CN107099497B - 一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进生物素合成的方法，该方法通过B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiae ZJU001中S‑腺苷‑L‑蛋氨酸（SAM）合成酶（sam2）基因序列来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成。通过本发明，获得的基因工程菌具有高效合成生物素的能力，在以庚二酸为底物的培养基中进行补料发酵时生物素产量可以达到417mg/L，是原始大肠杆菌的200倍，产率达到10.4mg/(L·h)。

Description

一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，涉及一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法。

背景技术

生物素(Biotin)又称维生素H、维生B7和辅酶R，是水溶性B族维生素之一，是动物机体维持正常的生理机能不可缺少的营养物质。生物素在机体内主要作为许多酶的辅助因子参与机体三大营养物质的代谢，参与羧化、脱羧和转羧基的反应。生物素被应用于化妆品、食品添加剂，医药、维生素制剂和饲料、发酵等工业中，对维持人和动物正常生长发育、骨髓的健康、保护皮肤和羽毛都起重要作用，目前全球市场每年需求量为300吨。

相对于生物素化学合成而言，生物合成方法具有价格低、成本低、产品纯度高、生产环节对环境污染小等特点，因而生物素合成将成为最有潜力的生产方法。目前能合成生物素的菌种有粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus)、库特氏菌属(Kurthia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

国内外学者从不同角度尝试改善生物素合成过程中某些关键问题，已经取得了明显成效。Perkins等通过构建工程菌的策略，获得了B.subtilisBI304和BI303(bioB和bioI之间缺失不依赖ρ的终止子)两株菌种，其产量分别达到180μg/L和250μg/L(J Bacteriol,1996,178(21):6361-6365)。星野达雄等对库特氏菌Kurthia sp.538-KA26(DSM10609)中的生物素操纵子进行重组和同源表达，通过摇瓶发酵获得39mg/L的生物素，产率为0.33mg/(L·h)(Patent CN 97119679.6)。在生物素的生物合成过程中，最后一步从脱硫生物素到生物素是限速步骤，而胞内S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)含量的积累可以有效强化这一步骤，Kanzaki等人通过筛选对苏氨酸类似物具有抗性的大肠杆菌，获得了一株能够有效积累SAM前体甲硫氨酸的突变体，SAM在胞内的含量得到提高的同时，生物素的产量提高到970mg/L，生物素产率达到11.8mg/(L·h)(US Patent 6020173)。

随着基因工程技术日益成熟，运用基因工程育种来提高生物素产量的方法被大量采用，研究人员已经通过生物技术使生物素达到比较高的产量。Bower等人通过重组和调控B.subtilis中的生物素操纵子基因，使生物素产量超过1g/L(US Patent 6303377B1)。Beatrice等人通过化学诱变的方式降低了Pseudomonas mutabilis中生物素的负反馈调节，导入含有自身生物素合成操纵子的表达载体后，罐上连续发酵2周的生物素产量达到15g/L(US Patent 7423136B2)。

目前生物发合成生物素还面临着产量低的问题，在生物素的合成过程中由脱硫生物素到生物素的步骤一直是限速步骤，研究表明提高胞内SAM的含量可以强化这一步骤，有效提高整个生物素产量，而生物素产量提高后，合成前体庚二酸的吸收速率又将成为整个生物素合成的限速步骤，这些都将是生物素生物合成过程中所必须要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种促进生物素合成的方法，该方法通过B.subtilis 168中bioW基因序列(SEQ ID NO.3)和S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列(SEQ ID NO.4)来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD(SEQ ID NO.1)和bioA(SEQ ID NO.2)对生物素的合成。

进一步地，所述B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列通过双质粒表达载体pETDuet-1，构建重组表达质粒pETDuet-biow-sam2，来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成。

进一步地，该方法具体为：

(1)克隆P.putida KT2440的两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA，利用双启动子表达载体pACYCDuet-1构建重组表达质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA。

(2)将重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA利用化学转化的方法导入E.coli BL21(DE3)，构建重组菌PM01：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA。

(3)将重组质粒pETDuet-biow-sam2利用化学转化的方法导入PM01构建重组菌株PM02：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA，pETDuet-biow-sam2。

进一步地，通过构建包含B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiaeZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列的重组细胞，来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成。

一种促进生物素合成的重组表达质粒pETDuet-biow-sam2。

一种促进生物素合成的重组细胞，该细胞包含B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列。

一种高效合成生物素的基因工程菌，包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的DNA序列。

一种高效合成生物素的重组细胞，包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的DNA序列。

本发明的有益效果在于：通过本发明，可以大大提高生物素合成效率，通过本发明获得的基因工程菌具有高效合成生物素的能力，在以庚二酸为底物的培养基中进行补料发酵时生物素产量可以达到417mg/L，是原始大肠杆菌的200倍，产率达到10.4mg/(L·h)。

附图说明：

图1是重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA PCR电泳图。泳道1-2，4-7：重组质粒PCR扩增；泳道3：假阳性；Marker：DL10000；

图2是B.subtilis 168中bioW基因PCR产物电泳图。泳道1、2、4、5为bioW基因PCR产物；Marker：DL2000；

图3是S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因sam2PCR产物电泳图。泳道1、2、3为sam2基因PCR产物；Marker：DL2000；

图4是重组质粒pETDuet-bioW-sam2电泳图。泳道1-4：重组质粒PCR扩增；Marker：

Plus II。

图5是重组基因工程菌PM02发酵过程。

具体实施方案：

本发明所需限制性内切酶，DNA聚合酶，T4DNA连接酶等均购自大连宝生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。

以下是实施实例中各成分的分析方法。

生物素分析方法的建立：Lactobacillus plantarumATCC8014在MRS液体培养基传代2～3此后离心，为确保菌体种不含有MRS中生物素的残留，需经10ml氯化钠溶液(9g/L)清洗3～4，取菌悬液待测。通过紫外分光光度计(UVmini-1240型)，以9g/L氯化钠溶液做空白对照，于550nm波长下检测菌悬液的透光率，使其透光率在60％～80％之间,根据透光率与生物素浓度的标准曲线比较即可计算生物素含量。

庚二酸分析方法的建立：采用的是RP-HPLC法，仪器：高效液相色谱(Agilent1100，德国)，TC-18(2)(4.6*250mm，5u)色谱柱；流动相A：95％水，5％甲醇(色谱级)；流动相B：95％甲醇(色谱级)，5％水；流动性C：85(V/V)％KH₂PO₄(0.01M，pH＝2.5)，15％(V/V)乙腈(色谱级)；检测波长：215mm，流速：1ml/min，10μL进样。

S-腺苷蛋氨酸(SAM)分析方法的建立：使用RP-HPLC对于SAM的进行检测，仪器：高效液相色谱(Agilent 1100，德国)，TC-18(2)(4.6*250mm，5u)色谱柱；流动相A：95％水，5％甲醇(色谱级)；流动相B：95％甲醇(色谱级)，5％水；流动性C：40mmol/L磷酸二氢铵，2mmol/L庚烷磺酸钠，18％(V/V)甲醇(色谱级)pH 3.0；检测波长：254mm，流速：1ml/min，10uL进样。

L-蛋氨酸(L-Met)分析方法的建立：使用RP-HPLC对于L-Met的进行检测，仪器：高效液相色谱(Agilent 1100，德国)，仪器：高效液相色谱(Agilent 1100，德国)，TC-18(2)(4.6*250mm，5u)色谱柱；流动相A：95％水，5％甲醇(色谱级)；流动相B：95％甲醇(色谱级)，5％水；流动性C：去离子水(高氯酸调PH2.1-2.15)；检测波长：210mm，流速：0.9ml/min，10uL进样。

细胞干重的测定：以新鲜培养基作为空白对照，用紫外分光光度计

(UVmini-1240型)测定600nm波长下菌液吸光度A，A的示数控制在0.3-0.9范围，若超出此范围，对菌液进行适当倍数的稀释。检测结果)OD₆₀₀＝A*稀释倍数，根据菌体干重和OD₆₀₀的标准曲线即可计算菌体干重。

实施例1：相关引物设计

按照Genebank gi:2627063中已公布的枯草杆菌生物素操纵子基因序列，分别设计引物Bio-EcoRI-up,Bio-XhoI-down和pET-EcoRI-up,pET-NotI-down。按照Genebank gi:852113中已公布的酿酒酵母sam2基因序列，设计引物

pET-EcoRV-up、pET-XhoI-down。按照Genebank gi:1002825811中已公布的假单胞杆菌基因序列，分别设计两对引物pACYC-EcoRV-up、PACYC-XhoI-down和pACYC-EcoRI-up、PACYC-NotI-down，引物设计结果见表1。

表1本发明所涉及的引物

引物	序列(5＇>3＇)
		pACYC-EcoRI-up	gatcCGAATTCGatgagcgccagcacaactgcaacaacacgt
pACYC-NotI-down	attatGCGGCCGCctaatccagcagatccagttgcagatgctc
		pACYC-EcoRV-up	aattgGATATCgatgggcctcaatgatcagtggatgcaacgc
pACYC-XhoI-down	ccagaCTCGAGctagcccgggtcgcggaagtcggggtggaa
		pET-EcoRI-up	atcCGAATTCGatgcaagaagaaactttttatagtgtc
pET-NotI-down	ttatGCGGCCGCtcatgagtcatgatcttcctcccactc
		pET-EcoRV-up	attgGATATCgatgtccaagagcaaaactttctta
pET-XhoI-down	ccagaCTCGAGttaaaattccaatttctttggt

实施例2：重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA的构建

通过pACYC-EcoRV up,PACYC-XhoI-down和pACYC-EcoRI-up,PACYC-NotI-down以P.putida KT2440基因组为模板扩增出bioA(1407bp)和bioBFHCD(4489bp)基因。将pACYCDuet-1质粒和bioBFHCD片段用EcoRI和NotI双酶切后，酶连到T7promoler-1后的多克隆位点上(mcsl),获得重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD。

将该重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD转化到克隆宿主DH5a中，过夜培养，提取重组质粒，将pACYCDuet-bioBFHCD重组质粒和bioA片段用EcoRV和XhoI双酶切后，酶连到T7promoler-2后的多克隆位点上mcs2，获得重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA，重组质粒电泳图如图1。

实施例3：重组质粒pETDuet-bioW-sam2的构建

通过引物pET-EcoRI-up和pET-NotI-down，以B.subtilis168基因组DNA为模板，进行bioW(777bp)基因扩增，扩增结果如图2，通过PCR纯化将pETDuet-1质粒和bioW片段用EcoRI和NotI双酶切后，酶连到T7promoler-1后的多克隆位点上mcs1，获得重组质粒pETDuet-bioW。

将重组质粒pETDuet-bioW转化到克隆宿主DH5a中，过夜培养，提取重组质粒。以S.cerevisiae ZJU001基因组DNA为模板，用pET-EcoRV-up和pET-XhoI-down引物进sam2基因(1155bp)扩增，扩增产物电泳图如图3。将取的pETDuet-bioW重组质粒和sam2基因片段用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切后，用T₄DNA连接酶连到T7promoler-2后的多克隆位点上mcs2，获得重组质粒pETDuet-bioW-sam2，重组质粒电泳图如图4。

重组质粒经上海生工测序，测得其包含B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列。

实施例4：重组细胞PM01和PM02的获得

大肠杆菌感受态细胞采用氯化钙法制备。克隆P.putida KT2440的两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA，利用双启动子表达载体pACYCDuet-1构建重组表达质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA。重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA转化到感受态细胞中，获得重组菌PM01：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA。

在此基础上对PM01进行感受态细胞的制备，并将重组质粒pETDuet-bioW-sam2转化到PM01感受态细胞中，获得重组菌PM02：E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-bioBFHCD-bioA,pETDuet-bioW-sam2。经上海生工测序，测得其包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的DNA序列。

实施例5：重组工程菌PM01、PM02的摇瓶发酵

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸取物5，氯化钠5，Na₂HPO₄·12H2O8.28,KH₂PO41.35，NH4Cl 0.45，葡萄糖10。另外添加终浓度0.01mM的CaCl₂,0.02mM的MgSO₄。

发酵培养基(g/L)：酵母浸取物2，氯化钠5，Na₂HPO₄·12H₂O 8.28，KH₂PO₄1.35，NH₄Cl 0.9，葡萄糖30，庚二酸1.2，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)0.05，L-蛋氨酸0.2。另外添加终浓度为0.01M的CaCl₂,0.02mM的MgSO₄以及5mM的FeCl₂。

将活化后的菌种转接到250mL装有50mL种子培养基的摇瓶中，转速200rmp，于37℃恒温培养10h左右，当细胞生长至OD600为1.2～1.8时，调节温度至30℃，转速200rpm，1mMIPTG诱导。诱导40h后，收集发酵液，测定发酵液中生物素含量。

PM01培养基中Cm浓度为50mg/L，PM02培养基中Amp浓度为100mg/L，Cm浓度为50mg/L。诱导40h后检测发现，重组菌PM01发酵液中生物素产量达到65.2mg/L，而重组菌PM02发酵液中生物素产量达到146.1mg/L。说明PM02所携带的质粒pETDuet-bioW-sam2对生物素的合成起着重要的促进作用。

表2重组工程菌摇瓶发酵生物素产量

重组菌	所含质粒	生物素产量(mg/L)
			PM01	pETDuet-bioW-sam2	65.2
PM02	pACYCDuet-bioBFHCD-bioA,pETDuet-bioW-sam2	146.1

实施实例6：重组工程菌PM02 15L罐补料发酵

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸取物5，氯化钠5，Na₂HPO₄·12H2O8.28,KH₂PO41.35，NH4Cl 0.45，葡萄糖10。另外添加终浓度0.01mM的CaCl₂,0.02mM的MgSO₄。

发酵培养基(g/L)：酵母浸取物2，氯化钠5，Na₂HPO₄·12H₂O 8.28，KH₂PO₄1.35，NH₄Cl 0.9，葡萄糖40，庚二酸1.2，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)0.05，L-蛋氨酸0.2。另外添加终浓度为0.01M的CaCl₂,0.02mM的MgSO₄以及5mM的FeCl₂。

将活化后的菌种转接到500mL装有100mL种子培养基的摇瓶中，转速200rmp，于37℃恒温培养10h左右，当细胞生长至OD600为1.2～1.8时，按照8％(V/V)的接种量转接至15L发酵罐培养，培养温度37℃，转速300rpm。待OD600长到10左右时，调节温度至30℃，添加终浓度为1.0mM的IPTG。发酵过程中，每两个小时取样一次，测定发酵液中各组分含量，当葡萄糖浓度偏低时补加葡萄糖。培养基中Amp浓度为100mg/L，Cm浓度为50mg/L。发酵40h后，菌液浓度达到OD600＝45.8，生物素产量为417.1mg/L，产率达到10.4mg/(L·h)，如图5所示。

实施例7

本实施例利用Pseudomonas putida KT2440，同样构建了包含B.subtilis 168中bioW基因序列和S.cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)合成酶(sam2)基因序列的重组细胞，经上海生工测序，测得其包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的DNA序列。经发酵测试，该重组细胞与原始细胞相比生物素合成能力大大提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4459

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgagcgcca gcacaactgc aacaacacgt cacgattggg ccctggccga ggtcaaggcg 60

ctgttccagc aaccgttcaa tgacttgctg ttccaggcgc agaccgtgca ccgcgcgcat 120

ttcgacccca accgcgtgca ggtttcgacg ttgctgtcga tcaagaccgg cgcctgcccg 180

gaagattgca aatattgtcc gcagtccggt cactacaaca ccggcctgga gaaacagaag 240

ctgatggaag tgcagaaggt gctggaagaa gctgcccgcg ccaaagccat cggttctacc 300

cgtttctgca tgggggcggc gtggaagcac ccgtcggcca aagacatgcc ctacgtgctg 360

gagatggtca aaggcgtcaa ggccatgggc ctggaaacct gcatgaccct cggcaaactc 420

gaccaggagc agaccaaggc cctggcccag gctggtctgg actactacaa ccacaacctc 480

gacacctcgc cggagttcta cggcagcatc atcaccacgc gtacctacag cgagcgcctg 540

cagaccctgg cctacgtgcg cgacgccggg atgaaaatct gctctggtgg cattctgggc 600

atgggtgaat cgctggatga ccgcgccggc ctgctgatcc agctggccaa cctgccggaa 660

cacccggagt cggtgccgat caacatgctg gtcaaggtgg ccggcacgcc gctggctgag 720

gaagaggacg tcgacccgtt cgactttatc cgtatgctgg ccgtggcccg gatcctcatg 780

cccaagtctc acgtgcgcct gtccgccggc cgcgagcaga tgaacgagca gatgcaggcc 840

ctggccttca tggcgggcgc caactcgatc ttctacggcg aaaagctgct gaccaccgcc 900

aacccccagg ccgacaagga catgcagctg ttcgcacgcc tgggcatcaa gcccgaagcg 960

cgtgaagagc acgccgacga agtgcaccag gcagccatcg agcaagcgct ggtcgagcag 1020

cgcagcagcg agatgttcta cgacgccgcg acagcctgac atggctttcg acctggcagc 1080

gcgcctggcc gaacggcgcg ccgcagacct gtatcggcag cggccattgc tggaaagccc 1140

gcaagggccg gaagtggtgg tcgacggcca gcggttgctg gccttctgca gcaatgacta 1200

cctgggcctg gccaaccacc ccgaggtgat cgccgcctgg caggccggcg ccgagcgctg 1260

gggtgtgggg gggggggcct cgcacctggt agttggccac agcaccccgc accatcaggt 1320

tgaagaggca ctggctgaac tcaccggccg cccgcgcgcc ctgttgttct ccaccggcta 1380

tatggccaat ctgggcgcca tcaccgcgct ggtggggcag ggcgacacgg tattgcaaga 1440

ccgcctcaac catgcctcgt tgctggatgg cgggttgctc agtggtgccc gcttcaaccg 1500

ctacctgcac aacgacccgg ccagcctggc cagccgcctg gacaaggcgg tcggcaatac 1560

cctggtggtg accgatggcg tgttcagcat ggacggtgac ctggccgacc tgccggcgct 1620

ggccaatgtc gcccgtgccc gcggtgcctg gctgatggtc gacgacgccc atggcctggg 1680

caccctgggt gccaaaggcg gcggcatcgt cgagcacttt ggcctgggcg tggatgatgt 1740

acccgtgctg atcggcacgc tgggcaaggc ttgcggcact gcgggcgcct ttgttgccgg 1800

cagcgaggcg ctgatcgagg cgctggtaca gttcgcccgc ccctatatct acaccaccag 1860

ccagccaccg gcgctggcct gcgccacact caagagcctg gagctgttgc gccgcgaaac 1920

ctggcgtcgt gagcacctgg cagccttgat tcgccagttc cgagaaggcg cgcagcagtt 1980

ggggctgcag ttgatggaca gcccgacgcc gatccagccc atcgtgatcg gtgacagtgc 2040

gcaggcgttg cgcctgtcac gcctgctgcg tgagcgcggc ttgctggtga cggccatccg 2100

cccacccacc gtgccggctg gcagcgcacg cctgcgggta accctgagcg ccgcacacag 2160

cgaggcgcag gtgcagctat tgttgaatgc attggccgag tgttatccac agttggagaa 2220

cgccgatgcg taatcgactt gttctattgc ccggctgggg cttgggaact gctgcgctgg 2280

agccgctggc cgctagcctg cgtgcccagg acgcccgcct gcaggtagag ctgatgcccc 2340

tgccagaact ggcccacagc gatgtgcagg cctggatcga ccatctggac cgcaagctgc 2400

ccaacgatgt ctggctgggt ggctggtcac tgggtggcat gttggccagc gcgctggcgc 2460

acaagcgtgg cgaccactgc tgcgggctgc tgaccttggc cagcaacccc agcttcctgg 2520

cccggccaga ttggccccat ggcatggccg aagacacctt cggcaccttc ctcgacggtt 2580

gccgcaacca tactcaggtt accctcaagc gctttcgtac cttgtgcagc gacggcgcac 2640

tgcagccgcg caccctgttg cgccagctgg gtgtcggcgt gccggaaacc gacccgttgt 2700

acctggccac tggccttgaa gtgctggcta agctggacac ccgtgaggcc ttgcaggcct 2760

atgatggccc gcagctgcac ctgttcgccg gcagcgatgc actagtgcca gcagaggcgg 2820

caaaggcgtt gagcgagctg ttgcccgatg tagaagtggg catggtcgaa gacagttccc 2880

acgcgttcct gctggagtat ccgcaggagc tggcggcggg catcaagagt tttctgcatg 2940

agagtggcga tgactgacct ttcccgtccg accctgcccg gcgcattgcc cgacaagcgc 3000

caggtggcgg cctcgttctc ccgcgccgcg gccagttacg acagcgtggc ggcccttcag 3060

cgcgctgtag gcctgagcct gctggagcag ttgccggcag gcctgcagcc gtcacactgg 3120

ctggacctgg gcagcggcac cggccatttc agccgcatgc tggccgagcg tttcgcccag 3180

gccggcggcg tggcggtgga tattgccgag ggcatgttgc ttcatgcgcg tcatgtcaag 3240

ggtggggcgc agtatcacgt ggttggcgac gccgagcgtt tgccgctgcg cgatgccagt 3300

gtcgacctgg tgttttccag cctggcggtg cagtggtgcg atcagttcgc cagtgtgctg 3360

gccgaggcgc agcgggtgct gcgcccaggt ggagtactgg ccttcagcag cctgtgcgtg 3420

ggcaccctcg acgaactgcg cgccagctgg caggcggtgg atggcctggt gcatgtaaac 3480

cgcttccgcc gtttcgaaga ctatcagcgc ctgtgcgcag ccagcggttt tgagcagctt 3540

gagctggagc ggtgcccgca tgtactgcac tacccggatg tgcgcagcct gacccacgaa 3600

ctgaaggcgt tgggggcgca caatctgaac cctgggcgac cttccggcct cactggccgg 3660

gcgcgaatgc agggcctgtt gcaggcctat gaggcatttc gccaacccgc ggggctgcca 3720

gccacctatc aagtggtcta tggtgtgttg cgcaagccac tggcgtaagg ggagcacgat 3780

gagccaggcc tttttcattg cgggtaccga taccgatgtc ggcaagacca ccatcgccgc 3840

tggcctgttg catgcggcgc gtttgcaggg catgagcacg ctgggtgcca agccggttgc 3900

ctcgggctgc accatgacgc cgaaaggcct gcgcaatagc gatgccctgg cgctgatcga 3960

cgaaagcacg gtcaagctgc cttatgagca ggtcaatccg tttgccttcg agcctgctat 4020

agccccgcat gtggcggcgc gcgaggcagg ggtgacgctg gctgtgccag aactgctcgc 4080

ggcgatgcgc aatgtgctgc aacaaaatgc cgacttcacc ttgatagagg gggccggtgg 4140

ctggcgcgta ccgctgtcgg gcctggagaa cctgtccgac cttgccgttg ccctgcgatt 4200

gcgggtgatt ctggtggtag gcgtgcggtt gggttgcatc agccatgcct tgctcagcgc 4260

cgaagcgatc gagcgtgatg ggctgcagtt ggcgggttgg gtagcaaaca tcatcgagcc 4320

gcgcacctca cgcctggaag agaacctggc cagccttgca gagcgcctgc cggcgccttg 4380

cctggggcgg gttcccaagc tcaagcaggc cagtgccgac atggtggctg agcatctgca 4440

actggatctg ctggattag 4459

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgggcctca atgatcagtg gatgcaacgc gacctcaagg tcctgtggca cccctgtacc 60

cagatgaaag accacgagca gctgccgctg atccctatca agcgcggcga aggcgtgtgg 120

ctggaagact tcgagggcaa acgctacctg gatgcggtga gcagctggtg ggtcaacgtg 180

ttcggccatg ccaacccgcg catcaaccag cgcatcaagg accaggttga ccagctcgag 240

cacgtgatcc tggccggttt cagtcatcag ccagtgatcg agctgtccga acgcctggtc 300

gccatgaccc cggccggtct cgaccgggtg ttctatgccg acaatggctc gtcgtgcatc 360

gaagtggcgc tgaaaatgag cttccactac tggcagaaca tcggcaaacc ggacaagaag 420

cgcttcgtca ccctgaccaa cagctaccac ggcgaaacca ttgccgccat gtcggtgggt 480

gatgtgccgc tgttcaccga aacctacaag gcgctgctgc tcgacaccct caaggtgcca 540

agccctgact gctacctgcg ccccgagggc atgagctggg aggagcactc gcgcaacatg 600

ttccaggcca tggagcagac cctggccgaa caccacgcct cgatcagcgc cgtgatcgtc 660

gagccgctga tacagggtgc cggtggcatg cgcatgtacc acccggtgta cctcaagttg 720

ttgcgcgagg cctgcgaccg ctatgacgtg caccttatcc acgacgagat cgccgtgggc 780

ttcggccgca ccggcacgat gttcgcctgc gagcaagccg gcatccgccc ggatttcctg 840

tgcctgtcca aggccctgac cggcggctac ctgccgctgg ccgcctgcct gaccaccgac 900

aaggtgtacc aggcgttcta tgacgattac ccgacactgc gcgcattcct gcactcgcac 960

agctacaccg gcaacccgct ggcgtgcgct gcagcgctgg cgaccctgga tatcttcgag 1020

caggacaacg tgatcgaggc caacaaggcc ctggccacgc gcatggccac agccactgca 1080

catttggccg atcatgctca tgttgccgaa atacgccaga ctggcatggc cctggccatc 1140

gaaatggttc aagacaaggc aggcaagctt gcctacccct ggcaggagcg ccgtggcctg 1200

aaggtgttcg agcacgccct gacccgcggc gccctgctgc gaccgctggg cagcgtggtg 1260

tacttcctgc cgccgtacgt gatcaccccc gagcagatcg acttccttgc cgaagtggcc 1320

agcgaaggca tcgatatcgc cacccgcgac agcgtcagtg tcgcagtacc ggccaacttc 1380

caccccgact tccgcgaccc gggctag 1407

<210> 3

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgcaagaag aaacttttta tagtgtcaga atgagggctt caatgaatgg atctcatgaa 60

gacggcggaa agcatatatc cggcggagaa cggcttattc ctttccatga gatgaagcat 120

acagtcaatg ctttattaga aaaagggtta tcccattcaa gaggaaaacc tgattttatg 180

caaattcaat ttgaagaggt acatgaatcg ataaaaacca ttcagccatt gcctgtgcat 240

acgaatgaag tgagctgccc ggaagaagga caaaagcttg cccgattgtt attggaaaaa 300

gaaggcgttt cacgagacgt gattgaaaaa gcatatgaac aaatccctga atggtcagat 360

gtcaggggtg cggtgttgtt tgatattcat acaggcaagc gaatggatca aacaaaagaa 420

aaaggggtgc gggtctccag aatggattgg ccggacgcta attttgaaaa atgggcgctt 480

cacagtcacg tgccagctca ttcaagaata aaagaggccc ttgcgctcgc ttcaaaggta 540

agccggcacc cggcagtcgt tgcagaatta tgctggtcgg acgatccgga ttacataaca 600

ggctatgttg cgggtaagaa aatgggctat cagcgtatta cagcaatgaa agaatacggg 660

actgaagagg gctgccgagt cttttttatt gatggatcca atgatgtaaa cacgtacata 720

catgacctgg agaagcagcc tattttaata gagtgggagg aagatcatga ctcatga 777

<210> 4

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgtccaaga gcaaaacttt cttatttacc tctgaatccg tcggtgaagg tcacccagac 60

aagatttgtg accaagtttc tgatgctatt ttggacgctt gtttagaaca agatccattc 120

tccaaggttg cctgtgaaac agctgccaaa actggtatga ttatggtttt cggtgaaatt 180

accaccaaag ctagacttga ctaccaacaa atagtaagag ataccatcaa gaagattggt 240

tatgacgatt ctgccaaggg tttcgactac aagacatgta atgttttagt agctatcgaa 300

caacaatctc cagatatcgc tcaaggtctg cactatgaaa agagcttaga agacttaggt 360

gctggtgacc aaggtataat gtttggttac gctacagacg aaactccaga agggttacca 420

ttgaccattc ttttggctca caaattgaac atggctatgg cagatgctag aagagatggt 480

tctctcccat ggttgagacc agacacaaag actcaagtca ctgtcgaata cgaagacgac 540

aatggtagat gggttccaaa gaggatagat accgttgtta tttctgctca acatgctgat 600

gaaatttcca ccgctgactt gagaactcaa cttcaaaaag atattgttga aaaggtcata 660

ccaaaggata tgttagacga aaataccaaa tatttcatcc aaccatccgg tagattcgtc 720

atcggtggtc ctcaaggtga cgctggtttg accggtagaa agattattgt cgacgcttac 780

ggtggtgcct catccgtcgg tggtggtgcc ttctccggta aggactattc caaggtcgat 840

cgttccgctg cttacgctgc tagatgggtt gccaagtctc tagttgccgc tggtttgtgt 900

aagagagtcc aagtccaatt ttcatatgct attggtattg ctgaaccatt gtctttacat 960

gtggacacct atggtacagc tacaaaatca gatgacgaaa tcattgaaat tattaagaag 1020

aacttcgact tgagaccagg tgtgttagta aaggaattag atttggctag accaatttac 1080

ttaccaaccg cttcttatgg tcacttcact aatcaagagt actcatggga aaaaccaaag 1140

aaattggaat tttaa 1155

Claims (5)

1.一种促进生物素合成的方法，其特征在于，该方法通过B. subtilis 168中bioW基因序列：SEQ ID NO.3和S. cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因序列：SEQ IDNO.4来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD：SEQ ID NO.1和bioA：SEQ ID NO.2对生物素的合成；所述生物素的合成通过用SEQ ID NO：1-4构建重组表达质粒pETDuet-biow-sam2和pACYCDuet-bioBFHCD-bioA，并将双质粒转染宿主细胞获得的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述B. subtilis 168中bioW基因序列和S. cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因序列通过双质粒表达载体pETDuet-1，构建重组表达质粒pETDuet-biow-sam2，来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法具体为：

（1）克隆P. putida KT2440的两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA，利用双启动子表达载体pACYCDuet-1构建重组表达质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA；

（2）将重组质粒pACYCDuet-bioBFHCD-bioA利用化学转化的方法导入E.coliBL21（DE3），构建重组菌PM01：E.coliBL21（DE3）/ pACYCDuet-bioBFHCD-bioA；

（3）将重组质粒pETDuet-biow-sam2利用化学转化的方法导入PM01构建重组菌株PM02：E.coliBL21（DE3）/ pACYCDuet-bioBFHCD-bioA，pETDuet-biow-sam2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过构建包含B. subtilis 168中bioW基因序列和S. cerevisiae ZJU001中S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因序列的重组细胞，来促进两段生物素操纵子基因bioBFHCD和bioA对生物素的合成。

5.一种促进生物素合成的重组表达质粒，其特征在于，在权利要求2所述方法下构建pETDuet-biow-sam2。

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