CN114806995B

CN114806995B - 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用

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Publication number: CN114806995B
Application number: CN202210631190.1A
Authority: CN
Inventors: 张山; 甘淼; 陈永丽; 丁利平
Original assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN114806995A

Abstract

本发明公开了一种基于乙酰辅酶A代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用，属于代谢工程领域。本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，通过对其代谢通路进行改造，提高了乙酰辅酶A的补给，从而提升了利用EctABC基因簇合成四氢嘧啶的产量。具体是将谷氨酸棒杆菌中的编码磷酸乙酰转移酶、乙酰辅酶A酰基转移酶、PRPP结合酶基因中的一个或多个敲除，并整合来源于酿酒酵母的腺苷激酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶，并同时表达EctABC基因簇。构建得到的基因工程菌在50L发酵罐条件中发酵，四氢嘧啶产量可达到66.3g/L。

Description

一种基于乙酰辅酶A代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用

技术领域

本发明涉及一种基于乙酰辅酶A代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用，具体涉及一种采用代谢工程手段构建高产四氢嘧啶的基因工程菌并用于四氢嘧啶生物合成的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoine，ECT)又名依克多因，发现于极端微生物嗜盐菌中，是一种氨基酸衍生物，其对渗透压有调节作用，常作为渗透压补偿性溶质存在于耐盐菌中。四氢嘧啶可以提高细胞的抗逆性，对细胞起到保护作用，也可以稳定生物体内酶的蛋白结构，具有优异的抗炎、防晒、保湿功能，是高档化妆品中常见的生物制剂之一。

由于四氢嘧啶结构的特殊性，化学合成法的后续分离成本过高，因此，常采用生物发酵法合成。传统的四氢嘧啶生物发酵法，采用的是“细菌挤奶”法，即野生的或经过筛选的嗜盐微生物在高盐、高渗环境下合成目的产物，然后在低盐、低渗环境下提取四氢嘧啶的方法。在C.Fallet等人采用Chromohalobacter salexigens发酵生产四氢嘧啶，可以达到2.1g·L^-1·h^-1的产能(Process Optimization of the Integrated Synthesis andSecretion of Ectoine and Hydroxyectoine Under Hyper/Hypo-Osmotic Stress，公开于2010年)。但是这种方法具有盐浓度高、不连续生产的缺点，会造成设备腐蚀、生产纯化工艺复杂等问题。

因此，近些年来，科学家们将来自嗜盐菌的ECT合成基因转入工程菌中，希望在相对低盐条件下连续生产四氢嘧啶。南京众惠将延长盐单胞菌中的ectABC基因转入大肠杆菌中，在低盐培养基中，采用L-天冬氨酸钠为底物，在摇瓶发酵体系中发酵生产四氢嘧啶，24h后每克菌体含1.1g四氢嘧啶(专利公开号：CN104560844A)。中科院微生物所Yong-Zhi He等采用全细胞催化的方式，以天冬氨酸和甘油为底物，在大肠杆菌中生产四氢嘧啶，24h后四氢嘧啶产量达到25.1g·L^-1(High production of ectoine from aspartate andglycerol by use of whole-cell biocatalysis in recombinant Escherichia coli，公开于2015年)。清华大学将ectABC基因簇转入谷氨酸棒状杆菌中，以葡萄糖为底物生产四氢嘧啶，在5L发酵罐体系中发酵72h后四氢嘧啶产量达到12g·L^-1(专利公开号：CN107142234A)。无锡晶扬将ectABC基因簇转入谷氨酸棒状杆菌中，并对宿主菌代谢通路进行改造，以葡萄糖为底物产四氢嘧啶，在2.5L发酵罐体系中发酵60h后四氢嘧啶产量达到41.7g·L^-1(专利公开号：CN110699310A)。

目前，对比“细菌挤奶”法，采用基因工程菌发酵生产四氢嘧啶的方法解决了生产过程中高盐环境对设备腐蚀的问题，可以补料分批生产，极大简化了生产、纯化工艺。但是，对比大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌不生产内毒素，是食品安全级工程菌，但是在直接应用至四氢嘧啶发酵生产时，生产效率相对较低。如何进一步提高四氢嘧啶的产量，是本领域中仍需要解决的问题。

发明内容

本发明采用代谢工程手段，对谷氨酸棒状杆菌中，四氢嘧啶的合成相关底物的补给进行调整，使宿主菌更适合生产四氢嘧啶，在使用食品安全级菌种的前提下，提高基因工程菌单位时间内四氢嘧啶产量。

本发明以谷氨酸棒状杆菌为原始菌株，改造其代谢通路。敲除其磷酸乙酰转移酶Pho cgl2753(GenBank:BAC00147.1)对应的编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶Aat cgl2392(GenBank:BAB99785.1)对应的编码基因和/或PRPP结合酶PRPP cgl1654(GenBank:BAB99047.1)对应的编码基因，上述三个基因的敲除，可提高乙酰辅酶A的补给，如图1所示，乙酰辅酶A是EctABC基因簇合成四氢嘧啶所需的重要底物。过表达酿酒酵母来源的腺苷激酶ask为EC 2.7.1.20(GenBank:AAS56408.1)，增强了AMP的合成，过表达酿酒酵母来源的腺苷酸激酶alk为EC 2.7.4.3(GenBank:AAS56894.1)和核苷二磷酸激酶ndk为EC 2.7.4.6(GenBank:AAS56589.1)，增强了ATP的补给。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除宿主细胞中编码PRPP结合酶、乙酰辅酶A酰基转移酶和/或磷酸乙酰转移酶的基因中的一种或多种，过表达酿酒酵母来源的腺苷激酶、腺苷酸激酶和/或核苷二磷酸激酶，并同时表达EctABC基因簇。

优选地，所述基因工程菌敲除了PRPP结合酶PRPP、乙酰辅酶A酰基转移酶Aat和磷酸乙酰转移酶Pho；或者，所述菌株敲除了PRPP结合酶PRPP和乙酰辅酶A酰基转移酶Aat。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌为C.glutamicum ATCC 13032。

在一种实施方式中，所述PRPP结合酶GenBank:BAB99047.1，所述乙酰辅酶A酰基转移酶为GenBank:BAB99785.1，所述磷酸乙酰转移酶GenBank:BAC00147.1。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母来源的腺苷激酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母来源的腺苷酸激酶氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母来源的核苷二磷酸激酶氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

在一种实施方式中，EctABC基因簇整合了Psod启动子，启动子对应核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

在一种实施方式中，将腺苷激酶、腺苷酸激酶、核苷二磷酸激酶整合至谷氨酸棒杆菌基因组上PRPP结合酶的编码基因处、乙酰辅酶A酰基转移酶的编码基因处和/或磷酸乙酰转移酶的编码基因处。

本发明的第二个目的是提供了一种含有整合了Psod启动子的EctABC基因簇的质粒。

在一种实施方式中，所述Psod启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述EctABC基因簇上EctA、EctB、EctC均分别由Psod启动子启动子，含有Psod启动子的EctABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供了一种生产四氢嘧啶的方法，所述方法是利用所述高产四氢嘧啶的基因工程菌发酵生产四氢嘧啶。

在一种实施方式中，将所述基因工程菌在种子培养基中培养得到OD₆₀₀为0.8±0.1的种子液，将种子液以体积比10～15％的量接种至发酵体系中，在28～32℃下发酵不少于28h。

优选地，发酵时间为28～32h及36～38h。

在一种实施方式中，通过添加补料培养基控制发酵体系中残糖的浓度在1～5g/L控制发酵罐内溶氧不高于40％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5。

在一种实施方式中，所述补料培养基为葡萄糖500g/L，氯化铵20g/L，天冬氨酸钠40g/L。

在一种实施方式中，所述发酵体系中含有葡萄糖50～80g/L，玉米粉20～30g/L，氯化铵15～20g/L，氯化钠8～12g/L，硫酸镁2～5g/L，磷酸氢二钠1～2g/L，磷酸二氢钾12～16g/L，微量元素6～10mL/L，生物素1mg/L。

在一种实施方式中，所述微量元素具体配方为，100mM FeCl₃，15mM CaCl₂，12mMMnCl₂，10mM ZnSO₄，3mM CoCl₂，3mM NiCl₂，3mM Na₂MO₄，2mM Na₂SeO₃，1mM H₂BO₃。

本发明的有益效果：

本发明采用了相对安全可靠的谷氨酸棒状杆菌，敲除了谷氨酸棒状杆菌中一些消耗乙酰辅酶A的非必需蛋白的编码基因，增加其四氢嘧啶合成重要底物乙酰辅酶A的供给，提高了谷氨酸棒状杆菌的四氢嘧啶生产能力；在此基础上，在谷氨酸棒状杆菌染色体上整合了源自酿酒酵母的AMP和ATP合成相关基因，增强其AMP、ATP供给；进一步的，在上述基因工程菌中转入含EctABC基因簇的质粒，赋予了工程菌合成四氢嘧啶的能力；构建得到的四氢嘧啶工程菌，具有更短的发酵周期，最优条件下，30h时四氢嘧啶含量高达61.3g/L，菌体OD₆₀₀为54.9，每小时产能高达2.04g/L。

附图说明

图1为乙酰辅酶A参与四氢嘧啶合成中间步骤反应图，图中a为L-2,4-二氨基丁酸酯，b为乙酰辅酶A，c为辅酶A，d为N4-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸。

图2为一步敲除载体示意图。

图3为EctABC表达载体示意图。

图4为摇瓶实验，菌体OD₆₀₀随时间变化曲线。

图5为摇瓶实验，发酵液四氢嘧啶含量随时间变化曲线。

图6为发酵罐合成四氢嘧啶时，菌体OD₆₀₀、残糖和四氢嘧啶产量随时间变化曲线。

具体实施方式

下述实施例中，使用的质粒来自中科院微生物所。

下述实施例中，如没有明确说明，所使用的试剂、材料、基因合成和基因测序均是可以通过商业途径获得的。

下述实施例中，如没有明确说明，质粒均采用大肠杆菌扩增，扩增后采用质粒小提试剂盒(天根生化)进行质粒提取；DNA片段均采用PCR扩增。

下述实施例中，四氢嘧啶含量检测方法为HPLC检测。

(一)PCR扩增方法

PCR体系：Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)4μL，Forward primer 1μL，Reverse primer 1μL，Template 1μL，Fastpfu fly DNA polymerase(全式金生物)0.5μL，纯水补齐至50μL。PCR程序：Step1预变性98℃5min；Step2变性98℃30s；Step3退火55℃45s；Step4延伸72℃3kb/min；Step5 72℃5min。其中Step2-Step4循环25次。

(二)Golden Gate方法

下述实施例中，使用的Golden Gate技术，其基因的顺序拼接是通过设计特定引物实现的，其反应体系为：质粒75ng，片段与质粒摩尔比为2:1，T4 Buffer(10x)2μL，ⅡS型限制酶(BsaI)2μL，T4 DNA连接酶0.5μL，加水补齐至20μL。反应程序：先37℃1h，后60℃5min，反应后的产物进行测序验证。上述T4 Buffer、限制酶、DNA连接酶均采购自赛默飞。

(三)谷氨酸棒状杆菌感受态的制备

下述实施例中，菌株电转前需制备感受态，谷氨酸棒状杆菌感受态的制备步骤如下：

1)挑取新鲜平板上的ATCC 13032单菌落接入BHI液体培养基中，30℃、200rpm过夜培养；

2)次日按1-5％左右的接种量转接入EPO培养基中(起始细胞OD600达0.3)，30℃、200rpm培养至细胞OD600达1.0，这一过程一般需3～5h；

3)细胞培养结束后先将菌液冰浴30min，然后4000rpm离心20min收集菌体。从此步骤开始，所有操作在4℃左右的低温条件下进行；

4)用50mL预冷的10％甘油洗涤菌体，然后4000rpm离心15min，弃去上清液，该步骤重复操作3次；

6)10％甘油重悬菌体，按100μl/管分装到预冷的1.5mL EP管中；

7)用液氮速冻感受态细胞，-70℃保存。

(四)培养基配方

EPO培养基配方：1％Tryptone，0.5％Yeast Extract，1％NaCl，2.5％glycine；0.1％Tween80，调节pH至7.0。

以下实施例中，质粒去除培养基配方：每升培养基中添加5g脑心浸液，5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，固体培养基中额外添加15g琼脂。

以下实施例中，BHI培养基为成品培养基，购自环凯微生物。

以下实施例中，筛选培养基为含氨苄青霉素或氯霉素的BHI固体培养基。

(五)下述实施例中所使用的引物，所述引物均购买自擎科生物

表1载体构建使用引物

实施例1：基因敲除载体的构建

1.sgRNA的设计：以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组序列为模板设计sgRNA，具体的操作方法为，在sgRNA专用设计网站(http://crispor.tefor.net/)上输入靶基因核苷酸序列，选取谷氨酸棒状杆菌基因组，选择20bp-NGG-sp Cas9作为PAM位点进行分析，选取脱靶率低的两段sgRNA序列。在本实施例中，磷酸乙酰转移酶cgl2753对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-Pho1和sgRNA-Pho2分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，乙酰辅酶A酰基转移酶cgl2392对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-Aat1和sgRNA-Aat2分别如SEQ ID No.11和SEQID No.12所示，PRPP结合酶cgl1654对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-PRPP1和sgRNA-PRPP2分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示。

上述sgRNA通过设计相应引物，互为模板扩增而得，以磷酸乙酰转移酶cgl2753对应的sgRNA为例，其具体的操作方法为，设计两条含有部分互补序列的寡核苷酸序列sgPho1、sgPho2，其分别含有sgRNA-Pho1和sgRNA-Pho2，并且都含有U6启动子对应的终止序列，sgPho1、sgPho2互为模板扩增得到对应的sgRNA双链片段，类似的，sgAat1、sgAat2、sgPRPP1、sgPRPP2是基于上述原理设计的，上述寡核苷酸序列如表1所示。

2.上下游同源臂的设计：通过NCBI查询所述敲除基因上下游基因序列，设计出对应的上下游同源臂，所述cgl2753、cgl2392、cgl1654对应上游同源臂序列分别如SEQ IDNo.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19所示，所述cgl2753、cgl2392、cgl1654对应下游同源臂序列分别如SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20所示。

上述上下游同源臂模板是以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，设计引物扩增获得的，使用的引物如表1所示。

3.通过Golden gate方法将对应的基因片段按sgRNA-上游同源臂-下游同源臂的顺序连接至pCas9质粒(含氨苄青霉素抗性基因ampR)，分别构建得到pCas9-ΔPho、pCas9-ΔAat、pCas9-ΔPRPP敲除载体。

实施例2：一步敲入载体的构建

在实施例1所述步骤1-2的基础上，设计引物拼接Psod启动子、腺苷激酶ask、腺苷酸激酶alk和核苷二磷酸激酶ndk的基因片段，拼接产物在后续实施例中称为mix基因片段，其对应的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。通过Golden gate将对应的基因片段按sgRNA-上游同源臂-mix-下游同源臂的顺序连接至pCas9质粒(含氨苄青霉素抗性基因ampR)，分别构建得到pCas9-ΔPho-mix、pCas9-ΔAat-mix、pCas9-ΔPRPP-mix一步敲入载体，送检测序(擎科生物)验证载体序列，载体示意图如图2所示。

实施例3：四氢嘧啶基因载体的构建

EctABC基因簇的拼接：设计引物扩增Psod启动子、EctA、EctB和EctC的基因片段，通过Golden gate将对应的基因片段按Psod-EctA-Psod-EctB-Psod-EctC的顺序连接至PXMJ19质粒(含氯霉素抗性基因cmr)，构建得到PXMJ19-EctABC表达载体，送检测序(擎科生物)验证载体序列，其EctABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(每个基因前含有一个Psod启动子)，载体示意图如图3所示。

实施例4：基因敲除菌株的构建

1.cgl2753敲除菌株：通过电击转化法将pCas9-ΔPho-mix载体转入C.glutamicumATCC13032菌株，将提前制备好的谷氨酸棒状杆菌感受态置于冰上融化，添加5-15L pCas9-A-egt12质粒至谷氨酸棒状杆菌感受态中，轻轻吹打混匀，冰浴10min后，将含有质粒的感受态细胞加入2mm电转杯中，电转仪电击转化条件为电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF，立即加入1mL 46℃预热的BHI培养基，于46℃金属浴复苏6min，然后于30℃200rpm振荡培养2h。转化后的菌株涂布于含氨苄青霉素的筛选培养基，30℃倒置培养40h后，挑取单克隆送检测序(擎科生物)验证敲除位点序列，使用Snapgene软件将测序结果与预计结果进行对比，结果正确的即为cgl2753敲除菌株，即C-ΔPho菌株。挑取C-ΔPho菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，该操作重复两次，确保利用温敏复制子的特性将质粒去除，保存并用于后续的基因编辑。

2.cgl2392敲除菌株：构建方法同步骤1，将pCas9-ΔAat-mix载体转入C.glutamicum ATCC 13032菌株和C-ΔPho菌株，构建cgl2392敲除菌株，即C-ΔAat菌株和C-ΔPho-ΔAat菌株。挑取上述菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，利用温敏复制子的特性将质粒去除，分别构建得到C-ΔAat、C-ΔAat-ΔPho用于后续的基因编辑。

3.cgl1654敲除菌株：构建方法同步骤1，将pCas9-ΔPRPP-mix载体转入C.glutamicum ATCC 13032菌株、C-ΔPho菌株、C-ΔAat菌株和C-ΔPho-ΔAat菌株，构建cgl1654敲除菌株，即C-ΔPRPP菌株、C-ΔPho-ΔPRPP菌株、C-ΔAat-ΔPRPP菌株和C-ΔPho-ΔAat-ΔPRPP菌株。挑取上述菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，利用温敏复制子的特性将质粒去除，用于后续的基因编辑。

实施例5：四氢嘧啶合成菌株的构建

将PXMJ19-EctABC表达载体转入原始菌株C.glutamicum ATCC 13032和实施例4中构建的任一基因敲除菌株，具体转化方法同实施例4步骤1，构建四氢嘧啶合成菌株，即C-Ect菌株、C-ΔPho-Ect菌株、C-ΔAat-Ect菌株、C-ΔPRPP-Ect菌株、C-ΔPho-ΔAat-Ect菌株、C-ΔPho-ΔPRPP-Ect菌株、C-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株和C-ΔPho-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株，转化后菌株涂布于含氯霉素的筛选培养基，30℃倒置培养16h后，挑取阳性克隆送检测序(擎科生物)，验证是否转入Ect序列。

实施例6：不同菌株采用摇瓶法合成四氢嘧啶

实施例5中构建的四氢嘧啶合成菌株的四氢嘧啶合成能力的鉴定。

接种实施例5中构建的C-Ect菌株接种于10mL含0.02mg/mL氯霉素的BHI培养基中进行一级活化，培养6-10h至OD₆₀₀为0.8。以15％体积比将上述菌液接种至100mL摇瓶发酵培养基中，30℃，200rpm摇瓶培养40h，12h起每2h或4h取样，检测菌体OD₆₀₀与发酵液中四氢嘧啶含量。

所述摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖80g/L，玉米粉25g/L，氯化铵15/L，氯化钠10g/L，硫酸镁3g/L，磷酸氢二钠2g/L，磷酸二氢钾15g/L，天冬氨酸钠2g/L，微量元素10mL/L，生物素1mg/L。所述微量元素具体配方为，100mM FeCl₃，15mM CaCl₂，12mM MnCl₂，10mMZnSO₄，3mM CoCl₂，3mM NiCl₂，3mM Na₂MO₄，2mM Na₂SeO₃，1mM H₂BO₃。

实施例5中构建的C-ΔPho-Ect菌株、C-ΔAat-Ect菌株、C-ΔPRPP-Ect菌株、C-ΔPho-ΔAat-Ect菌株、C-ΔPho-ΔPRPP-Ect菌株、C-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株和C-ΔPho-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株均采用上述方法进行摇瓶实验，其OD₆₀₀检测结果如图4所示，四氢嘧啶含量检测结果如图5所示。

实施例7：重组谷氨酸棒状杆菌的四氢嘧啶生物合成

本实施例采用C-ΔPho-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株进行四氢嘧啶合成。

本实施例中种子液培养基配方为，葡萄糖20g/L，玉米粉15g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠9g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钾2g/L，微量元素10mL/L。

本实施例中发酵培养基配方为，葡萄糖60g/L，玉米粉25g/L，氯化铵15-20g/L，氯化钠9g/L，硫酸镁3g/L，磷酸氢二钠1g/L，磷酸二氢钾15g/L，微量元素10mL/L，生物素1mg/L。所述微量元素具体配方为，100mM FeCl₃，15mM CaCl₂，12mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，3mMCoCl₂，3mM NiCl₂，3mM Na₂MO₄，2mM Na₂SeO₃，1mM H₂BO₃。

本实施例中补料培养基配方为，葡萄糖500g/L，氯化铵20g/L，天冬氨酸钠40g/L。

将实施例3步骤1中构建的C-ΔPho-ΔAat-ΔPRPP-Ect菌株以5％体积比接种至3.5L种子培养基中，30℃培养8h至OD₆₀₀为0.8±0.1，得到种子液；将种子液以15％体积比接种至50L发酵罐中，发酵培养基体积为20L，30℃培养至葡萄糖低于2g/L，补料培养基以平均100mL/h的速度流加至发酵罐中，期间调整补料培养基流加速度，使罐内残糖在1-5g/L、溶氧不高于40％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5。50L发酵罐接种后总共发酵40h，期间每隔2h或4h取样检测菌液OD₆₀₀、残糖和四氢嘧啶含量，检测结果如图6所示，30h时四氢嘧啶含量高达61.3g/L，菌体OD₆₀₀为54.9，细胞干重约为15.2g/L，单位菌体四氢嘧啶产量约为4.03g/g，每小时产能高达2.04g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司

<120> 一种基于乙酰辅酶A代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应

用

<130> BAA220522A

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<213> 人工序列

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aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

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cgcgccaagg gagagtatct gtacgacagc gacggtactg aattcctgga cttcctggcg 1020

ggcgcgggca cgctgaacta cggacacaac aactcgctgt tcaaacagtc cctgatcgac 1080

tacatcgaag ccgacggtat tgcgcacggt ctcgatctgc atacctccgc caagcaggca 1140

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accggaagac acaacatcat ttcgttcacc aacggattcc atggtgtctc gctgggcgcg 1320

ttgtccgcga caggcaactc gcaccaccgc ggcgcggcag gcatcaatct gggcggcgtt 1380

tcgcgtatgc cgtacgacaa ctatctgggc gagggattcg ataccaccgc ctatctggac 1440

aaggtgcttt ccgattccag cagcggcatc gacaagccgg cagctgtcat cgtcgagacg 1500

gtgcagggcg agggcggtat caatgcggcg agctttgaat ggctgcgcgc gctgcaggaa 1560

gtctgcacgc gacacgggat attgctgatc gtggatgaca ttcaggcggg ctgcggcaga 1620

acaggcacct atttcagctt tgaacccgtc ggcatccagc cggacatcgt caccatgtcg 1680

aagtcattga gcggctacgg tctgccgatg gccgtggtgt tcatgaagtc ggaacatgat 1740

ctgtggaagc cgggcgagca caacggcacc ttccgcggca acaatcacgc ctttgtcacg 1800

gcgacagccg cgatcaatca ctactggtcg gacgatactt tctccaggga catcatccgc 1860

aaaggcgaga tcatcaaggc gcatctggac cgctttgtgg cggagtacgg agacggcaat 1920

ttcagcgcgc gcggtcgcgg catgttccag ggcatcaact gcatcagcgg tgagctggcc 1980

ggggatatct cgctgcgcgc gttccgcaag ggactcatga tcgagaccag cggcgcggaa 2040

gatcaggtga tcaaactgct gtgcccgctg atcatctccg acgaggcgct ggccaagggc 2100

ttggccatca tcgaggagag catcagggaa tcctgcgagc agttccgccg cattccgagc 2160

gagaaggatt tcttccagtc ctgaaacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt 2220

atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa 2280

ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt 2340

cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg 2400

tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc atggcgctgc accggctggt gcgtgactgt 2460

ctgccactcg atccaaattc ctcctactgc aacctgttgc agtgcagtca tttcaaatcc 2520

acctcgatcg cggcgataca ccgggatgaa cttgtcggca gtgtgaccgc atatcgtccg 2580

ccggagcagc ccgatacctt gttcgtttgg caggtcgccg tacatgcctc gatgcgcgga 2640

cagggcctgg cgcgcgagat gttgcgcagg ttgttcgcgc gcactgcacc ggaaggcatc 2700

cgctacatcg agacctccat cacggcagac aacgaggcgt cgcagagatt gttcgccggg 2760

tttgcggctg aacacaaggc agagatgctt cgttcggtca tgttcgacca ggttgcgcat 2820

tttgaagggc tgcacgatac ggaatatctg taccggatcg gccccgccga aattgcggcc 2880

agtacacttt ccacggaaaa aggagaaaca ccatga 2916

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Thr Ala Pro Leu Val Val Leu Gly Asn Pro Leu Leu Asp Phe Gln

1 5 10 15

Ala Asp Val Thr Ala Glu Tyr Leu Ala Lys Tyr Ser Leu Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Ala Ile Leu Val Asp Ala Lys Ser Gly Asp Ala Lys Met Ala Ile

35 40 45

Phe Asp Glu Leu Leu Gln Met Pro Glu Thr Lys Leu Val Ala Gly Gly

50 55 60

Ala Ala Gln Asn Thr Ala Arg Gly Ala Ala Tyr Val Leu Gly Ala Gly

65 70 75 80

Gln Val Val Tyr Phe Gly Ser Val Gly Lys Asp Lys Phe Ser Glu Arg

85 90 95

Leu Leu Asn Glu Asn Glu Lys Ala Gly Val Lys Ser Met Tyr Gln Val

100 105 110

Gln Asn Asp Ile Gly Thr Gly Lys Cys Ala Ala Leu Ile Thr Gly His

115 120 125

Asn Arg Ser Leu Val Thr Asp Leu Gly Ala Ala Asn Phe Phe Thr Pro

130 135 140

Asp His Leu Asp Lys His Trp Asp Leu Val Glu Ala Ala Lys Leu Phe

145 150 155 160

Tyr Ile Gly Gly Phe His Leu Thr Val Ser Pro Asp Ala Ile Val Lys

165 170 175

Leu Gly Gln His Ala Lys Glu Asn Ser Lys Pro Phe Val Leu Asn Phe

180 185 190

Ser Ala Pro Phe Ile Pro His Val Phe Lys Asp Ala Leu Ala Arg Val

195 200 205

Leu Pro Tyr Ala Thr Val Ile Ile Ala Asn Glu Ser Glu Ala Glu Ala

210 215 220

Phe Cys Asp Ala Phe Gln Leu Asp Cys Ala Asn Thr Asp Leu Glu Ala

225 230 235 240

Ile Ala Gln Arg Ile Val Lys Asp Ser Pro Val Glu Lys Thr Val Ile

245 250 255

Phe Thr His Gly Val Glu Pro Thr Val Val Val Ser Ser Lys Gly Thr

260 265 270

Ser Thr Tyr Pro Val Lys Pro Leu Asp Ser Ser Lys Ile Val Asp Thr

275 280 285

Asn Gly Ala Gly Asp Ala Phe Ala Gly Gly Phe Met Ala Gly Leu Thr

290 295 300

Lys Gly Glu Asp Leu Glu Thr Ser Ile Asp Met Gly Gln Trp Leu Ala

305 310 315 320

Ala Leu Ser Ile Gln Glu Val Gly Pro Ser Tyr Pro Ser Glu Lys Ile

325 330 335

Ser Tyr Ser Lys

340

<210> 3

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccgcac cattggtagt attgggtaac ccacttttag atttccaagc cgacgtcacg 60

gctgaatacc tggccaagta ttctctaaag gaaaacgacg caattttggt cgatgccaaa 120

tcaggcgatg ctaagatggc tatttttgac gagctcttac agatgccaga aacaaagctt 180

gttgcaggtg gtgctgctca aaacactgct agaggggcag catacgtttt gggcgccggc 240

caggtggtgt acttcggttc cgtcggtaag gacaagttca gcgagagatt gcttaacgaa 300

aacgaaaaag ctggtgtcaa gtctatgtac caagttcaaa atgatattgg taccggtaag 360

tgtgccgcat taatcactgg ccataaccgg tccttggtca ctgacttggg tgctgccaat 420

ttctttactc cagaccactt ggacaagcat tgggacttgg tcgaagcagc taagctcttc 480

tacatcggtg gtttccactt gaccgtgtct ccagacgcta tcgttaagtt gggccaacat 540

gctaaagaga acagcaaacc tttcgtgttg aactttagtg ctcctttcat tcctcatgtc 600

ttcaaagacg cattggccag agttttgcct tatgctaccg tcatcatcgc taacgaatcg 660

gaggccgaag ccttttgcga cgccttccaa ttagactgtg ccaacactga tttggaagct 720

attgctcaaa gaattgtcaa ggactctcca gttgaaaaga ctgtcatctt cacccacggt 780

gtcgaaccaa cagtggtcgt gtcctccaag ggtaccagca catatccagt caaacctttg 840

gactcttcta agatcgtcga caccaacggt gctggtgacg ccttcgctgg tggctttatg 900

gctgggttga ctaaaggtga agatttggaa acctctattg acatgggtca atggctagct 960

gctttgtcta ttcaagaagt tggtccctct tacccttccg aaaaaatatc ttactctaaa 1020

tag 1023

<210> 4

<211> 197

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

Met Glu Ala Arg Arg Tyr Gly Pro Asn Ile Ile Val Thr Gly Thr Pro

1 5 10 15

Gly Cys Gly Lys Ser Ser Thr Cys Glu Phe Leu Lys Asn Lys Leu Lys

20 25 30

Asp Tyr Lys Tyr Tyr Asn Ile Ser Asp Phe Ala Lys Asp Asn Asp Cys

35 40 45

Phe Glu Gly Tyr Asp Glu Gly Arg Lys Ser His Ile Val Asp Glu Asp

50 55 60

Lys Leu Leu Asp Met Leu Glu Pro Leu Leu Arg Gln Gly Asn Ser Ile

65 70 75 80

Val Asp Trp His Val Asn Asp Val Phe Pro Glu Arg Leu Ile Asp Leu

85 90 95

Val Val Val Leu Arg Cys Asp Asn Ser Asn Leu Tyr Ser Arg Leu His

100 105 110

Ala Arg Gly Tyr His Asp Ser Lys Ile Glu Glu Asn Leu Asp Ala Glu

115 120 125

Ile Met Gly Val Val Lys Gln Asp Ala Val Glu Ser Tyr Glu Pro His

130 135 140

Ile Val Val Glu Leu Gln Ser Asp Thr Lys Glu Asp Met Val Ser Asn

145 150 155 160

Val Ser Arg Ile Val Ala Trp Glu Lys Met Trp Leu Glu Gln His Pro

165 170 175

Asp Gly Val Thr Asn Glu Tyr Gln Gly Pro Arg Ser Asp Asp Glu Asp

180 185 190

Asp Glu Asp Ser Glu

195

<210> 5

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtctagct cagaatccat tagaatggtc ctaattggcc cacctggtgc cggtaaaggt 60

actcaagctc caaatttgca agagcgtttc catgccgctc acttggccac tggtgacatg 120

ttgagatctc aaatcgcaaa gggcactcaa ttaggtttgg aagcaaagaa aattatggac 180

caaggtggtt tagtctctga tgacattatg gttaacatga tcaaggatga attgaccaac 240

aatccagctt gtaagaatgg gttcatcttg gacggtttcc caagaaccat tcctcaggct 300

gaaaaattgg accaaatgtt gaaagaacaa ggaactcctt tggaaaaagc catcgaattg 360

aaggttgatg atgaattgtt ggttgccaga attaccggta gattaattca cccagcctct 420

ggcagatcct accacaagat ctttaaccca ccaaaggaag acatgaagga tgacgtcacc 480

ggtgaagctt tagttcaaag atctgatgac aatgcagacg ccttgaagaa gagattagct 540

gcttaccatg ctcaaaccga accaattgtt gacttttaca aaaagaccgg tatctgggct 600

ggtgttgatg cttcccaacc tcctgctact gtttgggctg acatcttgaa caagctaggt 660

aaggattaa 669

<210> 6

<211> 153

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6

Met Ser Ser Gln Thr Glu Arg Thr Phe Ile Ala Val Lys Pro Asp Gly

1 5 10 15

Val Gln Arg Gly Leu Val Ser Gln Ile Leu Ser Arg Phe Glu Lys Lys

20 25 30

Gly Tyr Lys Leu Val Ala Ile Lys Leu Val Lys Ala Asp Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Glu Gln His Tyr Ala Glu His Val Gly Lys Pro Phe Phe Pro Lys

50 55 60

Met Val Ser Phe Met Lys Ser Gly Pro Ile Leu Ala Thr Val Trp Glu

65 70 75 80

Gly Lys Asp Val Val Arg Gln Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ala Thr Asn

85 90 95

Pro Leu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Gly Ile Asp

100 105 110

Leu Gly Arg Asn Val Cys His Gly Ser Asp Ser Val Asp Ser Ala Glu

115 120 125

Arg Glu Ile Asn Leu Trp Phe Lys Lys Glu Glu Leu Val Asp Trp Glu

130 135 140

Ser Asn Gln Ala Lys Trp Ile Tyr Glu

145 150

<210> 7

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtctagtc aaacagaaag aacttttatt gcggtaaaac cagatggtgt ccagaggggc 60

ttagtatctc aaattctatc tcgttttgaa aaaaaaggtt acaaactagt tgctattaaa 120

ttagttaaag cggatgataa attactagag caacattacg cagagcatgt tggtaaacca 180

tttttcccaa agatggtatc ctttatgaag tctggtccca ttttggccac ggtctgggag 240

ggaaaagatg tggttagaca aggaagaact attcttggtg ctactaatcc tttgggcagt 300

gcaccaggta ccattagagg tgatttcggt attgacctag gcagaaacgt ctgtcacggc 360

agtgattctg ttgatagcgc tgaacgtgaa atcaatttgt ggtttaagaa ggaagagtta 420

gttgattggg aatctaatca agctaagtgg atttatgaat ga 462

<210> 8

<211> 246

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttaccc 246

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catctgtgac atcacgatcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggccagcga cgtcagagtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aacgcgatcg ttgaggcaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggttactgcc atgcgagcac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgaagacctc accccggtgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agcaatgtcg attccttcac 20

<210> 15

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcaagcgcgc acgcgcagag cactcccaca ttgtgctgcc agaaggtgac gacgaccgca 60

tcttgatggc tgcccaccag ctgcttgatc aagacatctg tgacatcacg a 111

<210> 16

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctgacgtcg ctggccaggc aaatgtgttt atcttccctg acctggaagc cggaaacatc 60

ggctacaaaa ctgcacaacg caccggtcac gccctggcag ttggtccgat tctg 114

<210> 17

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catctgttcc ccattgcgca ccccagttgg tgcttacggc ggatccttca ccggcgtccc 60

tgttgaagaa ttggccacca ccgtgatcaa cgcgatcgtt gaggcaaccg gc 112

<210> 18

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

accggtgctc gcatggcagt aaccttggct caccgcatgc agcgtgaaaa cactcagtac 60

ggactggcca ccatgtgcat cggtggcggc cagggtcttg ca 102

<210> 19

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaacaagctc taagcacctt cgacagggca cgtgaggccc tggacaagaa aacccgatat 60

gtgcaggatt tcccagaaaa gggtgtgctt tttgaagacc tcaccccgg 109

<210> 20

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaggaatcga cattgctggt aaaaacatcg ttttgatcga cgatgtgctg gcaaccggcg 60

gcaccttggg cgctgcacgt aaactaattg aatcgtgtga cggacatgtt tccggatatg 120

tt 122

<210> 21

<211> 2892

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttacccatga ccgcaccatt ggtagtattg ggtaacccac ttttagattt ccaagccgac 300

gtcacggctg aatacctggc caagtattct ctaaaggaaa acgacgcaat tttggtcgat 360

gccaaatcag gcgatgctaa gatggctatt tttgacgagc tcttacagat gccagaaaca 420

aagcttgttg caggtggtgc tgctcaaaac actgctagag gggcagcata cgttttgggc 480

gccggccagg tggtgtactt cggttccgtc ggtaaggaca agttcagcga gagattgctt 540

aacgaaaacg aaaaagctgg tgtcaagtct atgtaccaag ttcaaaatga tattggtacc 600

ggtaagtgtg ccgcattaat cactggccat aaccggtcct tggtcactga cttgggtgct 660

gccaatttct ttactccaga ccacttggac aagcattggg acttggtcga agcagctaag 720

ctcttctaca tcggtggttt ccacttgacc gtgtctccag acgctatcgt taagttgggc 780

caacatgcta aagagaacag caaacctttc gtgttgaact ttagtgctcc tttcattcct 840

catgtcttca aagacgcatt ggccagagtt ttgccttatg ctaccgtcat catcgctaac 900

gaatcggagg ccgaagcctt ttgcgacgcc ttccaattag actgtgccaa cactgatttg 960

gaagctattg ctcaaagaat tgtcaaggac tctccagttg aaaagactgt catcttcacc 1020

cacggtgtcg aaccaacagt ggtcgtgtcc tccaagggta ccagcacata tccagtcaaa 1080

cctttggact cttctaagat cgtcgacacc aacggtgctg gtgacgcctt cgctggtggc 1140

tttatggctg ggttgactaa aggtgaagat ttggaaacct ctattgacat gggtcaatgg 1200

ctagctgctt tgtctattca agaagttggt ccctcttacc cttccgaaaa aatatcttac 1260

tctaaataga acaggaatgt tcctttcgaa aattgaggaa gccttatgcc cttcaaccct 1320

acttagctgc caattattcc gggcttgtga cccgctaccc gataaatagg tcggctgaaa 1380

aatttcgttg caatatcaac aaaaaggcct atcattggga ggtgtcgcac caagtacttt 1440

tgcgaagcgc catctgacgg attttcaaaa gatgtatatg ctcggtgcgg aaacctacga 1500

aaggattttt tacccatgtc tagctcagaa tccattagaa tggtcctaat tggcccacct 1560

ggtgccggta aaggtactca agctccaaat ttgcaagagc gtttccatgc cgctcacttg 1620

gccactggtg acatgttgag atctcaaatc gcaaagggca ctcaattagg tttggaagca 1680

aagaaaatta tggaccaagg tggtttagtc tctgatgaca ttatggttaa catgatcaag 1740

gatgaattga ccaacaatcc agcttgtaag aatgggttca tcttggacgg tttcccaaga 1800

accattcctc aggctgaaaa attggaccaa atgttgaaag aacaaggaac tcctttggaa 1860

aaagccatcg aattgaaggt tgatgatgaa ttgttggttg ccagaattac cggtagatta 1920

attcacccag cctctggcag atcctaccac aagatcttta acccaccaaa ggaagacatg 1980

aaggatgacg tcaccggtga agctttagtt caaagatctg atgacaatgc agacgccttg 2040

aagaagagat tagctgctta ccatgctcaa accgaaccaa ttgttgactt ttacaaaaag 2100

accggtatct gggctggtgt tgatgcttcc caacctcctg ctactgtttg ggctgacatc 2160

ttgaacaagc taggtaagga ttaaaacagg aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt 2220

atgcccttca accctactta gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa 2280

ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt 2340

cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg 2400

tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc atgtctagtc aaacagaaag aacttttatt 2460

gcggtaaaac cagatggtgt ccagaggggc ttagtatctc aaattctatc tcgttttgaa 2520

aaaaaaggtt acaaactagt tgctattaaa ttagttaaag cggatgataa attactagag 2580

caacattacg cagagcatgt tggtaaacca tttttcccaa agatggtatc ctttatgaag 2640

tctggtccca ttttggccac ggtctgggag ggaaaagatg tggttagaca aggaagaact 2700

attcttggtg ctactaatcc tttgggcagt gcaccaggta ccattagagg tgatttcggt 2760

attgacctag gcagaaacgt ctgtcacggc agtgattctg ttgatagcgc tgaacgtgaa 2820

atcaatttgt ggtttaagaa ggaagagtta gttgattggg aatctaatca agctaagtgg 2880

atttatgaat ga 2892

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主，敲除宿主细胞中编码PRPP结合酶、乙酰辅酶A酰基转移酶和/或磷酸乙酰转移酶的基因中的一种或多种，过表达酿酒酵母来源的腺苷激酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶，并同时表达四氢嘧啶合成基因簇EctABC；所述PRPP结合酶为GenBank:BAB99047.1，所述乙酰辅酶A酰基转移酶为GenBank:BAB99785.1，所述磷酸乙酰转移酶为GenBank:BAC00147.1；所述酿酒酵母来源的腺苷激酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述酿酒酵母来源的腺苷酸激酶氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述酿酒酵母来源的核苷二磷酸激酶氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述四氢嘧啶合成基因簇EctABC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述四氢嘧啶合成基因簇EctABC上整合了谷氨酸棒状杆菌高强度启动子Psod，所述启动子Psod的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为ATCC13032。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，将腺苷激酶、腺苷酸激酶、核苷二磷酸激酶整合至谷氨酸棒状杆菌基因组上PRPP结合酶的编码基因处、乙酰辅酶A酰基转移酶的编码基因处和/或磷酸乙酰转移酶的编码基因处。

4.一种生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一所述基因工程菌发酵生产四氢嘧啶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，按照体积比10％～15％的量添加至发酵培养基中，在28～32℃下发酵不少于28h。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，通过添加葡萄糖控制发酵体系中残糖的浓度在1～5g/L控制发酵罐内溶氧不高于40％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，发酵培养基中含有葡萄糖50～80g/L、玉米粉20～30g/L、氯化铵15～20g/L、氯化钠8～12g/L，硫酸镁2～5g/L、磷酸氢二钠1～4g/L、磷酸二氢钾12～16g/L、微量元素10～20mL/L、生物素1mg/L；所述微量元素为90～100mMFeCl₃、10～15mM CaCl₂、8～12mM MnCl₂、5～10mM ZnSO₄、1～3mM CoCl₂、1～3mM NiCl₂、1～3mM Na₂MO₄、1～2mM Na₂SeO₃、0.5～1mM H₂BO₃。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基中含有葡萄糖50～80g/L、玉米粉20～30g/L、氯化铵15～20g/L、氯化钠8～12g/L，硫酸镁2～5g/L、磷酸氢二钠1～4g/L、磷酸二氢钾12～16g/L、微量元素10～20mL/L、生物素1mg/L；所述微量元素为90～100mMFeCl₃、10～15mM CaCl₂、8～12mM MnCl₂、5～10mM ZnSO₄、1～3mM CoCl₂、1～3mM NiCl₂、1～3mM Na₂MO₄、1～2mM Na₂SeO₃、0.5～1mM H₂BO₃。