CN116355819A - 高效合成乳酰-n-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用 - Google Patents

高效合成乳酰-n-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高效合成乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。通过CRISPR相关的转座酶系统(CRISPR‑associated transposases,MUCICAT))对大肠杆菌基因组进行多位点的基因编辑，实现大肠杆菌基因组不同拷贝数编码β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶的基因整合，再引入β‑1,3‑半乳糖基转移酶，从而构建了多株生产乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌，在摇瓶实验过程中，乳酰‑N‑四糖的摇瓶产量可以达到6.07g/L，为进一步工业化生产与合成其他复杂母乳寡糖奠定了基础。

Description

高效合成乳酰-N-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及高效合成乳酰-N-四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。
背景技术
母乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs)作为母乳中除了乳糖和脂质外的第三大固体营养成分，它们为婴幼儿健康成长提供了不可替代的益处。相关研究表明母乳寡糖在肠道健康如抗菌作用、肠道屏障等方面发挥了独特作用。
目前，乳酰-N-四糖的合成方法分为化学合成法、酶法合成法和细胞工厂法。化学合成因其过程复杂且有毒性，无法进一步大规模生产乳酰-N-四糖。酶法合成需要昂贵的核苷酸糖底物和辅因子的加入，限制了其工业化生产乳酰-N-四糖。细胞工厂法生产乳酰-N-四糖的生物合成途径涉及两个关键基因，即编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)和编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因来源于大肠杆菌O55:7或者P.ferrooxidans。
Figure BDA0004104403390000011
等人在大肠杆菌W3110基因组整合编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因(lgtA)和编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因(wbgO)，并优化培养基条件，强化UDP-半乳糖的供应，最后在分批补料过程中，乳酰-N-四糖的产量为12.72g/L。Zhu等人挖掘到新型的来源于P.ferrooxidans菌中编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因，实现了乳酰-N-四糖的高效生物合成，其产量达到25.49g/L。Li等人通过途径优化和辅因子再生工程，有效提升了乳酰-N-四糖的生物合成途径，其摇瓶产量达到6.16g/L，在5L发酵罐分批补料过程中，乳酰-N-四糖的产量达到了57.5g/L。目前，乳酰-N-四糖的生产过程中，涉及到两个不同的前体和多基因的调控，质粒系统能有效调节菌体内代谢通路的变化，但是质粒系统需要抗生素的维持，并且稳定性较差，存在丢失情况。因此，工程大肠杆菌基因组的多位点的基因整合是最有效的解决办法之一，保证菌株传代的稳定性。
发明内容
为了减少质粒系统的利用，本发明利用CRISPR相关的转座酶系统将编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA进行基因组多拷贝的整合，从而构建了不同拷贝数lgtA基因的工程大肠杆菌。再引入编码β-1,3-半乳糖基转移酶，构建完整的乳酰-N-四糖的生物合成途径，从而实现了乳酰-N-四糖(工程大肠杆菌生物合成乳酰-N-四糖代谢通路如图1所示)的高效稳定合成。
本发明提供了一种制备乳酰-N-三糖II的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacZ、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB；并在大肠杆菌的基因组上的recA位点整合来源于大肠杆菌K-12衍生菌MG1655的UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE，同时在大肠杆菌的基因组上的IS186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶lacZ在NCBI序列号为NP_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD在NCBI序列号为ACT43781.1、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB在NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB在NCBI序列号为NP_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。
在本发明的一种实施方式中，所述recA位点为：NCBI号为：NP_417179.1。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，在大肠杆菌基因组上的IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)和IS186-4位点(NCBI序列号为：GeneID:8180040)整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)、IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)，IS186-3位点(NCBI序列号为：Gene ID:8181786)和IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)，IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)，IS186-3位点(NCBI序列号为：Gene ID:8181786)，IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA。
本发明提供了一种制备乳酰-N-四糖大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌为，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacZ、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB；并在大肠杆菌的基因组上的recA位点整合来源于大肠杆菌K-12衍生菌MG1655的UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE，同时在大肠杆菌的基因组上的IS186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA，并过表达了来源于大肠杆菌O55:H7的β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶lacZ在NCBI序列号为NP_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD在NCBI序列号为ACT43781.1、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB在NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB在NCBI序列号为NP_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgO核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。
在本发明的一种实施方式中，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因(wbgO)克隆至pCDFDuet-1质粒载体多克隆位点上的NcoI位点和EcoRI位点之间。
在本发明的一种实施方式中，所述recA位点为：NCBI号为：NP_417179.1
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，在大肠杆菌基因组上的IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)和IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-2位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180306)、IS186-4位点(NCBI序列号为：GeneID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：GeneID:8180306)，IS186-3位点(NCBI序列号为：Gene ID:8181786)和IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶wbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：GeneID:8180306)，IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为，大肠杆菌BL21(DE3)敲除基因wecB，nagB，lacZ，ugD，在大肠杆菌基因组上的recA位点整合基因galE，分别在大肠杆菌基因组上的IS186-1位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180773)，IS186-2位点(NCBI序列号为：GeneID:8180306)，IS186-3位点(NCBI序列号为：Gene ID:8181786)，IS186-4位点(NCBI序列号为：Gene ID:8180040)和IS186-5位点(NCBI序列号为：Gene ID:8183431)整合基因lgtA，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
本发明提供了一种制备乳酰-N-三糖II的方法，所述方法为，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用上述制备乳酰-N-三糖II的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-N-三糖II。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源甘油的添加量为：20-30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述底物乳糖的添加量为：5-10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述生物合成的条件为：摇床转速为200rpm，温度由37℃降低为25℃。。
本发明提供了一种制备乳酰-N-四糖的方法，所述方法为，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用上述制备乳酰-N-四糖的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-N-四糖。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源甘油的添加量为：20-30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述底物乳糖的添加量为：5-10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述生物合成的条件为：摇床转速为200rpm，0.2mM的IPTG诱导后，温度由37℃降低为25℃。
本发明还提供了采用上述制备乳酰-N-三糖II的大肠杆菌基因工程菌在制备含有乳酰-N-三糖II的产品中的应用。
本发明还提供了采用上述制备乳酰-N-四糖的大肠杆菌基因工程菌在制备含有乳酰-N-四糖的产品中的应用。
有益效果
本发明通过CRISPR相关的转座酶系统实现了大肠杆菌基因组上多拷贝的lgtA基因整合，得到乳酰-N-三糖II生产的底盘菌株，其摇瓶产量可达到6.93g/L，该菌株无需添加额外的诱导剂，降低了生产成本和操作流程，该底盘菌株有较好的遗传稳定性和工业应用前景。再进一步引入含有编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgO的质粒表达系统，成功构建了多株生产乳酰-N-四糖的工程大肠杆菌，其摇瓶产量可达到6.07g/L，验证了该底盘菌株的扩展性，为进一步合成其他复杂母乳寡糖奠定了基础，具有良好的工业前景。
附图说明
图1为工程大肠杆菌生物合成乳酰-N-四糖代谢通路图。
图2为不同整合菌株发酵生产乳酰-N-三糖II的产量比较图。
图3为不同整合菌株发酵生产乳酰-N-四糖的产量比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明进一步阐述。
本发明所有使用的PCR扩增酶、质粒、DNA凝胶回收试剂盒和柱式质粒抽提盒等商业化产品，具体操作均按照试剂盒说明书进行。大肠杆菌感受态制备：TAKARA试剂盒；核酸琼脂糖凝胶电泳、水浴热激转化、电击转化、感受态细胞制备、菌落PCR和细菌基因组抽提等常规分子生物学实验操作根据Molecular Cloing：ALaboratory Manua(Fourth Edition)进行。构建质粒和PCR扩增产物的测序工作均由苏州安升达公司完成。
下述实施例中所涉及的pDonor、pTnsABC、pQCascade-IS186、pCutamp质粒购自杭州宝赛生物科技有限公司。
下述实施例中所涉及的质粒pET-lgtA的构建记载于公开号为CN111979168A的中国发明专利申请文本中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，15g/L琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨。
发酵培养基(Defined medium，DM)：20g/L甘油，1.7g/L柠檬酸，13.5g/L磷酸二氢钾，1.4g/L七水硫酸镁，4.0g/L磷酸氢二氨和10ml/L微量金属元素，再用氢氧化钠调节pH至6.8。
微量金属元素：2.25g/L七水硫酸锌，10g/L硫酸亚铁，0.35g/L一水硫酸锰，1.0g/L无水硫酸铜，0.23g/L十水硼酸钠，2.0g/L二水氯化钙，0.11g/L钼酸铵，溶于5M盐酸。
抗生素浓度：50mg/L卡那霉素，50mg/L安普霉素，50mg/L链霉素，200mg/L氨苄青霉素(固体培养基)，100mg/L氨苄青霉素(液体培养基)。
诱导剂浓度：在摇瓶发酵过程中，异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的添加终浓度为0.5mM。在CRISPR相关的转座酶系统，IPTG的添加终浓度为0.1mM和1mM(如果需要的话)，鼠李糖的添加终浓度为10mM，蔗糖的添加终浓度为10g/L。
下述实施例中所涉及的菌株培养及发酵如下：
在发酵过程中，在相应的LB固体平板上，挑取菌落形态正常的单菌落至4mL试管LB培养液体中(含有对应的抗生素)，培养10-12h后，将试管中的种子液以2％(v/v)的接种量转接到20mL摇瓶DM培养基中，培养条件为37℃，200rpm。当菌体生长密度达到0.6-0.8时，添加终浓度为0.5mM的IPTG和/或5g/L的乳糖，发酵温度调整至25℃。发酵时长达到96h后，取发酵液并制备样品，进行产物的检测。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
乳酰-N-四糖的产量检测
将所取发酵液，以12000g的离心速度离心10分钟，再将上清液稀释一定倍数，后通过0.22μm水系针筒式过滤器，将样品用高效液相色谱仪(沃特世公司)进行检测，检测条件为Rezex ROA有机酸柱和示差检测器，流动相为5mM硫酸，柱温为60℃，进样量为10μL。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。
表1：引物序列及靶向质粒信息
Figure BDA0004104403390000071
下述实施例中所涉及的PCR反应体系如表2所示。
表2：PCR体系
Figure BDA0004104403390000072
PCR反应体系条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2kb/min；32个循环，4℃保存，PCR产物进行胶回收。
下述实施例中所涉及的吉布森组装反应体系如表3所示。
表3：吉布森组装反应体系
Figure BDA0004104403390000081
吉布森组装反应条件：50℃，30min。
X/Y根据公式计算可得到线性化载体用量和插入片段的用量：
X＝(0.02×克隆载体碱基对数/胶回收对应DNA片段浓度)ng；
Y＝(0.02×插入片段碱基对数/胶回收对应DNA片段浓度)ng；
下述实施例中所涉及的重叠延伸PCR体系如表4所示。
表4：重叠延伸PCR体系
Figure BDA0004104403390000082
重叠延伸PCR反应体系条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2kb/min；32个循环，4℃保存，取部分的PCR产物进行核酸电泳验证，后利用去甲基化酶DPN1进行酶切去除模板质粒，再进行转化验证。
实施例1：底盘细胞的构建
(1)基因galE基因组单位点整合操作流程如下：
以公开号CN111979168A记录的重组菌株EWNL(敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中wecB，nagB，和lacZ基因得到的)为出发菌株，pTargetF和pCas9质粒保藏于实验室，使用引物对GalE-N20-F/R对pTarget-F质粒进行PCR扩增，得到靶向目标位点的pTarget质粒；
使用引物GalE-T-F/R、GalE-UP-F/R、GalE-Down-F/R和GalE-T-V-F/R通过PCR分别扩增出galE基因，即其上下游同源臂和pTarger载体片段；
将扩增出来的四个片段通过吉布森组装试剂盒进行组装，从而构建用于整合基因的质粒pTarget-galE；
通过电击转化的方式将pCas质粒转入出发宿主EWNL中，并加入30mM的阿拉伯糖以诱导λ-Red重组酶系统的表达；
将pTarget-galE质粒电转进入上述含pCas的大肠杆菌中，后涂布于含有壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃培养15～24h，对平板上的单菌落进行菌落PCR验证；
菌落PCR验证成功后，再送样测序验证相关基因组的整合基因是否完整，相关测序工作由苏州安升达公司负责；
将验证成功的单菌落转接至4mL的LB液体试管中，并添加0.1mM的IPTG，以诱导去除pTarget质粒，摇床过夜后，取部分菌液划线培养过夜，后再验证是否去除pTarget质粒；
选取去除pTarget质粒成功的单菌落接种至无抗的LB液体试管中，42℃，200rpm过夜培养，取部分菌液划线至无抗的LB固体板上，后挑取单菌落验证是否去除pCas质粒，验证成功为重组大肠杆菌EWNL/ΔrecA::Ptac-galE，即EP0。
(2)基因ugD基因组敲除操作流程如下：
敲除基因的操作流程与整合基因的操作流程相同，但构建质粒pTarget时，敲除质粒pTargrt-F是由三部分扩增DNA片段组成：线性化载体，敲除基因上游同源臂和敲除基因下游同源臂，其余实验操作参考整合基因操作流程，相关引物和靶向质粒信息见表1，即：
按照步骤(1)的方法敲除菌株EP0的ugD基因，构建得到底盘菌株EWNL/ΔugDΔrecA::Ptac-galE，命名为EP1。
实施例2：基因组多拷贝基因lgtA的工程大肠杆菌的构建
(1)使用引物pD-lgtA-V-F/R对pDonor质粒进行特异性扩增，得到质粒载体片段1；
(2)使用引物pD-lgtA-F/R对质粒载体pET-lgtA进行特异性扩增，得到质粒目的基因片段2(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
(3)通过吉布森组装试剂盒将片段1和片段2进行组装，从而构建用于多拷贝基因整合的质粒pDonor-lgtA；
(4)分别将重组质粒pDonor-lgtA和pTnsABC电转化至底盘菌株EP1中，涂布于含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养12-14h；
(5)挑取步骤(4)得到的阳性转化子，制备成电转感受态细胞后，继续电转化pQCascade-IS186质粒后，涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的LB固体平板，37℃培养12-14h；
(6)将步骤(5)平板上的阳性转化子用无菌LB液体进行重悬，后全部涂布至终浓度为0.1mM IPTG、卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的LB固体平板，IPTG用以诱导转座酶的表达，培养条件为37℃，16h；
(7)将步骤(6)平板上的阳性转化子，用无菌LB稀释一定的倍数，将稀释的菌液在终浓度为1mM IPTG、卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的LB固体平板进行涂布，IPTG用以诱导转座酶的表达，培养条件为37℃，24h；
(8)为了提高基因组的基因拷贝数，可以重复划线延长转座时间，将步骤(7)平板上的阳性转化子，用无菌LB液体适当稀释和重悬后，在新的含有终浓度为1mM IPTG、卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素的LB固体平板进行划线，分离出单菌落；
(9)通过菌落PCR，对步骤(7)和步骤(8)平板上的阳性转化子进行基因拷贝数验证，从而得到不同拷贝数基因lgtA的工程大肠杆菌：
利用引物对YZ-lgtA-F与YZ-IS186-1-R/YZ-IS186-2-R/YZ-IS186-3-R/YZ-IS186-4-R/YZ-IS186-5-R，对同一颗阳性转化子进行菌落PCR验证，根据不同引物对核酸电泳条带情况，判断基因lgtA的具体整合位点情况。例如，当使用上述5对引物进行扩增后，仅有引物对YZ-lgtA-F和YZ-IS186-4-R扩增核酸电泳结果，其余引物对扩增无条带，仅显示有一条电泳条带。
结果表明，得到了在IS186-4位点整合lgtA基因的重组大肠杆菌EP1/IS186-4-lgtA，拷贝数为：1，其他不同拷贝数lgtA基因菌株的构建类似本例所述，详细整合位点和拷贝数数目见表5；
(10)步骤(9)中单菌落验证成功后，再对基因组的整合基因进行测序，相关测序工作由苏州安升达公司负责；
(11)上述系统的三个质粒pDonor、pTnsABC、pQCascade-IS186去除需要通过质粒pCutamp进行质粒去除，从而获得无质粒的大肠杆菌菌株；将上述步骤(10)制备得到的整合宿主制备成电转感受态，电转化质粒pCutamp，活化后涂布至含安普霉素和10mM鼠李糖的LB固体培养基，培养条件为37℃过夜。
(12)选取步骤(11)平板的单颗阳性转化子，分别划线于含有卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素单一抗生素的LB固体平板上，同时划线于含有10g/L的蔗糖的LB固体平板上，筛选出无pDonor-lgtA，pTnsABC和pQCascade-IS186的单菌落，并同时去除质粒pCutamp；
(13)验证步骤(12)所得到的单菌落，划线于含安普霉素的LB固体平板，即得到无质粒的工程大肠杆菌EP1/IS186-4-lgtA(EWNL/ΔugDΔrecA::Ptac-galE-IS186-4-lgtA)，拷贝数为：1，命名为EP01。
实施例3：基因工程菌EP02、EP03、EP04、EP05、EP06、EP07、EP08、EP09、EP10、EP11、EP12的构建
具体步骤如下：
1、基因工程菌EP02、EP03、EP04、EP05和EP06的构建
如上述实施例1～2所述，基因工程菌EP02、EP03、EP04、EP05和EP06的构建与基因工程菌EP01相同，根据上述5对引物对扩增的核酸电泳条带数和测序结果判断lgtA基因拷贝数目，得到不同lgtA基因拷贝数基因工程菌株。
分别制备得到EP01(EP1/IS186-4-lgtA)、EP02(EP1/IS186-4-lgtA-IS186-2-lgtA)、EP03(EP1/IS186-4-lgtA-IS186-2-lgtA-IS186-5-lgtA)、EP04(EP1/IS186-1-lgtA-IS186-2-lgtA-IS186-3-lgtA-IS186-4-lgtA)、EP05(EP1/IS186-1-lgtA-IS186-2-lgtA-IS186-4-lgtA-IS186-5-lgtA)和EP06(EP1/IS186-1-lgtA-IS186-2-lgtA-IS186-3-lgtA-IS186-4-lgtA-IS186-5-lgtA)。
2、基因工程菌EP07、EP08、EP09、EP10、EP11和EP12的构建
(1)重组质粒的构建
具体步骤如下，相关引物见表1，相关PCR体系见表2，吉布森组装体系见表3，重叠延伸PCR体系见表4：
利用引物HP-wbgO-F/R，对模板质粒pCD-wbgO-galE(构建方法公开于公开号为CN113652385A的专利中)，进行重叠延伸PCR，后将所得PCR产物转化至DH5α中，涂布至对应抗性的LB平板37℃过夜培养，后挑取单菌落并抽质粒进行Sanger测序，测序成功即完成重组质粒pCD-wbgO的构建。
将重组质粒pCD-wbgO分别导入基因工程菌EP01、EP02、EP03、EP04、EP05和EP06得到相应重组菌株，其中重组质粒pCD-wbgO的构建见下述实施例3；制备得到的菌株如下表5所示。
表5：不同菌株的构建
Figure BDA0004104403390000111
Figure BDA0004104403390000121
实施例4：制备乳酰-N-三糖II
具体步骤如下：
分别将转化的单菌落EP01～EP06挑取至含有4mL LB的试管中，在37℃和200rpm摇床条件下，分别进行培养10-12h，制备得到种子液；
分别将上述种子液以2％(v/v)的接种量接种至含有20mL DM培养基的250mL三角瓶中，在37℃和200rpm摇床条件下进行培养，当菌体密度OD600达到0.6-0.8，摇床温度由37℃降低为25℃，并且添加乳糖，摇床转速为200rpm，乳糖的终浓度为5g/L，摇瓶发酵时长为96h，进行取样测量菌体OD600，不同菌株的OD600及反应结果见表6及图2所示。
表6：不同工程大肠杆菌摇瓶发酵详细信息
Figure BDA0004104403390000122
结果显示：随着大肠杆菌基因组上基因lgtA的拷贝数增加，乳酰-N-三糖II的产量逐渐增加，并且在拷贝数达到4时，产量达到最大值即6.93g/L，进一步增加基因lgtA的拷贝数，无法进一步提升产量，前体物质供应、底物利用和限速酶转化等因素影响了产量进一步提升，表明在IS186-1，IS186-2，IS186-4和IS186-5位点整合基因lgtA能有效实现乳酰-N-三糖II的合成。
实施例5：制备乳酰-N-四糖
具体步骤如下：
分别将转化的单菌落EP07～EP12挑取至含有4mL LB的试管中，在37℃和200rpm摇床条件下，分别进行培养10-12h，制备得到种子液；
分别将上述种子液以2％(v/v)的接种量接种至含有20mL的DM培养基的250mL三角瓶中，在37℃和200rpm摇床条件下进行培养，当菌体密度OD600达到0.6-0.8，摇床温度由37℃降低为25℃，并且添加IPTG和乳糖，摇床转速为200rpm，诱导剂IPTG终浓度为0.2mM，乳糖的终浓度为5g/L，摇瓶发酵时长为96h，进行取样测量菌体OD600，不同菌株的OD600及反应结果见表7及图3所示。
表7：不同工程大肠杆菌摇瓶发酵详细信息
Figure BDA0004104403390000131
Figure BDA0004104403390000141
结果显示：随着大肠杆菌基因组上基因lgtA的拷贝数增加，乳酰-N-四糖的产量逐渐增加，并且乳酰-N-三糖II残留量较少，并且在拷贝数达到4时，乳酰-N-四糖产量达到最大值即6.07g/L，进一步增加基因lgtA的拷贝数，无法进一步提升产量。多个前体物质供应平衡、底物利用和多步限速酶转化等多个因素影响了产量进一步提升，表明在IS186-1，IS186-2，IS186-4和IS186-5位点整合基因lgtA能有效实现乳酰-N-四糖的合成。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备乳酰-N-三糖II的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacZ、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB；并在大肠杆菌的基因组上的recA位点整合来源于大肠杆菌K-12衍生菌MG1655的UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE，同时在大肠杆菌的基因组上的IS186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶lacZ在NCBI序列号为NP_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD在NCBI序列号为ACT43781.1、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB在NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB在NCBI序列号为NP_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。
4.一种制备乳酰-N-四糖大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，敲除大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶lacZ、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB；并在大肠杆菌的基因组上的recA位点整合来源于大肠杆菌K-12衍生菌MG1655的UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE，同时在大肠杆菌的基因组上的IS186位点整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA，并过表达了来源于大肠杆菌O55:H7的β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶lacZ在NCBI序列号为NP_414878.1，二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶ugD在NCBI序列号为ACT43781.1、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶wecB在NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶nagB在NCBI序列号为NP_415204.1；所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述UDP-葡萄糖4差向异构酶基因galE核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述编码β-1,3-半乳糖基转移酶的基因wbgO核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgtA在大肠杆菌基因组上整合的拷贝数分为单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝和五拷贝。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，采用pCDFDuet-1质粒表达β-1,3-半乳糖基转移酶WbgO。
8.一种制备乳酰-N-三糖II的方法，其特征在于，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用权利要求1～3任一所述的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-N-三糖II。
9.一种制备乳酰-N-四糖的方法，其特征在于，是以甘油为碳源，以乳糖为底物，采用权利要求4～7任一所述的大肠杆菌基因工程菌，生物合成乳酰-N-四糖。
10.权利要求1～7任一所述的大肠杆菌基因工程菌在制备含有乳酰-N-三糖II或乳酰-N-四糖的产品中的应用。
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