CN110964685B

CN110964685B - 一种蛋白质因子rrf编码基因及其在n-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用

Info

Publication number: CN110964685B
Application number: CN201911358383.9A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 邓琛; 卢健行; 刘长峰; 卢建功; 李江华; 堵国成; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110964685A

Abstract

本发明涉及一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。该重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。本发明的重组谷氨酸棒杆菌提高了乙酰氨基葡萄糖的产量，产量达到26.9g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用

技术领域

本发明涉及代谢工程领域，尤其涉及一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌是放线菌门中高GC含量的革兰氏阳性土壤细菌，已被用于氨基酸的工业生产，并被设计用于生产各种化合物，包括聚合物结构单元和生物燃料。自其基因组序列首次发表以来，其多功能代谢途径及其遗传成分和调控机制已得到广泛研究。为了提高生物技术生产的效率，基于基因组序列信息开发了遗传工具和基于组学的分析方法，包括转录组学，蛋白质组学，代谢组学和流变学，并广泛用于了解代谢途径及其在转录后的调控。

在以往的研究中，相对于基因调控的探索往往在转录水平，经过理论体系不断的优化、研究的深入，逐渐对翻译过程也重视起来。经过不断摸索研究，己经发现多种不同的蛋白因子参与了原核细胞翻译起始延长以及终止的进程。其中一个很重要的蛋白质是核糖体循环因子RRF(ribosome recycling factor)，它可以促进终止核糖体复合物拆开，从而使得翻译过程结束，RRF表达的增多会促进生长后期的蛋白合成以及部分代谢产物的增加。文献“代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸，2015年，赵建勋”公开了RRF促进谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸合成，同时申请号为201410726700.9的中国专利公开了一株产L-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用，其公开了扩增基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk以提高谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸产量。但上述文献均未公开过表达RRF可提高谷氨酸棒状杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖产量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用，本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达frr基因，从而过表达核糖体循环因子RRF，而得到了N-乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌。

本发明的技术方案如下：

本发明的一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过在出发菌谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。

进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。

进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA为出发菌株，在其基础上敲除了L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到。其中，L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI-Gene ID:1020853所示。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN 110195036A。通过敲除编码催化由丙酮酸形成乳酸的L-乳酸脱氢酶的ldh基因，来阻断宿主菌谷氨酸棒杆菌合成副产物乳酸的途径。

进一步地，核糖体循环因子RRF的编码基因为frr，frr的基因序列如NCBI-GeneID:1019979所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，frr基因所编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。

frr基因编码的RRF是一种核糖体循环因子，在原核生物翻译终止阶段促进核糖体复合物拆开，并可以有效避免整个翻译过程中产生错误的多功能蛋白。通过将frr基因与GlcNAc合成途径的关键基因GNA1以及glmS共表达，促进了对应的酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶以及氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达，从而提高了谷氨酸棒杆菌生产GlcNAc的能力。

进一步地，核糖体循环因子RRF的编码基因通过表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS表达。表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS具体构建过程参见文献——Chen Deng,XueqinLv,Yanfeng Liu,Long Liu.Metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum S9114based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosaminesynthesis.Synthetic and Systems Biotechnology,2019.4:120-129。

本发明还提供了一种上述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：

将pJYW-4-ceN-C.glglmS-frr表达载体转入宿主菌，得到所述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌。

进一步地，宿主菌为敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌。

进一步地，宿主菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh，其构建方法包括以下步骤：

利用乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA的基因敲除框、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA的基因敲除框和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框依次敲除谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114中的乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。

谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA为出发菌株，在其基础上敲除了L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN110195036A。在此基础上，继续构建L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框，经同源重组，用ldh的基因敲除框中的卡那霉素抗性基因kana代替组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh。

更具体地，pJYW-4-ceN-C.glglmS-frr表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF的构建方法，步骤如下：

(1)按照S9114基因组设计扩增引物扩增RRF

上游引物FragmentRRF.FOR：

5’——ACCGTCGAATAATATAAACAGCGTGGCTTATCTAGGTTCG——3’；

下游引物FragmentRRF.REV：

5’——CCTTTGCTAGTCTAGACCTCCATCAGTTCCTTTTCCT——3’；

同时设计载体pJYW-4-ceN-C.glglmS线性化引物：

上游引物VectorRRF.FOR：

5’——TGGAGGTCTAGACTAGCAAAGGAGAAGAAAAGCCG——3’；

下游引物VectorRRF.REV：

5’——ACGCTGTTTATATTATTCGACGGTGACAGACTTTGC——3’；

(2)将PCR得到的线性化载体以及带有载体同源性末端的目的基因片段胶回收后以3：1的摩尔比采用快速克隆试剂盒进行连接，构建重组表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF。

进一步地，在步骤(2)中，快速克隆试剂为诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit。

本发明还公开了上述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

进一步地，采用摇瓶法发酵培养生产N-乙酰氨基葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，将28～30℃,220rpm下培养16h的重组谷氨酸棒杆菌种子液以使得发酵培养基的初始OD₅₆₂为1.6的接种量转入发酵培养基，于28～30℃，220rpm条件下培养72～100h。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了能提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌株的构建方法，在敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌中，利用PCR扩增谷氨酸棒杆菌核糖体循环因子RRF编码基因，将该基因连接在谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS，影响细胞内碳代谢分布，提高了N-乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达26.9g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为pJYW-4-ceN-C.glglmS质粒图谱；

图2为重组pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF质粒图谱；

图3为不同菌株摇瓶发酵上清液中GlcNAc的产量图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

(一)本发明以下实施例中，N-乙酰氨基葡萄糖的测定方法如下：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相:5mM H₂S0₄，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

(二)本发明以下实施例中，所使用的培养基如下：

种子活化培养基液体(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0,葡萄糖5.0，装液量20mL每250mL三角瓶。

种子活化培养基固体(LBG固体)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0,葡萄糖5.0，营养琼脂15.0-20.0。

感受态培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0,甘氨酸30.0，异烟肼4.0，同时加入10mL的Tween80，装液量50mL每500mL三角瓶。

电击转化后恢复培养基LBHIS(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0。

转化子检出培养基固体(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0,营养琼脂15.0-20.0。

种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0,玉米浆20.0，KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，尿素1.25，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40.0，玉米浆20.0,KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 20.0，MgSO40.5，CaCO₃ 20.0,pH 7.0。

优化发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆10.0,KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 20.0，MgSO40.5，CaCO₃ 20.0,FeSO₄ 0.18,pH 7.0。

灭菌条件：115℃，20min,所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25mg/L硫卡那霉素。

实施例1敲除L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)

根据NCBI上公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)上下游序列，设计敲除同源臂扩增引物，左臂上、下游引物分别为LdhloxPUF(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和LdhloxPUR(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；右臂上、下游引物分别为LdhloxPDF(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和LdhloxPDR(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；分别以谷氨酸棒杆菌S9114菌株基因组DNA为模板，通过PCR将左臂和右臂扩增下来。

根据质粒pDTW-202(由江南大学王小元博士提供)上loxp-kana-loxp基因的核苷酸系列设计引物KanloxpldhF(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和KanloxpldhR(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，以质粒pDTW-202为模板将loxp-kana-loxp基因扩增loxp基因和卡那霉素抗性基因。通过酶切连接的方法，用快切酶XhoI/XbaI酶切2小时后的左臂、用快切酶XbaI/BamHI酶切2小时后的loxp-kana-loxp基因片段、用快切酶BamHI/EcoRI酶切2小时的右臂、用快切酶XhoI/EcoRI酶切2小时的质粒pBluescriptIISK(+)(由江南大学王小元博士提供)用T4连接酶于16℃过夜连接。

将构建好的带有ldh敲除框的pBluescriptIISK(+)连接体系转化E.coli JM109感受态细胞(感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒说明书；货号：9128)，挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pBluescriptIISK(+)-ldh。提取重组质粒pBluescriptIISK(+)-ldh电转化谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-GamA，通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认敲除框左右臂均结合到S9114基因组上，确认L-乳酸脱氢酶编码基因ldh敲除，得到谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-GamA-Δldh，经过72h后该菌株的GlcNAc产量为24.7g/L。

实施例2重组质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF的构建及重组谷氨酸棒杆菌的构建

(1)按照S9114基因组设计扩增引物扩增RRF

上游引物FragmentRRF.FOR：

5’——ACCGTCGAATAATATAAACAGCGTGGCTTATCTAGGTTCG——3’；

下游引物FragmentRRF.REV：

5’——CCTTTGCTAGTCTAGACCTCCATCAGTTCCTTTTCCT——3’；

同时设计载体pJYW-4-ceN-C.glglmS线性化引物

上游引物VectorRRF.FOR：

5’——TGGAGGTCTAGACTAGCAAAGGAGAAGAAAAGCCG——3’；

下游引物VectorRRF.REV：

5’——ACGCTGTTTATATTATTCGACGGTGACAGACTTTGC——3’；

使用引物FragmentRRF.FOR和FragmentRRF.REV，以谷氨酸棒杆菌S9114为模板，PCR条件为：95℃预变性10min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min，反应30个循环；最后72℃延伸l0min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。将frr基因从谷氨酸棒杆菌S9114基因组上扩增下来，使用LA Taq HS DNA聚合酶扩增frr基因。

使用质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS作为表达载体来表达frr基因，pJYW-4-ceN-C.glglmS质粒的具体构建过程参见文献——Chen Deng,XueqinLv,Yanfeng Liu,LongLiu.Metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum S9114 based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis.Synthetic andSystems Biotechnology,2019.4:120-129.

使用引物VectorRRF.FOR和VectorRRF.REV，以提取的质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS为模板，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸5min，反应30个循环；最后72℃延伸l0min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得线性化的质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS。

(2)采用诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit快速克隆试剂盒进行连接，PCR得到的线性化载体以及带有载体同源性末端的目的基因片段胶回收后以3：1的摩尔比混合，同时加入5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，然后加入ddH₂O使得连接体系总体积达到20μL，37℃反应30min，降低至4℃保温。然后取10μL连接体系转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞(感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒说明书)。挑选菌落PCR正确的转化子，然后送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，得到重组表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF。

将质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF通过电击转化法转化到谷氨酸棒杆菌S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh菌株中。

谷氨酸棒杆菌电转感受态的制备：

(1)C.glutamicum接种于LBG培养基(需要新鲜培养的斜面上进行挑选，否则会影响菌体的生长)，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养16h,OD₅₆₂达到3.0。

(2)10％转接入感受态培养基中OD₅₆₂达到0.3，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养至OD₅₆₂达到0.9(培养约3-5h，处于对数生长期即可，一般如果菌浓的持续较低约0.6左右也可以继续后续操作)。需要保证菌体浓度尽量要浓，一般浓缩倍数为100倍(50mL感受态培养基浓缩至0.5mL制备5管感受态细胞)。

(3)菌液冰水浴15min,4,000rpm,4℃离心10min，小心的弃去上清。

(4)用30mL预冷10％甘油充分悬浮菌体，4,000rpm，4℃离心10min，小心的弃去上清，重复洗涤四次。

(5)用500μL预冷10％甘油重悬细胞(浓缩100倍)，1.5mL无菌离心管分装，每管100μL。

(6)-80℃保存待用，为保证感受态的转化效率最好现用现做，不能放置超过1周，否则由于感受态细胞裂解细胞内容物释放，在后续电击转化过程中造成电转杯的击穿，同时影响转化效率。

谷氨酸棒杆菌的电击转化：

(1)-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态，冰浴中融化。

(2)加入1-5.0μL质粒混匀(DNA总量约为1.0μg)，冰浴5-10min。

(3)加入于预冷的0.1cm电击杯中，1.8KV电压5ms电击2次。

(4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBWS)1.0mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后放入冰浴中。

(5)将菌体置于巡回式摇床(100rpm)上，30℃后培养2h。

(6)6,000rpm，常温离心1min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。

(7)感受态效率验证:加入5.0μL无菌ddH₂O作为阴性对照，无菌落，阳性对照加入1-5μL质粒pXMJl9(DNA总量约为1.0μg)，长出大量菌落，测序正确的即为重组谷氨酸棒杆菌。

实施例3重组谷氨酸棒杆菌中过量表达frr基因对N-乙酰氨基葡萄糖产量的影响

将测序结果正确的含有将质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF的重组谷氨酸棒杆菌菌株于甘油管接种划线LBG平板(添加硫卡那霉素25mg/L),30℃下220rpm培养18h后再挑选单菌落重新划线LBG平板直至长出大量菌落。

接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养16至18h至细胞生长对数前期。

按10％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃220rpm培养72h。测量GlcNAc生成量。

以含有质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS的重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵，72h后GlcNAc产量为24.7g/L(图3中CK)，而过量表达frr基因的质粒pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF的重组菌株72h GlcNAc产量为26.9g/L(图3中RRF)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学；山东润德生物科技有限公司

<120> 一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 945

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 1

atgaaagaaa ccgtcggtaa caagattgtc ctcattggcg caggagatgt tggagttgca 60

tacgcatacg cactgatcaa ccagggcatg gcagatcacc ttgcgatcat cgacatcgat 120

gaaaagaaac tcgaaggcaa cgtcatggac ttaaaccatg gtgttgtgtg ggccgattcc 180

cgcacccgcg tcaccaaggg cacctacgct gactgcgaag acgcagccat ggttgtcatt 240

tgtgccggcg cagcccaaaa gccaggcgag acccgcctcc agctggtgga caaaaacgtc 300

aagattatga aatccatcgt cggcgatgtc atggacagcg gattcgacgg catcttcctc 360

gtggcgtcca acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa 420

tggaaccgcg tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctcgattccg ctacatgctg 480

ggcgaactct acgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacggc 540

gacactgaac ttccagtcct gtcctccgcg accatcgcag gcgtatcgct tagccgaatg 600

ctggacaaag acccagagct tgagggccgt ctagagaaaa ttttcgaaga cacccgcgac 660

gctgcctatc acattatcga cgccaagggc tccacttcct acggcatcgg catgggtctt 720

gctcgcatca cccgcgcaat cctgcagaac caagacgttg cagtcccagt ctctgcactg 780

ctccacggtg aatacggtga ggaagacatc tacatcggca ccccagctgt ggtgaaccgc 840

cgaggcatcc gccgcgttgt cgaactagaa atcaccgacc acgagatgga acgcttcaag 900

cattccgcaa ataccctgcg cgaaattcag aagcagttct tctaa 945

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 2

atctcgagtt cgccggtgcg tacttttggt ccg 33

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 3

atggatcctc acccgcgcaa tcctacaaaa ccaagac 37

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 4

acctctagat gttgtcggga ggcccacgca aag 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 5

ccggaattca agcaatgctg tggcgcagct c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 6

acggatccgc gcaattaacc ctcactaaag 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> (人工序列）

<400> 7

acctctagaa atacgactca ctatagggcg 30

<210> 8

<211> 558

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 8

atgattgatg aaattctgtt cgaagcggaa gagcgcatga ccgcaacggt cgagcacacc 60

cgcgaagact tgaccaccat tcgtaccggt cgcgcaaacc cggctatgtt caacggtgtc 120

atggctgaat actacggcgt gcctactcct attactcaga tgtcaagcat ctctgttcca 180

gagcctcgca tgctgctgat caagccttat gagatgtctt ctatgcaggt cattgagaat 240

gctatccgta actctgacct tggtgttaac cccaccaacg atggccaggt gctgcgtgtg 300

accatcccac agctcactga agagcgtcgt aaggacatgg tcaagcttgc taagggtaag 360

ggcgaagacg gcaagattgc cattcgtaac atccgccgca agggcatgga ccagctaaag 420

aagctgcaaa aagatggcga cgctggcgaa gatgaagtac aggcagcaga aaaagaacta 480

gataaagtca ccgctggttt tgttgcgcag gtcgatgaag tcgttgctcg caaggaaaag 540

gaactgatgg aggtctag 558

<210> 9

<211> 185

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 9

Met Ile Asp Glu Ile Leu Phe Glu Ala Glu Glu Arg Met Thr Ala Thr

1 5 10 15

Val Glu His Thr Arg Glu Asp Leu Thr Thr Ile Arg Thr Gly Arg Ala

20 25 30

Asn Pro Ala Met Phe Asn Gly Val Met Ala Glu Tyr Tyr Gly Val Pro

35 40 45

Thr Pro Ile Thr Gln Met Ser Ser Ile Ser Val Pro Glu Pro Arg Met

50 55 60

Leu Leu Ile Lys Pro Tyr Glu Met Ser Ser Met Gln Val Ile Glu Asn

65 70 75 80

Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Gln

85 90 95

Val Leu Arg Val Thr Ile Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Lys Asp

100 105 110

Met Val Lys Leu Ala Lys Gly Lys Gly Glu Asp Gly Lys Ile Ala Ile

115 120 125

Arg Asn Ile Arg Arg Lys Gly Met Asp Gln Leu Lys Lys Leu Gln Lys

130 135 140

Asp Gly Asp Ala Gly Glu Asp Glu Val Gln Ala Ala Glu Lys Glu Leu

145 150 155 160

Asp Lys Val Thr Ala Gly Phe Val Ala Gln Val Asp Glu Val Val Ala

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Glu Leu Met Glu Val

180 185

Claims

1.一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到；所述核糖体循环因子RRF的编码基因为frr，frr的基因序列如NCBI- GeneID: 1019979所示，frr的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，frr基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh；所述L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI- Gene ID: 1020853所示。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述核糖体循环因子RRF的编码基因通过表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS表达。

3.一种权利要求1-2中任一项所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将pJYW-4-ceN-C.glglmS-frr表达载体转入宿主菌，得到所述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌；所述宿主菌为敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌；

所述宿主菌为谷氨酸棒杆菌C. glutamicum S9114 ΔnagA-ΔgamA-Δldh，其构建方法包括以下步骤：

利用乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA的基因敲除框、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA的基因敲除框和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框依次敲除谷氨酸棒杆菌C. glutamicum S9114中的乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh；所述L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI- Gene ID: 1020853所示。

4.权利要求1-2中任一项所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：采用摇瓶法培养生产N-乙酰氨基葡萄糖。