATCGCCAGACCAAAGCGGTGGCGTATGAACTGCTGGAAAAGGATCTGCCGGAAGATGACTTTGAACGCGTGCGCCATTTTCTGTATCAGTGCTTTAAATGGACCGATACCCCGCCGAGCAACGCATGGTTAGATTTTGCGGCGGATGGCAAAATGCGCCGCCTGTTTACCATGCGCCAGTATTTTAGCATTCTGCGCCGCCTGCTGAAAAACCGCTAA
SQE ID NO.2
ATGATCAACCATAGCCTGGTCAGCGTCATCATTCCGGTCAACAAACACAACCCGTTCCTGAAAGAGGCGATCGAAAGCATCCAGAACCAGAGCTACAGCAACATCGAGGTCATCATCATCGCGAACGGTTGCAGCGACCTGTTTTTCAACAGCCTGCAGGAATTTAGCGACGAGAAAACCAAAATCATCCGCACCGAGCTGAGCTTTCTGCCGTTTTCTCTGAACCTGGGCATCCATATCGCAAACGGCGAGTTTATCGCACGTATGGATAGCGACGATATTGCGGACGTTAACCGCATTGCGAAACAAGTCGCGTACATGATTGCGCATAGCGACGTTACCGTTATTGGCAGCAACGTTAAATTCATCAACGAGCACGGCATCATCACCGGTATGTCTGATTATCCGACCAGTCATCGCAACATCAAAAAACGCATGATGTACAACTGCTGCGTAGCTCATCCGACCGTTATGATGCGTCGCGATGTTATTGTCAAAGCCGGCGGTTATATGTACGGCAGCCTGAGCGAAGATTACGATCTGTGGCTGCGTCTGCTGCAAGACAAAAACGTCGTCTTCCACAACATCAAAGAGCCGCTGCTGCAGTATCGTATTCACGCAAATCAGGCGACCGGCAAAAAATCCCTGTACAAAATCTTCATCTACGACCTGTGCCTGAAACTGCGTTTCTTCCTGCTGTACCCGAACGTTAGCTACTTCCTGGGTTGTATTCGCGGGTTTCTGAGCTATATCTACTGCCGCTACATCAAAAAATAA
SQE ID NO.3
ATGAGAGTTCTGGTTACCGGTGGTAGCGGTTACATTGGAAGTCATACCTGTGTGCAATTACTGCAAAACGGTCATGATGTCATCATTCTTGATAACCTCTGTAACAGTAAGCGCAGCGTACTGCCTGTTATCGAGCGTTTAGGCGGCAAACATCCAACGTTTGTTGAAGGCGATATTCGTAACGAAGCGTTGATGACCGAGATCCTGCACGATCACGCTATCGACACCGTGATCCACTTCGCCGGGCTGAAAGCCGTGGGCGAATCGGTACAAAAACCGCTGGAATATTACGACAACAATGTCAACGGCACTCTGCGCCTGATTAGCGCCATGCGCGCCGCTAACGTCAAAAACTTTATTTTTAGCTCCTCCGCCACCGTTTATGGCGATCAGCCCAAAATTCCATACGTTGAAAGCTTCCCGACCGGCACACCGCAAAGCCCTTACGGCAAAAGCAAGCTGATGGTGGAACAGATCCTCACCGATCTGCAAAAAGCCCAGCCGGACTGGAGCATTGCCCTGCTGCGCTACTTCAACCCGGTTGGCGCGCATCCGTCGGGCGATATGGGCGAAGATCCGCAAGGCATTCCGAATAACCTGATGCCATACATCGCCCAGGTTGCTGTAGGCCGTCGCGACTCGCTGGCGATTTTTGGTAACGATTATCCGACCGAAGATGGTACTGGCGTACGCGATTACATCCACGTAATGGATCTGGCGGACGGTCACGTCGTGGCGATGGAAAAACTGGCGAACAAGCCAGGCGTACACATCTACAACCTCGGCGCTGGCGTAGGCAACAGCGTGCTGGACGTGGTTAATGCCTTCAGCAAAGCCTGCGGCAAACCGGTTAATTATCATTTTGCACCGCGTCGCGAGGGCGACCTTCCGGCCTACTGGGCGGACGCCAGCAAAGCCGACCGTGAACTGAACTGGCGCGTAACGCGCACACTCGATGAAATGGCGCAGGACACCTGGCACTGGCAGTCACGCCATCCACAGGGATATCCCGATTAA
本发明某些实施例中，使用λ-Red同源重组进行基因敲除，首先需要在宿主菌BL21（DE3）中导入pKD46质粒，诱导重组酶表达；进而使用含有重组酶的菌进行两步同源重组，使用氯霉素抗性基因与蔗糖敏感基因sacB通过重叠延伸PCR进行融合，第一步用cat-sacB片段置换待缺失基因，电转后涂布氯霉素和庆大霉素双抗平板，筛选出能在平板生长的菌落进行PCR鉴定；第二步利用sacB基因的蔗糖聚合致死作用反筛出不含cat-sacB片段的菌株，再次进行PCR鉴定并测序验证，得到目的基因整合成功的菌株。
以重组大肠杆菌为发酵菌株，以甘油为碳源，以乳糖为底物，进行陪培养或进行发酵；可将重组大肠杆菌通过摇瓶体系培养或通过发酵罐发酵，可使用DM培养基对重组大肠杆菌进行培养或发酵，DM培养基中含有甘油15～20 g/L，磷酸二氢钾10～13.5 g/L，柠檬酸1.0～2.0 g/L，磷酸氢二氨3.0～5.0 g/L，七水硫酸镁1.0～2.0 g/L和微量金属元素5～10ml/L；微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0 g/L，钼酸铵0.11 g/L。
将构建的重组大肠杆菌在含有2 L含有DM培养基的5 L发酵罐中菌体OD600达到12，添加乳糖含量至10 g/L，温度调整至30度，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油，后续通过补加NH4OH使pH稳定在6.8，通气量（2 vvm ～6 vvm）和搅拌转速300-900 r/min，对重组工程菌进行培养和发酵。通过实验验证，在摇瓶发酵实验中，重组大肠杆菌可生产乳酰-N-四糖6.11 g/L，在5 L发酵罐实验中，乳酰-N-四糖产量48.3 g/L，具有良好的工业化应用前景。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌的构建
本实施例所使用的质粒、PCR酶、柱式DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和细菌基因组提取试剂盒等商业产品，具体操作按照试剂盒内说明书进行操作。菌落PCR、琼脂糖凝胶电泳、电转化、感受态细胞的制备等按照常规操作方法操作。质粒的构建工作交由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成，DNA产物测序和PCR引物合成交由安升达（天津）公司完成。大肠杆菌感受态的制备：100mL LB培养基培养的大肠杆菌，当菌体OD600达到0.6时，置于冰上30min，之后分批将菌液用离心机以4℃、5500rpm的转速离心5min，后用4℃预冷的含10%的甘油水溶液清洗菌体沉淀三次。诱导剂浓度：在制备大肠杆菌感受过程中需添加的L-阿拉伯糖的添加终浓度为5%。抗生素浓度：氨苄青霉素100 mg/L、链霉素50 mg/L、庆大霉素25 mg/L、氯霉素25 mg/L。LB液体培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L；LB固体培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。
1.1 大肠杆菌lacZ基因的敲除
设计引物lacZ-c-s-F/R，以pRE112质粒为模版，扩增出lacZ-cat-sacB片段。引物胶回收DNA片段。
PCR体系如下所示；
PCR反应条件：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s/kb，35个循环，68℃终延伸10 min，4℃保存。
制备含pKD46的大肠杆菌感受态，加入0.5%的阿拉伯糖诱导λ - Red重组酶表达。
加入lacZ-cat-sacB片段后电击转化，复苏2 h后涂布氯霉素抗性和庆大霉素抗性平板，过夜培养。获得在lacZ基因位置成功重组cat-scaB片段的大肠杆菌。
设计引物lacZ-up-F/R、lacZ-down-F/R，以BL21（DE3）基因组为模版，胶回收片段，之后两个片段通过重叠延伸PCR方式连接起来。
PCR体系如下所示；
GenStar 2xSuper HiFi
PCR反应条件：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s/kb，30个循环，72℃终延伸5 min，4℃保存。
制备BL21Δ lacZ::cat-sacB（pKD46）感受态，加入lacZ-up-down片段后电击转化，复苏2 h后转接20 ml含20%蔗糖的不含氯化钠的LB培养基的50 ml锥形瓶培养过夜，取菌液1 ml稀释至10-1～10-6等不同梯度，取10-4～10-6梯度稀释液1 ml分别涂布含10%蔗糖的不含氯化钠平板。30℃过夜培养后平板影印至庆大霉素和氯霉素双抗平板及庆大霉素平板，30℃过夜培养后挑取对应在双抗平板不生长，单抗平板正常生长的菌落进行菌落PCR鉴定。
鉴定成功后相关测序工作由测序公司负责。
验证该基因已被成功功敲除后，挑取单菌落接种于20 ml的LB培养基中过夜培养，取部分菌液划线至无抗平板，后挑取单菌落验证是否消除pKD46质粒。验证成功为为重组大肠杆菌EL，命名为B0。
1.2 waaL基因的敲除和galE的重组
在构建galE重组片段时，片段由waaL上下游同源臂及由M1-93启动的galE基因片段构成。通过重叠延伸PCR的方式将三段片段连接在一起。敲除waaL的具体操作流程与整合基因的流程与步骤1.1相同，以步骤1.1制备得到的B0菌株为基础，敲除waaL基因并重组galE基因，构建得到菌株B1。
1.3 重组大肠杆菌的构建
按照步骤1.1或步骤1.2方法分别敲除基因hcp、wzzE、wzzB、nagA并在被敲除处分别整合β-1,3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT，敲除基因ackA、pta、adhE、yciA并在敲除处分别整合β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因NsplgtA（RKV66428.1），具体敲除方法和整合方法与步骤1.1相同。
具体的，依次敲除基因hcp，重组Pbr3GalT，构建得到菌株B2；敲除基因pta，重组NsplgtA，构建得到菌株B3；敲除基因wzzE，重组Pbr3GalT，构建得到菌株B4；敲除基因adhE，重组NsplgtA，构建得到菌株B5；敲除基因wzzB，重组Pbr3GalT，构建得到菌株B6；敲除基因yciA，重组NsplgtA，构建得到菌株B7；敲除基因nagA，重组Pbr3GalT，构建得到菌株B8；具体构建方法如表1所示，所用引物信息如表2所示。
表1. 不同菌株的构建
表2. 引物序列
实施例2：重组大肠杆菌表达生产乳酰-N-四糖能力分析
2.1 菌株培养及发酵：
分别对实施例1制备得到的B0-B8菌株进行培养及发酵，在相应的平板上挑取单菌落加至含20 ml不添加抗生素的LB培养基的50 ml锥形瓶中，在37℃下培养过夜12～14 h，后转接5 ml种子液至含50 ml DM培养基的250 ml摇瓶中，37℃，220 rpm培养。当菌体OD600达到2.2～2.5时，加入底物乳糖至终浓度10 g/L。添加乳糖后将温度改为30℃，连续培养72h。
在5 L发酵罐实验中，初始DM培养基为2 L，种子接种液体积为10%（v/v），种子液转接至发酵罐初期，温度为37℃，当菌体OD600长至10～12时，加入底物乳糖至浓度为10 g/L，并调整温度至30℃，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油。在发酵期间通过恒流泵补加14%的氨水使培养基pH稳定在6.8左右，通过通气量（2vvm～6vvm）与搅拌速度（300～900 rpm）与溶氧值关联，使溶氧量维持在20%～30%的水平。当罐内甘油消耗至3 g/L时，通过恒流泵补加600 g/L的甘油30 ml，当乳糖浓度低于3 g/L时，通过恒流泵补加200 g/L的乳糖30ml。
DM培养基包括：甘油20 g/L、磷酸二氢钾13.5 g/L、柠檬酸1.7 g/L、磷酸氢二氨1.4 g/L、七水硫酸镁2.0 g/L和微量元素10 ml/L。微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0 g/L，钼酸铵0.11 g/L。
2.2 乳酰-N-四糖的产量检测
分别检测B0-B8菌株发酵液中乳酰-N-四糖，将发酵液以5500 rpm离心转速离心10min，将上清液用无菌注射器吸出，用0.22 μm水系过滤器过滤后通过高效液相色谱仪（Thermo Scientific UltiMate 3000），HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为RezexROA-organic acid（Phenomenex，USA），柱温为60ºC；流动相为5 mM的H2SO4水溶液，流速为0.6 mL/min；进样量为10 μL。
B0-B8菌株发酵生产乳酰-N-四糖的产量比较如图2所示，从图中能够看出，经过基因编辑的重组工程菌B8的乳酰-N-四糖生产能力突出，通过敲除旁路关键基因，进一步优化乳酰-N-四糖合成路径，从而实现显著提高乳酰-N-四糖产量的目的。如图3所示，为5L发酵罐分批补料发酵B8菌株的产物与底物动态变化以及生长曲线，能够看出，发酵过程中，菌株对甘油和乳糖持续消耗，随着菌株的培养，OD600的升高，乳酰-N-四糖产量也迅速增加，说明了重新构建得到的工程菌能够高产量表达乳酰-N-四糖。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一种提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌，其特征在于：以大肠杆菌BL21（DE3）为底盘宿主，敲除编码β半乳糖苷酶基因lacZ；
敲除编码乙酸激酶基因ackA、敲除编码磷酸乙酰转移酶的基因pta、敲除编码乙醛辅酶A脱氢酶和铁依赖性的醇脱氢酶基因adhE、敲除编码酰基辅酶A硫酯酶基因yciA，并在以上位点分别整合β-1，3-乙酰葡萄糖胺转移酶基因NsplgtA；
敲除编码蛋白S硝化酶的基因hcp、敲除编码抗原多糖共聚酶的基因wzzE、敲除编码O抗原共聚酶的基因wzzB、敲除编码N-乙酰葡糖氨-6-磷酸脱乙酰酶的基因nagA、并在以上位点分别整合β-1，3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT；
敲除编码O抗原连接酶的基因waaL，并在该处整合尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶基因galE；
构建得到提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌；
其中，编码β-1，3-乙酰葡萄糖胺转移酶NsplgtA经过密码子优化的核苷酸序列如SQEID NO.1所示；编码所述β- 1,3-半乳糖基转移酶基因Pbr3GalT经过密码子优化的核苷酸序列如SQE ID NO.2所示；编码尿苷二磷酸葡萄糖 4-差向异构酶galE经过密码子优化的核苷酸序列如SQE ID NO.3所示。
2.一种乳酰-N-四糖的制备方法，其特征在于：通过权利要求1所述的提高乳酰-N-四糖产量的重组大肠杆菌培养并发酵得到。
3.根据权利要求2所述的乳酰-N-四糖的制备方法，其特征在于：以甘油作为碳源，以乳糖为底物。
4.根据权利要求3所述的乳酰-N-四糖的制备方法，其特征在于：将重组大肠杆菌在含有DM培养基的发酵罐中培养至菌体OD600达到12，添加乳糖含量至10 g/L，温度调整至30℃，每12 h补加10 g/L乳糖和20 g/L甘油。
5.根据权利要求4所述的乳酰-N-四糖的制备方法，其特征在于：培养重组大肠杆菌的培养基中包括甘油15～20 g/L，磷酸二氢钾10～13.5 g/L，柠檬酸1.0～2.0 g/L，磷酸氢二氨3.0～5.0 g/L，七水硫酸镁1.0～2.0 g/L和微量金属元素5～10 ml/L；
微量金属元素中含有水硫酸锌2.25 g/L，硫酸亚铁10 g/L，一水硫酸锰0.35 g/L，无水硫酸铜1.0 g/L，十水硼酸钠0.23 g/L，二水氯化钙2.0 g/L，钼酸铵0.11 g/L。
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