CN110869503A - 甲硫氨酸生产酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲硫氨酸和/或其衍生物的生物生产领域，特别涉及从还原的硫源例如MeSH或MeSNa生物生产甲硫氨酸和/或其衍生物的领域。发明人已经构思了遗传修饰的酵母，与亲本酵母相比，其具有提高的生产甲硫氨酸和/或其衍生物的能力。

Description

甲硫氨酸生产酵母
技术领域
本发明涉及甲硫氨酸和/或其衍生物的生物生产领域，特别涉及从还原的硫源(例如MeSH或MeSNa)生物生产甲硫氨酸和/或其衍生物的领域。
背景技术
甲硫氨酸是两种含硫的蛋白氨基酸之一，在许多生物体(包括非人类和人类哺乳动物)的代谢中必不可少。甲硫氨酸主要存在于皮肤、毛羽和指甲的结构蛋白，例如胶原蛋白或角蛋白中。在白蛋白，尤其是卵白蛋白中可以发现最高约5％的甲硫氨酸含量。
大多数植物、真菌和细菌可以从碳水化合物、有机或无机氮和硫源合成甲硫氨酸。但是，包括人类在内的动物都依赖于外部提供的甲硫氨酸来源。在有机农业，特别是家禽和猪的养殖中，甲硫氨酸的供应已成为一个问题，因为甲硫氨酸被分别视为家禽和仔猪饲料中的第一和第三限制性氨基酸。大部分生产的甲硫氨酸用于牲畜生产中的动物饲料。如今，甲硫氨酸主要通过化学合成由甲硫醇、丙烯醛和氰化氢生产。化学生产的甲硫氨酸可用于大多数应用。然而，在化石资源减少和更强的环境约束(例如有害中间体和废物)的背景下，基于自然资源的替代性和更具可持续性的工艺越来越引起人们的关注。此外，人们普遍寻找用于多种工业应用的节省成本的甲硫氨酸来源。
甲硫氨酸可以通过非合成方法通过酶促转化或从前体化合物(例如5-单取代的乙内酰脲衍生物、O-琥珀酰基-L-高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸)开始的发酵生产。然而，因为前体通常是化学合成的，或者必须首先通过发酵生产，所以与化学合成的方法相比，没有真正的工业或经济优势。通过发酵方法生产和纯化甲硫氨酸的方法的示例性实施方案公开于美国专利申请号US 2012/0190084和US 2007/0122888中。
通过发酵从天然来源生产甲硫氨酸可以解决许多上述问题。有许多细菌和酵母能够在适当条件下过量生产氨基酸。但是，由于L-甲硫氨酸合成的调控非常复杂，因此只有少数菌株能够生产有意义的量的甲硫氨酸。因此，通过发酵工艺生产甲硫氨酸的主要缺点是甲硫氨酸的生物合成非常复杂，具有多种反馈抑制作用(Becker等人,2012,Currentopinion in Biotechnology,Vol.23(5):718-726)。另一个问题是硫源，硫源通常以无机硫酸盐形式提供，因此需要将其强烈还原，然后才可以转化为甲硫氨酸。在所有情况下，候选甲硫氨酸生产生物都必须经过许多轮的突变和选择，然后才能作为有意义的生产者被保留。在美国专利号US 4,439,525以及Halasz等人(1996,Periodica PolytechnicaSer.Chem.Engl.,Vol.40(1-2):53-78)中公开了在自发突变或化学诱导的突变后选择的候选甲硫氨酸生产微生物的说明性实施方案。
通过细菌和酵母的生物合成途径生产必需氨基酸(例如甲硫氨酸)需要NADPH形式的大量还原力。然而，在这些微生物中，特别是在酵母中，葡萄糖代谢的主要途径是糖酵解，然后进行发酵，发酵仅产生NADH。因此，在微生物中保持适当的NADPH/NADH平衡(尽管很复杂)对于优化甲硫氨酸的生物生产，同时获得有活力的重组微生物是至关重要的。
已知的主要细菌性氨基酸生产者是谷氨酸棒状杆菌(C.glutanicum)，其是一种革兰氏阳性、兼性厌氧、非致病性土壤细菌。谷氨酸棒状杆菌被用于大规模工业生产增味剂L-谷氨酸以及食品添加剂L-赖氨酸。已经进行了各种尝试以通过谷氨酸棒状杆菌的发酵，特别是通过在细菌生长培养基中提供还原的硫，来生产甲硫氨酸。
根据其他改进策略，已经通过对候选微生物(主要是细菌生物大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌)进行遗传工程改造研究了通过发酵增加甲硫氨酸生产。在PCT专利申请号WO 02/18613、WO 2007/077041、WO 2009/043372、WO 2012/090021、WO 2013/001055、WO 2013/190343、美国专利申请号US 2009/0298135和US 2013/0183727以及Park等人(2007,MetabEng,Vol.9(4):327-336)中公开了示例性实施方案。
在本领域中仍然需要其他甲硫氨酸生产方法。
发明内容
因此，本发明涉及生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母，在其基因组中：
(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)至少一种编码天冬氨酸激酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(C)(i)a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码甲硫氨酸合酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或
(ii)a)至少一种编码高丝氨酸激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
如所附实施例所示，本发明的重组酵母具有提高的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物生产。
还可通过使酵母与下文所述的另外的修饰重组，来进一步提高所述有利性质。
因此，生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母可以有利地用于如下所述的甲硫氨酸和/或至少一种其衍生物的生产方法中，或用于生产甲硫氨酸和/或其衍生物。
本发明还涉及一种生产甲硫氨酸和/或至少一种其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在培养基中培养根据本发明的重组酵母，所述培养基优选包含MeSH、MeSNa和/或MeSMe；和
(b)从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或至少一种其衍生物。
在一个特定的实施方案中，培养基包含至少一种碳源，优选地选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。
本发明的另一个目的是根据本发明的重组酵母用于生产甲硫氨酸和/或其衍生物，特别是用于生产甲硫氨酸和/或2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)和/或2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)，优选用于生产甲硫氨酸和/或2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)的用途。
甲硫氨酸的衍生物是在修饰甲硫氨酸后获得的化合物。因此，在本发明中，为了获得甲硫氨酸的衍生物，首先要生产甲硫氨酸，然后通过至少一个额外的步骤，将甲硫氨酸转化为一种其衍生物，特别是一种在本文中提到的其衍生物。
具体实施方式
发明人已经构思了遗传修饰的微生物，尤其是遗传修饰的酵母，与亲本微生物相比，尤其是与亲本酵母相比，其具有提高的生产甲硫氨酸和/或其衍生物的能力。
在整个本说明书中描述了这些遗传修饰的微生物，包括这些遗传修饰的酵母。
定义
如本文所用，术语“微生物”是指未经人工修饰的酵母。如果微生物提供了将要整合到微生物“受体”的遗传元件(所述“受体”将表达该外源遗传元件)，或者如果微生物用作基因构建或蛋白质表达的工具，则该微生物可能是“供体”。本发明的微生物选自表达用于甲硫氨酸的生物合成的基因的酵母。
如本文所用，术语“重组微生物”或“遗传修饰的微生物”或“重组酵母”或“遗传修饰的酵母”是指经遗传修饰或遗传工程改造的酵母。根据这些术语的通常含义，这意味着本发明的微生物不是在自然界中存在的，而是通过引入或通过删除或通过修饰来自自然界中存在的等同微生物的遗传元件而被修饰的。也可以通过在特定选择压力下结合定向诱变和进化来迫使新的代谢途径的发展和进化来对其进行修饰(参见例如WO 2004/076659)。
如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则可以对微生物进行修饰以表达这些外源基因。可以对微生物进行修饰以调节内源基因的表达水平。用外源DNA修饰或“转化”微生物，如酵母，是本领域技术人员的常规工作。特别地，根据本发明的微生物的遗传修饰，特别是本文定义的遗传修饰，可以通过使用CRISPR-Cas系统进行，如DiCarlo等人(Nucl.Acids Res.,vol.41,No.7,2013:4336-4343)中所述。
术语“内源基因”是指该基因在任何遗传修饰之前存在于野生型株的微生物中。可以通过引入异源序列以补充或替代内源性调节元件，或通过向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝，来使内源基因过表达。也可以对内源基因进行修饰以调节其表达和/或活性。例如，可以向编码序列中引入突变以修饰基因产物，或者可以引入异源序列以补充或替代内源调节元件。内源基因的调节可导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者，导致内源基因产物的活性的下调和/或减弱。增强内源基因表达的另一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。
术语“外源基因”是指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入到微生物中，而该基因不是天然存在于野生型微生物中的。如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则微生物可以表达这些外源基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规工作。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或由质粒或载体在染色体外表达。本领域已知多种质粒，它们的复制起点和它们在细胞中的拷贝数是不同的。可以修改外源基因的序列以在宿主微生物中表达。实际上，本领域技术人员知晓密码子使用偏好的概念以及如何针对特定的密码子使用偏好修改核酸序列而不更改推断蛋白质。
术语“异源基因”是指该基因衍生自不同于表达它的受体微生物的微生物物种。它是指不天然存在于该微生物中的基因。
在本申请中，所有基因均以其通用名称并参考其核苷酸序列，以及有的情况也参考其氨基酸序列进行指代。使用已知基因的登录号(accession number)给出的索引，本领域技术人员能够确定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共有序列进行，所述共有序列可以通过以下方法确定：与衍生自其他微生物的基因进行序列比对并设计简并探针(degenerated probe)以克隆另一生物体中的相应基因。
本领域技术人员知晓调节(特别是上调或下调)内源基因表达的不同方法。例如，增强内源基因表达的一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。
另一种方法是用更强的启动子代替基因的内源启动子。这些启动子可以是同源的或异源的。在本说明书的其他地方更详细地描述了在本发明中特别令人感兴趣的启动子。
核酸表达构建体还可以包含5'和/或3'识别序列和/或选择标记。
术语“过表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达增加。通过增加编码所述酶的基因的表达来增加酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来增加基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算过表达的核酸上游实施强启动子，或在启动子(特别是强启动子)和终止子之间引入所述核酸的多个拷贝。
术语“低表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达降低。通过降低编码所述酶的基因的表达来降低酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来降低基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算低表达的核酸上游实施弱启动子。还可以提及的是实施编码比亲本酶的活性更低的所述酶的变体，或在细胞中比亲本酶更快速地降解的所述酶的变体的核酸。比亲本酶更快速地降解的所述亲本酶的变体涵盖降解决定子(degron)标记的酶。还可以提及的是降低目的基因的转录激活子的表达。
术语“诱导型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被诱导(即增加)的启动子：
-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越强；或者
-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会诱导启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越强。
术语“抑制型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被抑制(即降低)的启动子：
-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越弱；或者
-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会抑制启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越弱。
如本文所用，“降解决定子标记的”酶是指包含添加的蛋白质降解信号氨基酸序列的酶，该氨基酸序列充当破坏信号，所述破坏信号将使所述酶成为降解的对象，所述降解可以是)非泛素依赖性降解或(ii)泛素依赖性降解。所述添加的蛋白质降解信号，在本领域中也称为“降解决定子”，其涵盖用作破坏信号的氨基酸序列，所述氨基酸序列由引起靶蛋白降解的可转移降解信号组成。降解决定子涵盖“N-降解决定子”，它们是可转移的N-末端氨基酸，可遵循众所周知的N-末端规则引起靶蛋白降解(Bachmair等人,1986,Science,Vol.234(4773):179-186)。N-降解决定子的不稳定性质归因于其首要氨基酸，这些氨基酸容易发生乙酰化或精氨酰化修饰，并最终导致泛素化和降解。通常，降解决定子需要至少两种组分以确保靶蛋白降解：(i)靶降解识别标签，例如聚泛素标签，和(ii)与该降解识别标签紧邻的非结构化氨基酸序列。为了对蛋白质进行降解决定子标记，特别是在本文中对酶进行降解决定子标记，本领域技术人员可以参考Yu等人(2015,Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)、Cho等人(2010,Genes&Development,Vol.24:438-442)，或参考Fortmann等人(2015,J Mol Biol,Vol.427(17):2748-2756)、Ravid等人(2008,NatRev Mol Cell Biol,Vol.9(9):679-690)和Hochstrasser(1996,Annu Rev Genet,Vol.30:405-439)。
酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，在本发明的上下文中表示酶催化所需反应的能力。
术语酶的“活性降低”或“活性减弱”是指通过氨基酸序列突变实现蛋白质的比催化活性降低，和/或通过核苷酸序列突变，或通过删除相应的同源基因，或还通过对蛋白质进行降解决定子标记实现细胞中蛋白质的浓度降低。
术语酶的“活性增强”表示例如通过编码酶的基因的过表达实现酶的比催化活性提高和/或细胞中酶的数量/利用率提高。
术语“编码”是指多核苷酸通过转录和翻译的机制生产氨基酸序列的过程。
编码本发明中考虑的酶的基因可以是外源的或内源的。
基因的“衰减”是指基因以比在未修饰的微生物中更慢地速度表达。衰减可以通过本领域技术人员已知的手段和方法来实现，并且包含通过同源重组实现的基因缺失、通过将外部元件插入到基因中的基因衰减或在弱启动子下的基因表达。本领域技术人员知晓表现出不同强度的多种启动子以及哪个启动子用于弱遗传表达。
在本发明中实施的方法优选地需要使用一种或多种染色体整合构建体，用于将异源核苷酸序列稳定地引入到染色体上的特定位置，或者用于在功能上破坏遗传修饰的微生物细胞中的一种或多种靶基因。在一些实施方案中，靶基因的破坏阻止了相关功能蛋白的表达。在一些实施方案中，靶基因的破坏导致被破坏的基因表达非功能蛋白。
在本发明的实践中可以改变的染色体整合构建体的参数包括但不限于同源序列的长度；同源序列的核苷酸序列；整合序列的长度；整合序列的核苷酸序列；和靶基因座的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个同源序列的长度的有效范围是20至5,000个碱基对，优选50至100个碱基对。在特定的实施方案中，每个同源序列的长度为约50个碱基对。有关基因靶向所需的同源性长度的更多信息，请参见D.Burke等人,Methods in yeastGenetics–A cold spring harbor laboratory course Manual(2000)。
在一些实施方案中，打算插入上述DNA构建体的被破坏的基因可以有利地包含一种或多种用于选择转化的微生物细胞的选择标记。优选地，所述选择标记包含在根据本发明的DNA构建体中。
在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性标记。抗生素抗性标记的说明性实例包括但不限于NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>和SH BLE基因产物。来自诺尔斯式链霉菌(S.noursei)的NAT 1基因产物赋予了对诺尔丝菌素(nourseothricin)的抗性；来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的AURl-C基因产物赋予了对Auerobasidin A(AbA)的抗性；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的HPH基因产物赋予了对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸作为唯一氮源的平板上生长；Tn903转座子的KAN<R>基因赋予了对G418的抗性；印度斯坦链异壁链霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的SH BLE基因产物赋予了对Zeocin(博来霉素)的抗性。
在一些实施方案中，在分离出本发明的遗传修饰的微生物细胞之后，删除抗生素抗性标记。本领域技术人员能够在特定的遗传背景下选择合适的标记。
在一些实施方案中，选择标记拯救了遗传修饰的微生物细胞中的营养缺陷型(例如营养性营养缺陷型)。在这样的实施方案中，亲本微生物细胞在一种或多种在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的基因产物(例如酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET 15、TRP1、ADE2和URA3基因产物)中包含功能性破坏，这使得亲本微生物细胞无法在不添加一种或多种营养物质(营养缺陷表型)的培养基中生长。然后可以通过用编码被破坏的基因产物的功能性拷贝(NB：基因的功能性拷贝可以源自近缘种，例如克鲁维酵母(Kluveromyces)、念珠菌(Candida)等)的染色体整合体转化亲本微生物细胞来拯救营养缺陷表型，并可以根据亲本微生物细胞的营养缺陷表型的损失来选择所产生的遗传修饰微生物细胞。
对于包含启动子序列、编码序列(例如酶编码序列)或终止子序列的每个核酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考核酸序列具有特定百分比的核酸同一性的核酸序列。
对于每一个或多个目的氨基酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考氨基酸序列具有特定百分比的氨基酸同一性的氨基酸序列(例如酶氨基酸序列)。
由于明显的原因，在整个本说明书中，分别符合所考虑的核苷酸或氨基酸同一性的特定核酸序列或特定氨基酸序列应进一步导致获得显示出所需生物活性的蛋白质(或酶)。如本文所用，两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较窗口来比较两条最佳比对的序列来确定的。
因此，与参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的核苷酸或氨基酸序列部分可以包括添加或缺失(例如“空位”)，以获得两个序列之间的最佳比对。
通过如下方法计算同一性百分比：确定可以注释两条比较序列为相同核酸碱基或相同氨基酸残基的位置数，然后将在两个核酸碱基之间或在两个氨基酸残基之间均可观察到同一性的位置数除以比较窗口中的总位置数，然后将结果乘以100，得到两条序列之间的核苷酸同一性百分比或两条序列之间的氨基酸同一性百分比。
序列最佳比对的比较可以使用已知算法由计算机来执行。
最优选地，使用CLUSTAL W软件(版本1.82)确定序列同一性百分比，参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝"全长"；(3)OUTPUT FORMAT＝"aln w/数目"；(4)OUTPUT ORDER＝"对齐的"；(5)COLOR ALIGNMENT＝"否"；(6)KTUP(字长)＝"默认"；(7)WINDOW LENGTH＝"默认"；(8)SCORE TYPE＝"百分比"；(9)TOPDIAG＝"默认"；(10)PAIRGAP＝"默认"；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝"无"；(12)MATRIX＝"默认"；(13)GAP OPEN＝"默认"；(14)END GAPS＝"默认"；(15)GAP EXTENSION＝"默认"；(16)GAPDISTANCES＝"默认"；(17)TREE TYPE＝"分支图"和(18)TREE GRAP DISTANCES＝"隐藏"。
“发酵”或“培养”通常在发酵罐中进行，发酵罐含有适合于所培养微生物的合适的培养基，该培养基含有至少一种简单碳源，和共底物(必要的话)。
本文公开的微生物可以在发酵培养基中生长以从草酰乙酸(oxaloacetate)生产产物。为了最大程度地生产甲硫氨酸，用作生产宿主的微生物株优选具有高的碳水化合物利用率。这些特征可以通过诱变和选择、基因工程改造来赋予，或者可以是天然的。用于本细胞的发酵培养基或“培养基”可包含至少约10g/L的葡萄糖。另外的碳底物可以包括但不限于单糖，例如果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如乳糖麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透玉米浆、甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可包括甘油。
因此，预期本发明中使用的碳源可以涵盖各种各样的含碳底物，并且仅受生物选择的限制。
尽管预期所有上述碳底物及其混合物均适用于本发明，但是对于被改造为使用C5糖(更特别是葡萄糖)的微生物，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。
优选的碳底物是葡萄糖。
除了合适的碳源外，发酵培养基还可以包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适合于培养物的生长和促进生产所需产物所必需的酶促途径的其他组分。
此外，可以考虑适合于根据本发明的重组微生物的生长的其他遗传修饰。
术语“需氧条件”是指培养基中的氧浓度足以使需氧或兼性厌氧微生物使用双氧(di-oxygene)作为末端电子受体。
“微需氧条件”是指其中氧浓度低于空气中的氧浓度(即氧浓度多达6％-O2)的培养基。
“合适的培养基”是指包含对细胞的维持和/或生长必不可少或有益的营养物质的培养基(例如无菌液体培养基)，所述营养物质例如碳源或碳底物、氮源，例如胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸一钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子，例如氨基酸、维生素、生长促进剂等。根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”是指可以被本领域技术人员使用用来支持微生物正常生长的任何碳源，包括己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、寡糖、二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、纤维素、半纤维素及其组合。
根据本发明，“甲硫氨酸的衍生物”是可以由甲硫氨酸在被本发明的生产甲硫氨酸的微生物中(特别是本发明的生产甲硫氨酸的酵母中)天然和/或人工存在的酶修饰后获得的化合物。
这种甲硫氨酸的衍生物的实例可以是例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)或2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)。
根据本发明引入的遗传修饰的一般特征
-基因因两种非互斥的修饰而过表达：
·将它们置于强启动子控制之下；和/或
·插入所考虑的基因的多个拷贝。
-所有基因组修饰均根据已知的遗传工程技术插入到酵母中：
-根据本发明的酵母基因组中引入的基因构建体中所包括的连续基因具有以下结构：
Prom1-ORF1-term1-ORF2-gene2-term2-…/…-Promn-ORFn-termn，其中：
-Prom1是调节编码序列(ORF1)的表达的序列，
-ORF1是编码所需蛋白质PROT1(尤其是所需酶PROT1)的核酸序列，
-Term1是转录终止子序列，其通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，这些信号触发了从转录复合物中释放mRNA的过程，并且
-“1”、“2”、.../...“n”可以描述或可以不描述相同的ORF(开放阅读框)、启动子或终止子。基因的顺序无关紧要，“n”是通常在5到20之间的整数。这些构建体被插入在酵母染色体之一中的受控位置。在一些实施方案中，插入位点对于被插入的构建体的功能或对于所得的遗传修饰的酵母的生存力不是必需的。
-当酵母是例如酿酒酵母时，通常将引入到酵母基因组中的、源自酿酒酵母以外的其他生物体的基因进行“转码”(通常将其进行密码子优化)，这意味着这些基因是以表达酿酒酵母的最佳密码子用法合成的。来自酿酒酵母的一些基因的核苷酸序列(而不是蛋白质序列)也已被修饰(“转码”)以使与所述基因的内源性拷贝的重组最小化。
-可以通过酵母遗传工程化中使用的标准方法删除基因。在一些实施方案中，可以通过插入上述基因构建体之一而中断靶向删除的基因，或者，用一小段核苷酸取代靶向删除的基因。
-可以通过如下方法下调基因表达：破坏基因的内源性拷贝并用处于弱启动子的控制之下的ORF的拷贝替代它。弱启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。
-可以通过如下方法使基因“可诱导或可抑制”：删除基因的内源性拷贝(如果需要的话)并将新的ORF的拷贝置于诱导型或抑制型启动子的控制之下。诱导型或抑制型启动子是在环境条件改变或外部刺激时其活性被调节和控制(即增加或降低)的启动子。诱导或抑制可以是人为控制的，其涵盖通过非生物因素，例如目标生物体中非天然存在的化合物、光、氧水平、热或冷，进行诱导或抑制。诱导型或抑制型启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。
-如已在本文其他地方规定的，可以通过使用Yu等人2015,(Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)中描述的“降解决定子”技术，通过去稳定化，使蛋白质低表达。简而言之，该技术在于在蛋白质序列中引入将蛋白质靶向降解的修饰。它可以仅包含两个首要氨基酸，遵循被称为N-末端规则的原则，或包含一个更大的序列，其将整个蛋白质靶向泛素-蛋白酶体(ubiquitin-preoteasome)降解途径。
根据本发明的重组酵母
发明人已经构思了重组微生物，尤其是重组酵母，其生产甲硫氨酸和/或其衍生物的能力提高。
本发明涉及甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产提高的重组酵母，其中甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产提高是通过由基因工程方法引入到其基因组中的多种改变而获得的。
本发明涉及生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母，在其基因组中：
(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)至少一种编码天冬氨酸激酶HOM3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(C)(i)a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码甲硫氨酸合酶MET17的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或
(ii)a)至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1CGS1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
发明人已经发现，酵母细胞的提高的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产可以通过在这些酵母细胞的基因组中引入多种遗传改变来达到。如本文中充分描述的，所述多种遗传改变涵盖某些基因的过表达、某些其他基因的受控表达以及另外的其他基因的抑制或缺失。
发明人已经通过以下方法实现了酵母细胞的提高甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产：优化草酰乙酸的代谢，从而使随后的人工修饰的代谢途径主要导向甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产，而同时维持所得遗传修饰的酵母细胞的最佳生存力。
在漫长的研究时间之后，本发明人已经确定，通过如下方法获得酵母细胞的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的高生产：增加草酰乙酸向连续中间代谢物磷酸-天冬氨酰、天冬氨酰-半醛和高丝氨酸的转化，并另外提高高丝氨酸向甲硫氨酸的转化，同时尤其重要的是，保持氧化还原状态，从而使所得重组酵母细胞具有良好的生存力。最后一点很重要，在整个研究工作中对发明人构成了重大挑战。
根据本发明提出的解决方案出乎意料地使得能够通过消耗较少的还原力，消耗NADH形式而不是NADPH形式的还原力，和/或生产NADH而不是NADPH，在酵母细胞中在整个甲硫氨酸生产途径中维持可行的NADH/NADPH平衡。
如本说明书中详细公开的，所得重组酵母细胞被遗传修饰，以(I)实现天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因(HOM2)的过表达和/或受控表达，以及(II)实现天冬氨酸激酶编码基因(HOM3)的受控表达。
此外，在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述酵母包含另外的遗传修饰，以使中间代谢物天冬氨酰-半醛最佳地用于甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产，所述另外的遗传修饰包括(i)高丝氨酸O-乙酰基转移酶编码基因(MET2；METX)和(ii)甲硫氨酸合酶(MET17)的过表达。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述酵母包含可选的另外的遗传修饰，以使中间代谢物天冬氨酰-半醛最佳地用于甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产，所述另外的遗传修饰包括(i)高丝氨酸激酶编码基因(THR1)的过表达和(ii)具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1(CGS1)的过表达。
因此，本发明涉及生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母，其基因组已被改变以：
(A)过表达天冬氨酸-半醛脱氢酶和/或使其处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，
(B)控制天冬氨酸激酶的表达，以及
(C)通过以下方法增加由天冬氨酰-半醛生产甲硫氨酸：
(i)使(a)高丝氨酸-O-乙酰基转移酶和(b)甲硫氨酸合酶过表达和/或将其置于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)(a)使高丝氨酸激酶和(b)具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1过表达和/或将其置于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
与不包含上述遗传修饰的亲本酵母相比，本发明的重组酵母生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的产率更高。此外，本发明的重组酵母不需要硫酸盐来生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物，而是通过使用还原硫源，例如甲硫醇(MeSH)、甲硫醇钠(MeSNa)或二甲硫醚(MeSMe)来生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物。使用还原形式的硫(SH)而不是例如硫酸盐(SO4)可以有利地减少NADPH的消耗。而且，使用MeSH、MeSNa或MeSMe(特别是MeSH)来合成甲硫氨酸具有双重优势，其不仅是还原硫的来源，而且还是重要的甲基来源。这有利地允许直接从乙酰-高丝氨酸(或从磷酸高丝氨酸)获得甲硫氨酸，并且不需要经历胱硫醚(cystationine)或高半胱氨酸的生产。
此外，本发明的重组酵母已经进行了遗传工程改造，以便促进利用NADH而非NADPH的酶的表达，例如合适的谷氨酸脱氢酶或合适的天冬氨酸半醛脱氢酶。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，过表达的天冬氨酸-半醛脱氢酶(HOM2)由被置于强启动子和/或诱导型或抑制型启动子的控制之下的酿酒酵母内源基因组成。
在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶优选由酿酒酵母HOM2基因编码。
在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶最优选地由酿酒酵母HOM2基因的变体编码，该基因编码使用NAD和NADP的突变的HOM2蛋白，如本文的实施例所示。这种基因变体例如在实施例中说明，并称为HOM2-1。它对应于如下文所述突变的酿酒酵母HOM2基因。
以放宽HOM2对于NADP作为辅酶的高选择性并增强该酶对NAD的亲和力为目的的、针对天冬氨酸-半醛脱氢酶变体中的几个氨基酸残基的突变的性质，是本领域技术人员已知的并且可以例如见于Faehnle,C.R.等人,Journal of Molecular Biology 1055–1068(2005)。特别地，可以提及突变S39至E39，其对应于核苷酸序列的第115至117位的核苷酸TCT替换为核苷酸GAG。
根据本领域技术人员熟知的氨基酸命名法，S代表丝氨酸，E代表谷氨酸。
在一些实施方案中，天冬氨酸激酶(HOM3)最优选地由酿酒酵母HOM3基因编码，如本文的实施例所示。
此外，通过将编码天冬氨酸激酶的核酸置于诱导型或抑制型启动子的控制之下，可以实现天冬氨酸激酶表达的受控表达。可用于获得本发明的生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母的示例性诱导型或抑制型启动子在本说明书的其他地方描述。
说明性地，在其中所述诱导型或抑制型启动子是源自酿酒酵母的pCUP1-1启动子的实施方案中，可以通过向培养基中添加铜来诱导天冬氨酸激酶的表达。本领域技术人员可以特别参考Koller等人(2000,Yeast,Vol.16:651-656)。
重组酵母的实施方案“(C)-(i)”
如本文先前已经规定的，根据本发明的重组酵母的实施方案“(C)-(i)”，存在(a)高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2和/或METX)的过表达和(b)甲硫氨酸合酶(MET17)的过表达。
在一些实施方案中，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶最优选地由酿酒酵母MET2-基因编码，如本文的实施例中所公开。
在一些实施方案中，甲硫氨酸合酶最优选地由酿酒酵母MET17-基因编码，如本文的实施例中所公开的。
重组酵母的实施方案“(C)-(ii)”
如本文先前已经规定的，根据本发明的重组酵母的实施方案“(C)-(ii)”，存在(a)高丝氨酸激酶(THR1)的过表达和(b)编码具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1(CGS1)的外源核酸的插入。
在一些实施方案中，高丝氨酸激酶最优选地由酿酒酵母THR1-基因编码，如本文的实施例中所公开。
在一些实施方案中，胱硫醚γ-合酶1最优选地由拟南芥(Arabidopsisthaliana)CGS1-基因编码，如下文所讨论并且在本文的实施例中公开的。
为了获得本发明的重组酵母而引入的遗传修饰的特征在下文进一步详述。
在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母可以包含根据实施方案“(C)-(i)”和根据实施方案“(C)-(ii)”的修饰。
天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸-半醛脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可以促进中间代谢物天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)向天冬氨酰-半醛的转化。当至少一种天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶可以是使用NADH或NADPH来催化天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)转化为天冬氨酰-半醛的酶变体。
在一些优选的实施方案中，所述天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的HOM2基因，或者，是利用NADH和NADPH两者的HOM2的变体，如本文的实施例中所示和先前讨论的。
在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因置于强启动子pADH1、强启动子pTEF1、诱导型或抑制型启动子pCUP1-1或诱导型或抑制型启动子pACU8的控制之下。
说明性地，可以将HOM2基因插入在HOM3基因内和/或PYK2基因内和/或MUP3基因内和/或SAM1基因内和/或SAM2基因内，如本文实施例所示。
天冬氨酸激酶编码基因的受控表达
本发明所涵盖的天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，通过控制天冬氨酸激酶编码基因的表达，可以控制天冬氨酸向天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)的转化水平，这将有助于本发明的重组酵母的高生存力水平。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，天冬氨酸激酶编码基因的受控表达是通过如下方法获得的：在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒，所述天冬氨酸激酶编码序列被置于诱导型调控元件(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下。
在一些实施方案中，天冬氨酸激酶编码基因的受控表达是通过如下方法获得的：在天然酵母天冬氨酸激酶开放阅读框的位置插入诱导型调控序列，例如诱导型或抑制型启动子，其取代最初存在于酵母基因组中该基因组位置上的内源启动子。
在一些优选的实施方案中，所述天冬氨酸激酶编码基因是来自酿酒酵母的HOM3基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸激酶编码基因置于诱导型或抑制型启动子pCUP-1-1、诱导型或抑制型启动子pSAM4或诱导型或抑制型启动子pACU3p的控制之下。
说明性地，可以将HOM3基因插入在TRP1基因内和/或HOM3基因内和/或MUP3基因内和/或SAM3基因内，如本文实施例所示。
高丝氨酸转化为甲硫氨酸的改良途径的最先的实施方案
根据本发明的重组酵母的这些实施方案，所述酵母包含另外的遗传修饰，以使中间代谢物天冬氨酰-半醛最佳地用于甲硫氨酸的生产，所述另外的遗传修饰包括(i)高丝氨酸O-乙酰基转移酶编码基因(MET2或METX)和(ii)甲硫氨酸合酶(MET17，也称为MET25或MET15)的过表达，和/或这些基因的受控表达。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组是这样的：
a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，
和/或
至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码O-乙酰高丝氨酸-O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶MET17的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶和高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸-O-乙酰基转移酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，在乙酰辅酶A存在下，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的过表达会增加中间代谢物高丝氨酸向O-乙酰基高丝氨酸的转化水平。当至少一种高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在优选的实施方案中，所述高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，所述高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因是来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的METX基因，如本文实施例中所示。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的重组酵母包含至少一种高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因，其是来自酿酒酵母的基因，和至少一种高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因，其是来自谷氨酸棒状杆菌的METX基因。
在优选的实施方案中，将所述高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因置于(如果存在多个拷贝，则将所述基因的每个拷贝独立地置于)强启动子例如pPDC1、pTDH3、pADH1、pCCW12、pENO2或pTEF3，或强诱导型或抑制型启动子例如pCUP1、pCUP1-1或pSAM4的控制之下。
说明性地，可以将高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2/METX基因插入在HOM3基因内和/或MAE1基因内和/或MUP3基因内和/或URA3基因内和/或LYP1基因内，如本文实施例所示。
甲硫氨酸合酶编码基因过表达或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，甲硫氨酸合酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含甲硫氨酸合酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的甲硫氨酸合酶和甲硫氨酸合酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含甲硫氨酸合酶编码序列的表达盒包含允许甲硫氨酸合酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种甲硫氨酸合酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，甲硫氨酸合酶的过表达会增加中间代谢物O-乙酰高丝氨酸向甲硫氨酸的转化。当至少一种甲硫氨酸合酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在优选的实施方案中，所述甲硫氨酸合酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。在本领域中以及在本说明书的某些位置中，MET17也可以称为MET25或MET15。
在优选的实施方案中，所述甲硫氨酸合酶编码基因是来自帕氏鲁杰氏菌(Ruegeria pomeroyi)的基因。
在优选的实施方案中，将所述甲硫氨酸合酶编码基因置于强启动子pTEF3、pCUP1、pCUP1-1或pENO2的控制下。
说明性地，可以将甲硫氨酸合酶基因插入在URA3基因内、HOM3基因内和/或MAE1基因内和/或MUP3基因内和/或GNP1基因内和/或LYP1基因内，如本文实施例所示。
高丝氨酸转化为甲硫氨酸的改良途径的其次的实施方案
根据本发明的重组酵母的这些实施方案，所述酵母替代性地或补充性地包含另外的遗传修饰，以使中间代谢物天冬氨酰-半醛最佳地用于甲硫氨酸的生产，所述另外的遗传修饰包括(i)高丝氨酸激酶编码基因(THR1)的过表达和(ii)胱硫醚γ-合酶1(CGS1)的过表达，和/或这些基因的受控表达。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
高丝氨酸激酶编码基因过表达或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，高丝氨酸激酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸激酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的高丝氨酸激酶和高丝氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸激酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸激酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种高丝氨酸激酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，高丝氨酸激酶的过表达会增加中间代谢物向磷酸高丝氨酸的转化。当至少一种高丝氨酸激酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在优选的实施方案中，所述高丝氨酸激酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，将所述高丝氨酸激酶编码基因置于强启动子pTDH3或诱导型或抑制型启动子pACU6的控制之下。
说明性地，可以将高丝氨酸激酶基因插入在SAM3基因内，如本文实施例所示。
胱硫醚γ合酶1编码基因过表达或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，胱硫醚γ合酶1编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含胱硫醚γ合酶1编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的胱硫醚γ合酶1和胱硫醚γ合酶1编码基因在本说明书的其他地方详述。
如前所述，本发明的该胱硫醚γ合酶1具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含胱硫醚γ合酶1编码序列的表达盒包含允许胱硫醚γ合酶1强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种胱硫醚γ合酶1编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，胱硫醚γ合酶1的过表达会增加中间代谢物磷酸-高丝氨酸向甲硫氨酸的转化。当至少一种胱硫醚γ合酶1编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
在优选的实施方案中，所述胱硫醚γ合酶1编码基因是来自拟南芥的基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，胱硫醚γ合酶1包含突变，该突变减轻了S-腺苷甲硫氨酸对CGS1施加的翻译抑制作用(Onoue等人Journal of Biological Chemistry 286(2011),14903-149 1)。这种突变的CGS1特别地如申请WO 2014064244中所公开。
在优选的实施方案中，将所述胱硫醚γ合酶1编码基因置于强启动子pCCW12或强诱导型或抑制型启动子pCUP1-1的控制之下。
说明性地，可以将胱硫醚γ合酶1基因插入在SAM3基因内，如本文实施例所示。
编码(i)天冬氨酸半醛脱氢酶、(ii)天冬氨酸激酶、(iii)高丝氨酸O-乙酰基转移酶、(iv)甲硫氨酸合酶、(v)高丝氨酸激酶和(vi)胱硫醚γ合酶1的基因的描述见下文。
天冬氨酸-半醛脱氢酶(HOM2)
天冬氨酸-半醛脱氢酶是本领域已知能够催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化、NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸-半醛脱氢酶可以称为HOM2。
用于测量天冬氨酸-半醛脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
本说明书中优选的天冬氨酸半醛-脱氢酶是EC号为1.2.1.11的酶。
根据一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些优选的实施方案中，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据另一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是来自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶的变体或突变体，其中所述变体酶或所述突变体酶使用NADH或NADPH来催化反应。这样的变体或突变体酶是本领域已知的，并且在本文之前已有讨论。
根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的参考核酸序列组成的组的核酸具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸编码源自酵母菌属的天冬氨酸-半醛脱氢酶，其在本文中也可以统称为HOM2。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化而NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010442，或本文描述的SEQ ID NO.3。
根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Lactobacillus wasatchensis的天冬氨酸-半醛脱氢酶与SEQ ID NO.3的天冬氨酸-半醛脱氢酶具有27％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化而NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中天冬氨酸-半醛脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，天冬氨酸-半醛脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列。
在其他实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列。
天冬氨酸激酶(HOM3)
天冬氨酸激酶是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下催化L-天冬氨酸向4-磷酸-L-天冬氨酸转化的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸激酶可以称为HOM3。
用于测量天冬氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Stadtman等人(1961,J Biol Chem,Vol.236(7):2033-2038)描述的方法。
本说明书中优选的天冬氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.2.4的酶。
根据一个优选的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酵母。在一些其他优选的实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：4的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：4的核酸编码源自酵母菌属的天冬氨酸激酶，其也可以称为HOM3。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶在ATP的存在下催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010972，或本文描述的SEQ ID NO.5。
根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的天冬氨酸激酶与SEQ ID NO.5的天冬氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，在ATP的存在下催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中天冬氨酸激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸激酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制天冬氨酸激酶的强表达。
在优选的实施方案中，控制天冬氨酸激酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码天冬氨酸激酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。
高丝氨酸O-乙酰基转移酶(MET2；METX)
高丝氨酸O-乙酰基转移酶是在本领域中被描述为用于催化乙酰辅酶A和L-高丝氨酸之间的反应以生成CoA和O-乙酰基-L-高丝氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸O-乙酰基转移酶可以称为MET2。
用于测量高丝氨酸O-乙酰基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Shuzo Yamagata(1987,The Journalof Bacteriology,Vol.169(8):3458-3463)描述的方法。
本说明书中优选的高丝氨酸O-乙酰基转移酶是EC号为n°EC 2.3.1.31的酶。
根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自谷氨酸棒状杆菌和酵母。在一些其他优选的实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
在一个具体的实施方案中，编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸是来自细菌的核酸，特别是来自独立地选自由以下组成的组的细菌的核酸：谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilius influenza)、淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
根据又一个优选的实施方案，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：6的核酸具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：6的核酸编码源自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其也可以称为MET2。源自谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸O-乙酰基转移酶通常被称为METX。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化乙酰辅酶A和L-高丝氨酸之间的反应以生成辅酶A和O-乙酰基-L-高丝氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014122，或本文描述的SEQ ID NO.7。
根据另一个特定的实施方案，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的高丝氨酸O-乙酰基转移酶与SEQ ID NO.7的高丝氨酸O-乙酰基转移酶具有27％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化乙酰辅酶A和L-高丝氨酸之间的反应以生成辅酶A和O-乙酰基-L-高丝氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中高丝氨酸O-乙酰基转移酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸O-乙酰基转移酶编码序列。
在其他实施方案中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸O-乙酰基转移酶编码序列。
甲硫氨酸合酶(MET17)
甲硫氨酸合酶是在本领域中被描述为用于在甲硫醇的存在下催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为甲硫氨酸和乙酸的蛋白质。甲硫氨酸合酶在本领域中还被描述为用于催化OAH转化为高半胱氨酸或催化O-乙酰丝氨酸(OAS)转化为半胱氨酸。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶可以称为MET17。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶在本领域中也可以称为MET25或MET15。
用于测量甲硫氨酸合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ravanel(1995,Archives ofBiochemistry and Biophysics,Vol.316:572-584)描述的方法。
本说明书中优选的甲硫氨酸合酶是EC号为n°2.5.1.49的酶。
根据一个优选的实施方案，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自酵母，特别是选自酿酒酵母。
根据又一个优选的实施方案，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：8的核酸具有至少47％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：8的核酸编码源自酿酒酵母的甲硫氨酸合酶，其也可以称为MET17。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶在甲硫醇的存在下催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为甲硫氨酸和乙酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少47％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的甲硫氨酸合酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013406，或本文描述的SEQ ID NO.9。
根据另一个特定的实施方案，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少47％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性的序列。说明性地，源自植物乳球菌(Lactococcusplantarum)的甲硫氨酸合酶与SEQ ID NO.9的甲硫氨酸合酶具有47％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，在甲硫醇的存在下催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为甲硫氨酸和乙酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少47％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中甲硫氨酸合酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述甲硫氨酸合酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，甲硫氨酸合酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，甲硫氨酸合酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，甲硫氨酸合酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的甲硫氨酸合酶编码序列。
高丝氨酸激酶(THR1)
高丝氨酸激酶是在本领域中被描述为用于催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化成为磷酸L-高丝氨酸(L-homoserine phosphate)的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸激酶可以称为THR1。
用于测量高丝氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Mannhaupt和Feldmann(1990,Eur JBiochem,Vol.191:115-122)描述的方法。
本说明书中优选的高丝氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.1.39的酶。
根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些其他优选的实施方案中，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：10的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：10的核酸编码源自酵母菌属的高丝氨酸激酶，其也可以称为THR1。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化，成为磷酸L-高丝氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP011890，或本文描述的SEQ ID NO.11。
根据另一个特定的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的高丝氨酸激酶与SEQ ID NO.11的高丝氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化，成为磷酸L-高丝氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中高丝氨酸激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸激酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，高丝氨酸激酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸激酶编码序列。
在其他实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸激酶编码序列。
胱硫醚γ合酶1(CGS1)
胱硫醚γ合酶1酶是在本领域中被描述为用于催化由高丝氨酸酯和L-半胱氨酸通过γ-置换反应形成L-胱硫醚的蛋白质。由拟南芥基因组编码的胱硫醚γ合酶1可以称为CGS1。
用于测量胱硫醚γ合酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Loizeau等人(2007,PlantPhysiology,Vol.145:491-503)描述的方法。
本说明书中优选的胱硫醚γ合酶1是EC号为n°EC 2.5.1.48的酶。
根据一个优选的实施方案，编码胱硫醚γ合酶1的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码胱硫醚γ合酶1的核酸可以是源自植物的核酸，特别是源自拟南芥的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码胱硫醚γ合酶1的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与UniProt数据库中登录号为NM_110977.3的核酸，特别是具有SEQ ID NO：12(其编码源自拟南芥的胱硫醚γ合酶1，该胱硫醚γ合酶1也可以称为CGS1)的核酸具有至少40％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
在一个特定的实施方案中，编码突变的胱硫醚γ-合酶1CGS1的核酸是属于微生物的核酸，其独立地选自由植物胱硫醚γ合酶1组成的组，并且优选是来自拟南芥的胱硫醚γ合酶1。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化由高丝氨酸酯和L-半胱氨酸通过γ-置换反应形成L-胱硫醚。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少40％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与具有SEQ ID NO：12的核酸的所述参考核酸序列具有至少41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，特别是与SEQID NO：12的核酸序列具有100％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与具有SEQ ID NO：12的核酸的所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，特别是与SEQ ID NO：12的核酸序列具有100％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与具有SEQ ID NO：12的核酸的所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，特别是与SEQ ID NO：12的核酸序列具有100％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自拟南芥的胱硫醚γ合酶1的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP186761，或本文描述的SEQ ID NO.13。
根据另一个特定的实施方案，编码胱硫醚γ合酶1的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：13的氨基酸序列或者与UniProt数据库中登录号为NP186761的氨基酸序列具有至少40％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化由高丝氨酸酯和L-半胱氨酸通过γ-置换反应形成L-胱硫醚的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少40％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：13或者与UniProt数据库中登录号为NP186761的氨基酸序列具有至少41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：13或者与UniProt数据库中登录号为NP186761的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO：13或者与UniProt数据库中登录号为NP186761的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
根据一个优选的实施方案，本申请的重组酵母中使用的胱硫醚γ合酶1可以选自申请WO2014064244中公开的CGS1的突变体，并且特别是该文件的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶。
根据这个特定的实施方案，关于本发明的胱硫醚γ合酶1可以是：
(i)OHPS依赖性甲硫氨酸合酶，其通过取代或缺失选自由以下组成的组的、SEQ IDNO:13中的至少一个氨基酸残基，而衍生自具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的胱硫醚γ合酶1：
(a)脯氨酸10；
(b)天冬酰胺11；
(c)谷氨酰胺15；
(d)异亮氨酸27；
(e)丙氨酸30；
(f)亮氨酸45；
(g)丝氨酸47；
(h)缬氨酸60；
(i)丙氨酸68；
(j)苯丙氨酸150；
(k)苏氨酸178；
(l)天冬氨酸183；
(m)异亮氨酸185；
(n)苏氨酸220；
(o)甲硫氨酸232；
(P)缬氨酸245；
(q)丙氨酸257；
(r)天冬酰胺259；
(s)苯丙氨酸261；(t)苯丙氨酸275；
(u)异亮氨酸287；
(v)组氨酸289；
(w)酪氨酸324；
(x)甘氨酸326；
(y)脯氨酸356；
(z)苏氨酸371；
(aa)缬氨酸396；
(bb)脯氨酸405；
(cc)天冬氨酸431；
(dd)异亮氨酸436；
(ee)异亮氨酸457；
(ff)天冬氨酸459；
(gg)脯氨酸470；
(hh)谷氨酸472；
(ii)丙氨酸506；
(jj)异亮氨酸507。
或者
(ii)OHPS依赖性甲硫氨酸合酶，其通过取代或删除对应于SEQ ID NO：13中以上列出的(a)至(jj)中的任何一个的至少一个氨基酸残基，而衍生自氨基酸序列与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性的胱硫醚γ合酶1。优选地，序列同一性为至少70％，甚至更优选为至少80％，最优选为至少90％。
根据一个实施方案，在本发明的OHPS依赖性甲硫氨酸合酶的氨基酸序列中：
(i)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第10位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被亮氨酸取代；和/或
(ii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第11位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被天冬氨酸取代；和/或
(iii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第15位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被精氨酸取代；和/或
(iv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第27位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(v)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第30位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(vi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第45位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(vii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第47位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(viii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第60位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被天冬氨酸取代；和/或
(ix)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第68位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(x)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第150位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被亮氨酸取代；和/或
(xi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第178位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被异亮氨酸取代；和/或
(xii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第183位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被谷氨酸取代；和/或
(xiii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第185位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被缬氨酸取代；和/或
(xiv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第220位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(xv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第232位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被亮氨酸取代；和/或
(xvi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第245位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丙氨酸取代；和/或
(xvii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第257位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(xviii)在SEQ ID No：13所示的氨基酸序列的第259位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被天冬氨酸或丝氨酸取代；和/或
(xiv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第261位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(xx)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第275位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被亮氨酸取代；和/或
(xxi)在SEQ ID No：13所示的氨基酸序列的第287位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被缬氨酸或苯丙氨酸取代；和/或
(xxii)在SEQ ID No：13所示的氨基酸序列的第289位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被酪氨酸或精氨酸取代；和/或
(xxiii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第324位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苯丙氨酸取代；和/或
(xxiv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第326位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(xxv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第356位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(xxvi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第371位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丙氨酸取代；和/或
(xxvii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第396位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丙氨酸取代；和/或
(xxviii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第405位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(xxix)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第431位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被甘氨酸取代；和/或
(xxx)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第436位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被苏氨酸取代；和/或
(xxxi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第457位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被亮氨酸取代；和/或
(xxxii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第459位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被天冬酰胺取代；和/或
(xxxiii)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第470位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被丝氨酸取代；和/或
(xxxiv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第472位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被甘氨酸取代；和/或
(xxxv)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第506位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被甘氨酸取代；和/或
(xxxvi)在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的第507位或与该位置相对应的位置上的氨基酸残基被缬氨酸取代。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第10、27、60、324和457位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32、287、289和356位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第10、232、245、259、356、431和436位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第11、15、30、45、47、68、178、356、371和459位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32和356位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32、60、324和457位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32、287、289和356位。在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32、232、245、259、356、431和436位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第32、45、47、68、178、356、371和459位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第232、245、259、356、431和436位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第178、356、371和459位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第150、257、259、261、275、289、356和506位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第185、356和405位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、356、396和472位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、326、356和396位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第220、275、356和396位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第83、275、356、396和507位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、287、356、396和507位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、356、396和470位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、356和507位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、356和396位。
在一个实施方案中，发生取代和/或缺失的位置如下：第275、287和356位。
如上所述，本发明中胱硫醚γ合酶1的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述胱硫醚γ合酶1的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，胱硫醚γ合酶1在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，胱硫醚γ合酶1的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，胱硫醚γ合酶1的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的胱硫醚γ合酶1编码序列。
在其他实施方案中，胱硫醚γ合酶1的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的胱硫醚γ合酶1编码序列。
根据一个优选的实施方案，本发明涉及生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母，在其基因组中：
(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)至少一种编码天冬氨酸激酶HOM3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(C)(i)a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸已被过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码O-乙酰高丝氨酸-O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶MET17的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或
(ii)a)至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1 CGS1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母的特定实施方案
天冬氨酸转氨酶过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，至少一种编码天冬氨酸转氨酶(AAT2)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
天冬氨酸转氨酶(也称为天冬氨酸氨基转移酶)是在本领域中被描述为用于催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸(2-oxoglutarate)的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸转氨酶可以称为AAT2。
根据这些实施方案，天冬氨酸转氨酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸转氨酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种天冬氨酸转氨酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，天冬氨酸转氨酶(AAT2)的过表达可能会导致草酰乙酸向天冬氨酸的高水平转化。当至少一种天冬氨酸转氨酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
用于测量天冬氨酸转氨酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Yagi等人(1982,Biochem,Vol.92:35-43)中描述的方法。
在一些实施方案中，所述天冬氨酸转氨酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，天冬氨酸转氨酶由拟南芥AAT2-基因编码。
在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸转氨酶编码基因置于诱导型或抑制型启动子pSAM4或诱导型或抑制型启动子pACU1或强启动子pADH1或强启动子pPGK1或强启动子pTEF3的控制之下。
说明性地，可以将天冬氨酸转氨酶基因插入在TRP1基因内和/或PYK1基因内和/或GNP1基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。
本说明书中优选的天冬氨酸转氨酶通过EC号2.6.1.1已知。
编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些优选的实施方案中，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自酵母生物的核酸，最优选地是酿酒酵母。
根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸转氨酶或AAT2的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：14的核酸序列具有至少39％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少39％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的天冬氨酸转氨酶AAT2的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013127，或本文描述的SEQ ID NO.15。说明性地，源自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶与SEQ ID NO.15的天冬氨酸转氨酶AAT2具有39％的氨基酸同一性。
根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少39％，有利地至少65％，优选至少80％同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少39％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中天冬氨酸转氨酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸转氨酶的核酸序列的5'和3'位置。
在本发明的一个实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码天冬氨酸转氨酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一些实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列。
在其他实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列。
谷氨酸脱氢酶过表达和/或受控表达
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，至少一种编码谷氨酸脱氢酶编码基因(或NAD特异性谷氨酸脱氢酶)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
谷氨酸脱氢酶(也称为NAD特异性谷氨酸脱氢酶)是在本领域中被描述为用于催化2-氧代戊二酸的转化以产生L-谷氨酸的蛋白质。因此，谷氨酸脱氢酶是特异性地参与涉及在NADH存在下将2-氧代戊二酸转化为L-谷氨酸的化学反应的酶。
根据这些实施方案，谷氨酸脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许谷氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种谷氨酸脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，谷氨酸脱氢酶的过表达同时产生NAD(通过将氧代戊二酸转化为谷氨酸)。当至少一种谷氨酸脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。
用于测量谷氨酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Noor和Punekar(2005,Microbiology,Vol.151:1409-1419)中描述的方法。
在优选的实施方案中，所述谷氨酸脱氢酶编码基因编码利用NADH而非NADPH的谷氨酸脱氢酶，并且更特别地是来自尖尾内旋纤毛虫(Entodinium caudatum)的GDH基因(GDH.eCa)，如本文实施例中所示。
本说明书中优选的谷氨酸脱氢酶可以特别是EC号为n°EC 1.4.1.2的酶。
在优选的实施方案中，将所述谷氨酸脱氢酶编码基因置于强启动子pTDH3的控制之下。
说明性地，可以将GDH基因插入在TRP1基因内，如本文实施例中所示，和/或HIS3基因内和/或SAM3基因内。
根据一个优选的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自尖尾内旋纤毛虫、枯草芽孢杆菌、共生梭菌(Clostridiumsymbiosium)。
根据又一个优选的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：16的核酸序列具有至少49％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO.16的核酸编码源自尖尾内旋纤毛虫的谷氨酸脱氢酶，对所述核酸序列进行了密码子优化，以在酵母，特别是在酿酒酵母中表达。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化2-氧代戊二酸转化以生产L-谷氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自尖尾内旋纤毛虫的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AAF15393，或参考本文描述的SEQ ID NO.17。说明性地，源自肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinalis)的谷氨酸脱氢酶与SEQ ID NO.17的谷氨酸脱氢酶具有49％的氨基酸同一性。
根据另一个特定的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少49％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化2-氧代戊二酸转化以生产L-谷氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中谷氨酸脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述谷氨酸脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。
如本说明书中其他地方所规定的，谷氨酸脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达。
在一些实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列。
在其他实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列。
高丝氨酸脱氢酶的过表达
在根据本发明的生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母的一些实施方案中，所述酵母被进一步定义为在其基因组中至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，高丝氨酸脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，高丝氨酸脱氢酶的过表达会增加中间代谢物天冬氨酰-半醛向高丝氨酸的转化。
在一些实施方案中，使用源自酵母的高丝氨酸脱氢酶，例如来自酿酒酵母的HOM6编码基因。在一些实施方案中，在酵母基因组中引入了HOM6编码基因的多个拷贝。在一些实施方案中，尤其是在其中存在HOM6编码基因的唯一一个拷贝的实施方案中，所述HOM6编码基因被置于强启动子的控制之下。
在优选的实施方案中，所述高丝氨酸脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的HOM6基因，如本文实施例中所示。
在优选的实施方案中，将所述高丝氨酸脱氢酶编码基因置于强启动子pRPLA1或强启动子pADH1的控制之下。
说明性地，可以将高丝氨酸脱氢酶基因插入在HOM3基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。
根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。
根据又一个优选的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：18的核酸具有至少31％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：18的核酸编码源自酵母菌属的高丝氨酸脱氢酶，其也可以称为HOM6。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化中间代谢物天冬氨酰-半醛转化为高丝氨酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少31％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:18的核酸序列具有至少32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:18的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:18的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于来自酿酒酵母的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AJR75529或NP012673，或本文描述的SEQ ID NO.19。
根据另一个特定的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少31％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的高丝氨酸脱氢酶与SEQ ID NO.19的高丝氨酸脱氢酶具有31％的氨基酸同一性。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化中间代谢物天冬氨酰-半醛转化为高丝氨酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少31％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如上所述，本发明中高丝氨酸脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。
在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。
在一些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。
在一些其他实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸脱氢酶编码序列。
在其他实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸脱氢酶编码序列。
S-腺苷甲硫氨酸合酶1和2基因的低表达
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为低表达以下基因：(i)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶1(在本文中也称为SAM1)的基因、(ii)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶2(在本文中也称为SAM2)的基因或(iii)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶1的基因和编码S-腺苷甲硫氨酸合酶2的基因两者。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的酵母的基因组另外是这样的，其中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的内源性核酸已被删除，或者
(ii)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
SAM1是来自酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合酶1。对于SAM1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010790。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180810。
SAM2是来自酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合酶2。对于SAM2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013281。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_00118082067。
不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，任何的SAM1基因、SAM2基因或两者的低表达将通过减少由于所产生的甲硫氨酸转化为S-腺苷-甲硫氨酸而导致的其消耗来增加重组酵母的甲硫氨酸生产。
关于SAM1和SAM2，这些基因的低表达包括它们的表达的完全抑制，例如通过中断或删除SAM1、SAM2或SAM1和SAM2两者。
在一些实施方案中，SAM1、SAM2或SAM1和SAM2两者的低表达可以为条件性的，例如通过使该(这些)基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于SAM1和SAM2，低表达还涵盖插入编码不稳定的SAM1的核酸，或插入编码不稳定的SAM2的核酸，或两者。
不稳定的SAM1或SAM2分别是SAM1或SAM2的变体，与亲本SAM1或SAM2相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的SAM1由降解决定子标记的SAM1蛋白组成。
在优选的实施方案中，不稳定的SAM2由降解决定子标记的SAM2蛋白组成。
如实施例中所示，SAM1基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除(也可以称为失活)。
胱硫醚γ-裂解酶基因的低表达
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为其编码胱硫醚γ-裂解酶(在本文中也可以称为CYS3)的基因低表达。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码胱硫醚γ-裂解酶CYS3的核酸独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
CYS3是来自酿酒酵母的胱硫醚γ-裂解酶。对于CYS3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009390。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178157。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任何CYS3基因的低表达将减少所生产的甲硫氨酸向半胱氨酸合成的消耗。
关于CYS3，该基因的低表达包括其表达的完全抑制，例如通过中断或删除CYS3。
在一些实施方案中，例如可以通过使CYS3基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使CYS3的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于CYS3，低表达还涵盖插入编码不稳定的CYS3的核酸或插入编码不稳定的CYS3的核酸，或两者。
不稳定的CYS3是CYS3的变体，与亲本CYS3相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的CYS3由降解决定子标记的CYS3蛋白组成。
胱硫醚β-合酶基因的低表达
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为其编码胱硫醚β-合酶(在本文中也可以称为CYS4)的基因低表达。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码胱硫醚β-合酶CYS4的核酸独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
CYS4是来自酿酒酵母的胱硫醚β-合酶。对于CYS4的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011671。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181284。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任何胱硫醚β-合酶基因的低表达都将减少所生产的甲硫氨酸向半胱氨酸合成的消耗。
关于胱硫醚β-合酶，该基因的低表达包括其表达的完全抑制，例如通过中断或删除胱硫醚β-合酶。
在一些实施方案中，例如可以通过使胱硫醚β-合酶基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使胱硫醚β-合酶的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于胱硫醚β-合酶，低表达还涵盖插入编码不稳定的胱硫醚β-合酶的核酸或插入编码不稳定的胱硫醚β-合酶的核酸，或两者。
不稳定的胱硫醚β-合酶是胱硫醚β-合酶的变体，与亲本胱硫醚β-合酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的胱硫醚β-合酶由降解决定子标记的胱硫醚β-合酶蛋白组成。
芳香族氨基转移酶I基因(Aro8)和胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因(BAT2) 的表达的修饰
a.甲硫氨酸的生产
在寻求生产甲硫氨酸的实施方案中，根据本发明的重组酵母有利地被定义为低表达以下基因：(i)编码芳香族氨基转移酶I(在本文中也称为ARO8)的基因、(ii)编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶(在本文中也称为BAT2)的基因或(iii)编码芳香族氨基转移酶I的基因(Aro8)和编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶(BAT2)的基因两者。
在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的，其中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的内源性核酸已被删除，或者
(ii)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
ARO8是来自酿酒酵母的芳香族氨基转移酶I。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181067.1。
根据又一个优选的实施方案，编码芳香族氨基转移酶I的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：20的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化甲硫氨酸转化为2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)和甲硫醇。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:20的核酸具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:20的核酸具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:20的核酸具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于ARO8的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011313.1，或参考本文描述的SEQ ID NO.21。
根据另一个特定的实施方案，编码芳香族氨基转移酶I的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化甲硫氨酸转化为2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)和甲硫醇的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
BAT2是来自酿酒酵母的胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181806.1。
根据又一个优选的实施方案，编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：22的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化甲硫氨酸转化为2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)和甲硫醇。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:22的核酸具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:22的核酸具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:22的核酸具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于BAT2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012682.1，或参考SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
根据另一个特定的实施方案，编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化甲硫氨酸转化为2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)和甲硫醇的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任意的ARO8基因、BAT2基因或两者的低表达会减少甲硫氨酸向2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)和甲硫醇的转化。
关于ARO8和BAT2，这些基因的低表达包括它们的表达的完全抑制，例如通过中断或删除ARO8、BAT2或ARO8和BAT2两者。
在一些实施方案中，ARO8、BAT2或ARO8和BAT2两者的低表达可以为条件性的，例如通过使该(这些)基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于ARO8和BAT2，低表达还涵盖插入编码不稳定的ARO8的核酸，或插入编码不稳定的BAT2的核酸，或两者。
不稳定的ARO8或BAT2分别是ARO8或BAT2的变体，与亲本ARO8或BAT2相比，其在酵母细胞中更快被降解。
b.甲硫氨酸衍生物的生产
相反，在寻求生产甲硫氨酸衍生物的实施方案中，根据本发明的重组酵母有利地被定义为过表达和/或受控制地表达以下基因：(i)编码芳香族氨基转移酶I基因的基因(在本文中也称为Aro8)、(ii)编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶(在本文中也称为BAT2)的基因或(iii)编码芳香族氨基转移酶I(ARO8)的基因和编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶(BAT2)的基因两者。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的，其中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8的核酸，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶BAT2的核酸，
过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
根据这些实施方案，芳香族氨基转移酶I基因或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因的过表达通过如下方法获得：在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的表达盒，该表达盒分别包含芳香族氨基转移酶I编码序列或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶编码序列。
在这些实施方案中的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含芳香族氨基转移酶I编码序列或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶编码序列的表达盒包含允许芳香族氨基转移酶I或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种芳香族氨基转移酶I编码基因和/或至少一种胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任意的ARO8基因、BAT2基因或两者的过表达会增加甲硫氨酸向2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)的转化。
用于测量芳香族氨基转移酶I或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在另一个实施方案中，目标甲硫氨酸衍生物是2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)，并且过表达和/或受控制地表达编码ARO8的基因、编码BAT2的基因或编码ARO8的基因和编码BAT2的基因两者的本发明重组酵母还被定义为低表达苯丙酮酸脱羧酶基因(ARO10)，并且不表达2-羟酸脱氢酶(2-hydroxyacide dehydrogenase)基因(KDH)。
KDH是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的2-羟酸脱氢酶。对于核酸序列，可以参考酶学委员会(Enzyme Commission)编号E.C.1.1.1.145。
根据又一个优选的实施方案，编码2-羟酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：24的核酸和/或与SEQ ID NO：25的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化2-酮基-4-甲硫基丁酸转化为2-羟基-4-(甲硫基)丁酸。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:24的核酸或SEQ ID NO:25的核酸具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:24的核酸或SEQ ID NO:25的核酸具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:24的核酸或SEQ ID NO:25的核酸具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于KDH的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号WP_011835036.1.，和/或参考UniProt数据库中的登录号WP_010905887.1。
根据另一个特定的实施方案，编码2-羟酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：26的氨基酸序列或与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化2-酮基-4-甲硫基丁酸转化为2-羟基-4-(甲硫基)丁酸的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
任选地，氨基酸序列可以包含在蛋白质的第2位中插入的另外的丝氨酸，因此，相应的核酸序列可以包含在核酸序列的第4至6位中插入的核苷酸TCA或AGT。具有这种序列的KDH在本文中被称为KDH1-0并且存在于一些实施例中。
ARO10是来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180688.3。
根据又一个优选的实施方案，编码苯丙酮酸脱羧酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：28的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化2-酮基-4-甲硫基丁酸的脱羧化。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:28的核酸具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:28的核酸具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:28的核酸具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
对于ARO10的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010668.3，或参考SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
根据另一个特定的实施方案，编码苯丙酮酸脱羧酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化2-酮基-4-甲硫基丁酸的脱羧化的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。
任选地，氨基酸序列可以包含在蛋白质的第2位中插入的另外的丝氨酸，因此，相应的核酸序列可以包含在核酸序列的第4至6位中插入的核苷酸TCA或AGT。具有这种序列的ARO10在本文中被称为KDH1-0并且存在于一些实施例中。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，ARO10基因低表达会减少2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)的转化，从而增加其可用度(availability)。特别地，发明人相信，ARO10的低表达会降低其甲硫氨醛转化(conversion in methional)。
关于ARO10，该基因的低表达包括其表达的完全抑制，例如通过中断或删除ARO10。
在一些实施方案中，例如可以通过使ARO10基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使ARO10的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于ARO10，低表达还包括插入编码不稳定的ARO10的核酸。
不稳定的ARO10是ARO10的变体，与亲本ARO10相比，其在酵母细胞中更快被降解。
根据其中目标甲硫氨酸衍生物是2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)的这个实施方案，上文定义的本发明的重组酵母也可以任选地被定义为过表达和/或受控制地表达编码产水型NADH氧化酶(water forming NADH oxidase，NOXE)的基因。
本发明中优选的产水型NADH氧化酶由EC号1.6.3.1和1.6.99.3已知(对于EC1.6.3.1，也称为NAD(P)H氧化酶(产H(2)O(2)型)、双重氧化酶、NAD(P)H氧化酶、ThOX、THOX2、甲状腺NADPH氧化酶、甲状腺氧化酶甲状腺氧化酶2，对于1.6.99.3，也称为NADH脱氢酶、β-NADH脱氢酶二核苷酸、细胞色素c还原酶、心肌黄酶(Diaphorase)、二氢辅脱氢酶I脱氢酶(Dihydrocodehydrogenase I dehydrogenase)、二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(Dihydronicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase)、Diphosphopyrinase、DPNH心肌黄酶、NADH心肌黄酶、NADH氢化酶、NADH氧化还原酶、NADH-甲萘醌氧化还原酶、NADH：细胞色素c氧化还原酶、还原型二磷酸吡啶核苷酸心肌黄酶、1型脱氢酶、I型脱氢酶)。
可在本发明中考虑的产水型NADH氧化酶在WO 2006/134277中特别描述。
用于测量本发明的NADH氧化酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Lopez DE FELIPE等人(International Daily Journal,2001,vol.11:37-44(ISSN 0958-6946))中描述的方法。
根据一个优选的实施方案，编码NADH氧化酶或NOXE的核酸可以是选自包括以下的组的核酸：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、乳酸乳球菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)及其混合物，优选肺炎链球菌。
NOXE可以特别是来自乳酸乳球菌的产水型NADH氧化酶，特别是具有NCBI参考编号为WP_012897225.1的氨基酸序列。对于核酸序列，可以参考NCBI参考号YP003352913.1。
根据另一个优选的实施方案，编码NADH氧化酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与核酸序列SEQ ID NO:30、31、32和33具有至少78％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性是编码产水型NADH氧化酶的能力。
如本文所述，与参考核酸序列具有至少78％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。
根据另一个具体的实施方案，编码NADH氧化酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与序列SEQ ID NO:34、35、36和37具有至少78％，优选至少80％同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。
就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，产水型NADH氧化酶。
如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少78％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
根据本发明的重组酵母的该实施方案，NADH氧化酶基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含NADH氧化酶编码序列的表达盒而获得的。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含NADH氧化酶编码序列的表达盒包含允许NADH氧化酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在其他优选的实施方案中，目标甲硫氨酸衍生物是2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)，过量地表达和/或受控制地表达编码Aro8的基因、编码BAT2的基因或编码ARO8的基因和编码BAT2的基因两者的本发明重组酵母也被定义为过表达和/或受控制地表达2-羟酸脱氢酶基因(KDH)，优选低表达ARO10。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的，即，至少一种编码2-羟酸脱氢酶(KDH)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
HMB不是由本发明的酵母天然生产的。
根据本发明的重组酵母的这些实施方案，2-羟酸脱氢酶基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含2-羟酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。
在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含2-羟酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许2-羟酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含2-羟酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许2-羟酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
目标化合物的输出
在根据本发明的重组酵母的其他实施方案中，可以通过(i)编码酵母通透酶的基因的低表达，通过(ii)编码氨基酸输出蛋白的基因的过表达，或通过(iii)编码酵母通透酶的基因的低表达以及编码氨基酸输出蛋白的基因的过表达两者，来提高所生产的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物向酵母细胞外的输出。
通透酶编码基因的低表达
如下所述，在根据本发明的重组酵母中可能低表达的通透酶编码基因涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3和MUP1。
因此，在一个特定的实施方案中，根据本发明的重组酵母的基因组进行了以下修饰中的至少一种：
(A)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶(general amino acid permease)AGP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP3的核酸已经被插入；
(B)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码支链氨基酸通透酶3BAP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码支链氨基酸通透酶3 BAP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的支链氨基酸通透酶3 BAP3的核酸已经被插入；
(C)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码支链氨基酸通透酶2BAP2的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码支链氨基酸通透酶2 BAP2的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的支链氨基酸通透酶2 BAP2的核酸已经被插入；
(D)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶GAP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入；
(E)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入；
(F)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入；
(G)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的核酸已经被插入；
(H)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的核酸已经被插入；
(I)至少一种编码可能的转运蛋白(probable transporter)AQR1的核酸过表达；和/或
(J)至少一种编码多胺转运蛋白1 TPO1的核酸过表达。
在一个特定的实施方案中，在本发明的酵母的基因组中已经进行了至少两种，特别是至少三种这些修饰。
AGP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶(general amino acid permease)1。对于AGP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号(access number)NP_009905。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178671。
AGP3是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶3。对于AGP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_116600。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179912。
BAP3是来自酿酒酵母的缬氨酸氨基酸通透酶。对于BAP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010331。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180354。
BAP2是来自酿酒酵母的Leu/Val/Ile氨基酸通透酶。对于BAP2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009624。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178416。
GAP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶。对于GAP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012965.3。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179829。
GNP1是来自酿酒酵母的高亲和力谷氨酰胺通透酶。对于GNP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010796。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180816。
MUP3是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011827。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179116。
MUP1是来自酿酒酵母的低亲和力甲硫氨酸通透酶。对于MUP的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011569。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181184。
在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为其一个或多个编码通透酶的基因低表达，所述通透酶涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1、GNP1、MUP3和MUP1通透酶。
在一个特定的实施方案中，所插入的至少一种编码S-腺苷甲硫氨酸SAM1和/或SAM2、胱硫醚γ-裂解酶CYS3、胱硫醚β-合酶CYS4、高丝氨酸激酶THR1、通用氨基酸通透酶AGP3、支链氨基酸通透酶3 BAP3、支链氨基酸通透酶2 BAP2、通用氨基酸通透酶GAP1、高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1、通用氨基酸通透酶AGP1、低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3和高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1独立地是来自酵母的核酸，优选来自酿酒酵母的核酸。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任何通透酶基因的低表达将增加所生产的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。
关于通透酶，这些基因中的一种或多种的低表达涵盖它们的表达的完全抑制，例如通过中断或删除所述一种或多种通透酶基因。
在一些实施方案中，例如可以通过使通透酶编码基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使通透酶编码基因的低表达表现为条件性的。
抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。
关于通透酶基因，低表达还涵盖插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸或插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸，或两者。
不稳定的通透酶是通透酶的变体，与亲本通透酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。
在优选的实施方案中，不稳定的通透酶由降解决定子标记的通透酶蛋白组成。
如实施例中所示，AGP3基因、BAP3基因、GAP1基因、GNP1基因和MUP3基因可以被loxP中断并因此被删除。
氨基酸输出蛋白编码基因的过表达
如下所述，在根据本发明的重组酵母中可能过表达的输出蛋白编码基因涵盖AQR1和TPO1。
AQR1是来自酿酒酵母的转运蛋白。对于AQR1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014334。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182903。
TPO1是来自酿酒酵母的多胺转运蛋白。对于TPO1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013072。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181848。
在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含所述转运蛋白编码序列的表达盒而获得的。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，转运蛋白编码基因的过表达将增加所生产的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。
在一些实施方案中，转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含转运蛋白基因编码序列的表达盒而获得的。在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在一些其他实施方案中，在酵母基因组的选定位置插入一个拷贝的转运蛋白编码基因。在这些其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述转运蛋白的强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。
在优选的实施方案中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因AQR1置于强启动子pTEF3的控制之下。
说明性地，可以将AQR1基因插入在hom3基因内，如本文实施例所示。
在优选的实施方案中，将所述氨基酸输出蛋白编码基因_TPO1置于强诱导型或抑制型启动子pSAM4或强组成型启动子pTEF1的控制之下。
可以使用TPO1-1代替TPO1。TPO1-1是人工等位基因，其中赖氨酸10、49、86、143、144和145被精氨酸替代。
发明人认为，这些修饰保护TPO1免于通过泛素-蛋白酶体途径被降解，从而使其稳定。
说明性地，可以将TPO1基因插入在mae1基因内，如本文实施例中所示，和/或trp1基因内。
考虑到进一步增加甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产，本发明的重组酵母可以包含另外的遗传改变，使得它们生产大量的中间产物草酰乙酸。这些可选的遗传改变如下所述。
生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母的其他实施方案
根据本发明的重组酵母的一些实施方案，可以通过如下方法进一步提高甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产：将所述重组酵母置于导致中间代谢物草酰乙酸的生产增加的条件下。
可以通过在酵母基因组中引入另外的遗传修饰来将所述重组酵母置于导致草酰乙酸的生产增加的条件下。
本发明人发现，通过向生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母中引入另外的遗传改变(下文描述的那些)，可以最佳地提高甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产。
生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母的最先的其他实施方案
根据本发明的生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母的这些最先的其他实施方案，为了提高中间产物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，在生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母中引入的另外的遗传改变会(i)导致过量生产NADPH，(ii)导致磷酸烯醇丙酮酸分别向草酰乙酸和丙酮酸受控且平衡的转化，以及(iii)导致降低丙酮酸向乙醇的转化，以及重新转向磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化。
通过遗传工程化在本发明的生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母中引入的这些另外的遗传改变在下面更详细地说明。
根据这些实施方案，引入遗传改变以过表达葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19或ZWF1)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating 1)(也称为GND1)。不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，MET19和GND1的过表达会引起NADPH生产的增加。
根据这些实施方案，引入遗传改变以使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(也称为PEPC或PPC)和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[ATP](也称为PCK1或PEPCK)过表达。
根据这些实施方案，引入遗传改变以使丙酮酸激酶1(也称为PYK1或CDC19)和丙酮酸激酶2(也称为(PYK2))低表达。在这些实施方案的一些中，可以删除PYK2基因而非使其低表达。在一些实施方案中，可以删除PYK1基因而非使其低表达。在特定的实施方案中，可以删除PYK1基因和PYK2基因而非使它们低表达。
在这些实施方案的一些中，优选地通过删除，使一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因失活。丙酮酸脱羧酶编码基因包括分别称为PDC1、PDC5和PDC6的基因。根据这些实施方案中的一些，优选通过中断或删除使PDC1和/或PDC6基因失活，而其他丙酮酸脱羧酶编码基因PDC5保持不变，或者通过用弱启动子控制它使其表达降低。
在这些实施方案的一些中，通过改变一种或多种醇脱氢酶编码基因的表达来降低重组酵母的醇脱氢酶活性。在这些实施方案的一些中，通过将基因置于弱启动子的控制之下或通过产生不稳定的ADH1酶来降低ADH1的表达。在这些实施方案的一些中，优选通过中断或删除使ADH3、ADH4和ADH5中的一种或多种失活。
在这些实施方案的一些中，可以将外源乙酰脱氢酶编码基因(也称为MHPF)引入酵母基因组中并使其过表达。
在这些实施方案的一些中，可以将外源乙酸激酶编码基因(也称为ACKA)引入酵母基因组中并使其过表达。
在这些实施方案的一些中，可以将外源磷酸乙酰基转移酶编码基因(也称为PTA)引入酵母基因组中并使其过表达。
葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化D-葡萄糖6-磷酸成为6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯(6-phospho-D-glucono-1,5-lactone)，同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。
用于测量葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Kuby,S.等人(1966)Dehydrogenasesand Oxidases Methods in Enzymology 9,116-117描述的方法。
本说明书中优选的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是EC号为n°1.1.1.49的酶。
对于葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014158.1。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001183079.1。
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1是在本领域中被描述为用于催化6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconate)氧化脱羧为核酮糖5-磷酸和CO2，同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。
用于测量6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考He W.等人(2007)BMC StructuralBiology,7:38描述的方法。
本说明书中优选的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1是EC号为n°1.1.1.44的酶。
对于6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1(也称为GND1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012053。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179314。
丙酮酸激酶1
丙酮酸激酶1是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下催化丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的蛋白质。
用于测量丙酮酸激酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(biochemistry,2004,43,15230-15245)描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸激酶1是EC号为n°2.7.1.40的酶。
对于丙酮酸激酶1(也称为PYK1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009362。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178183。
丙酮酸激酶2
丙酮酸激酶2酶是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下催化丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的蛋白质。丙酮酸激酶2可以在糖酵解通量水平非常低的条件下被酵母细胞使用。
用于测量丙酮酸激酶2的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(biochemistry,2004,43,15230-15245)描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸激酶2是EC号为n°2.7.1.40的酶。
对于丙酮酸激酶2(也称为PYK2)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014992。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001183767。
丙酮酸脱羧酶同工酶1
丙酮酸脱羧酶同工酶1是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。
用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶1是EC号为n°4.1.1.1的酶。
对于丙酮酸脱羧酶同工酶1(也称为PDC1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013145。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181931。
丙酮酸脱羧酶同工酶2
丙酮酸脱羧酶同工酶2是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。
用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶2的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶2是EC号为n°4.1.1.1的酶。
对于来自酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶同工酶2的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013235.1。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182021。
丙酮酸脱羧酶同工酶3
丙酮酸脱羧酶同工酶3是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。
用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。
本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶3是EC号为n°4.1.1.1的酶。
对于丙酮酸脱羧酶同工酶3(也称为PDC6)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP011601.3。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181216.3。
乙醛脱氢酶
乙醛脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化乙醛转化为乙酰辅酶A(使用NAD和辅酶A)的蛋白质。
用于测量乙醛脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Fisher等人(2013)Chemi.Biol.Interact.202 70-77描述的方法。
本说明书中优选的乙醛脱氢酶是EC号为n°1.1.1.10的酶。
对于乙醛脱氢酶(也称为MHPF)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_414885。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913.3公开的核酸序列。
乙酸激酶
乙酸激酶是在本领域中被描述为用于由乙酸和ATP形成乙酰磷酸的蛋白质。
用于测量乙酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Sagers等人J.Bacteriology(1961)82233-238描述的方法。
对于乙酸激酶(也称为ACKA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_416799。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913.3公开的核酸序列。
磷酸乙酰基转移酶
磷酸乙酰基转移酶是在本领域中被描述为用于催化乙酰辅酶A和乙酰磷酸的可逆相互转化的蛋白质。
用于测量磷酸乙酰基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Castano-Cerezo和Canovas,Microbial Cell Factories 2009,8:54描述的方法。
本说明书中优选的磷酸乙酰基转移酶是EC号为n°2.3.1.8的酶。
对于磷酸乙酰基转移酶(也称为PTA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_416800。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913公开的核酸序列。
醇脱氢酶1
醇脱氢酶1是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。
用于测量醇脱氢酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶1是EC号为n°1.1.1.1的酶。
对于醇脱氢酶1(也称为ADH1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014555。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001183340。
醇脱氢酶3
醇脱氢酶3是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。
用于测量醇脱氢酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶3是EC号为n°1.1.1.1的酶。
对于醇脱氢酶3(也称为ADH3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013800。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182582。
醇脱氢酶4
醇脱氢酶4是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。
用于测量醇脱氢酶4的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶4是EC号为n°1.1.1.1的酶。
对于醇脱氢酶4(也称为ADH4)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011258。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181122。
醇脱氢酶5
醇脱氢酶5是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。
用于测量醇脱氢酶5的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。
本说明书中优选的醇脱氢酶5是EC号为n°1.1.1.1的酶。
对于醇脱氢酶5(也称为ADH5)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009703。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178493。
生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母的其次的其他实施方案
根据本发明的生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的重组酵母的这些其他实施方案，为了提高中间产物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。
不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，在生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母中引入的另外的遗传改变会(i)导致过量生产NADPH，(ii)导致磷酸烯醇丙酮酸分别向草酰乙酸和丙酮酸受控且平衡的转化，以及(iii)导致降低丙酮酸向乙醇的转化，以及重新转向磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化。
为此目的，发明人构想了一种全新的代谢途径，其始于磷酸烯醇丙酮酸，最后产生草酰乙酸。
通过遗传工程化在本发明的生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母中引入的这些另外的遗传改变在下面更详细地说明。
根据这些实施方案，引入遗传改变以使丙酮酸激酶1(也称为PYK1)低表达，任选地也使丙酮酸激酶2(也称为PYK2)低表达。在这些实施方案中的一些中，可以通过将基因置于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下而使PYK1低表达。在这些实施方案的一些中，可以例如通过中断或删除使PYK2失活。在一些实施方案中，可以删除PYK1基因而非使其低表达。在特定的实施方案中，可以删除PYK1基因和PYK2基因而非使它们低表达。
根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[ATP](也称为PCK或PCKA或PEPCK)过表达。
根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使苹果酸脱氢酶，例如过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)在细胞质中过表达。
根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使NADP依赖性苹果酸酶3(也称为ME3或NADP-ME3)过表达。
根据这些实施方案，引入遗传改变以降低一种或多种醇脱氢酶的表达，优选降低选自包括以下的组的一种或多种醇脱氢酶的表达：醇脱氢酶1(也称为ADH1)、醇脱氢酶3(也称为ADH3)、醇脱氢酶4(也称为ADH4)和醇脱氢酶5(也称为ADH5)，例如(i)通过将相应的编码序列置于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下，或(ii)通过产生所述醇脱氢酶的不稳定形式。
仍然根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使外源乙醛脱氢酶(也称为MHPF)过表达。
丙酮酸激酶1和丙酮酸激酶2如先前所定义。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PPCK)
磷酸烯醇羧激酶[ATP]酶是在本领域中被描述为用于催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸(通过三磷酸核苷和草酰乙酸之间的直接磷酰基转移)的蛋白质。
用于测量磷酸烯醇羧激酶[ATP]的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Bazaes S.等人(2007)The ProteinJournal,26,265-269和
Figure BDA0002362608730000941
J.Van der Werf等人(1997)Arch Microbiol 167:332–342描述的方法。
本说明书中优选的磷酸烯醇羧激酶[ATP]是EC号为n°4.1.1.49的酶。
对于磷酸烯醇羧激酶[ATP](也称为PCKA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_417862。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913公开的核酸序列。
根据本发明的优选的磷酸烯醇羧激酶可以选自磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PPCK，例如EC号为n°4.1.1.32的PEPCK。
苹果酸脱氢酶
苹果酸脱氢酶是在本领域中被描述为用于在NADH的存在下催化苹果酸转化为草酰乙酸的蛋白质。
用于测量苹果酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。例如可以提及由Sigma出售的名为“苹果酸脱氢酶测定试剂盒”的商业试剂盒，编号为MAK196-1KT。
对于苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010205。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_00118037。
NADP依赖性苹果酸酶3
NADP依赖性苹果酸酶3酶是在本领域中被描述为用于在NADP的存在下催化苹果酸转化为丙酮酸的蛋白质。
用于测量NADP依赖性苹果酸酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。
在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Gerrard-Wheeler等人FEBS Journal276(2009)5665-5677描述的方法。
本说明书中优选的NADP依赖性苹果酸酶是EC号为n°1.1.1.40的酶。
对于NADP依赖性苹果酸酶3(也称为NADP-ME3或ME3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_197960。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_122489。
醇脱氢酶1、醇脱氢酶3、醇脱氢酶4、乙醛脱氢酶和醇脱氢酶5如前所定义。
启动子
如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的调控序列。
如本说明书中所公开的，多种启动子可用于目的编码序列的期望表达，包括(i)组成型强启动子(在本文中也称为强启动子)，(ii)组成型弱启动子(在本文中也称为弱启动子)和(iii)诱导型或抑制型启动子。酵母启动子及其在不同培养基中的相对活性的列表可见于Keren等人(2013)Molecular Systems Biology 9:701。
允许给定基因的组成型过表达的启动子可见于文献(Velculescu等人(1997)Cell88,243-251)。
在本发明中更特别感兴趣的强启动子可以选自由以下组成的组：
·pTDH3(SEQ ID N°38)，
·pENO2(SEQ ID N°39)，
·pTEF KI(SEQ ID N°40)，
·pTEF3(SEQ ID N°41)，
·pTEF1(SEQ ID N°42)，
·pADH1(SEQ ID N°43)，
·pGMP1(SEQ ID N°44)，
·pFBA1(SEQ ID N°45)，
·pPDC1(SEQ ID N°46)，
·pCCW12(SEQ ID N°47)，和
·pGK1(SEQ ID N°48)。
在一个特定的实施方案，根据本发明的强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。
在本发明中更特别感兴趣的弱启动子可以选自由以下组成的组：
·pURA3(SEQ ID N°50)，
·pRPLA1(SEQ ID N°51)
·pNUP57(SEQ ID N°130)，和
·pGAP1(SEQ ID N°131)。
在一个具体的实施方案，根据本发明的弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。
如前所述，诱导型或抑制型启动子是其活性受是否存在生物或非生物因子以及所述因子的量所控制的启动子。因此，对于某些启动子，当给定因子的量增加或被增加时，它们的活性将特别地被诱导并因此增加，因此，当所述因子的量降低或被降低时，这些相同启动子的活性可以被抑制并因此降低。包含诱导型或抑制型启动子的本发明的重组酵母的培养基中所述因子的量可以由本领域技术人员确定并控制。
例如，增加包含pSAM4启动子的本发明重组酵母的培养基中甲硫氨酸的量将诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中甲硫氨酸的量将会抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。
在另一个实例中，增加包含pCTR1启动子的本发明重组酵母的培养基中铜的量将抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中铜的量将会诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。
因此，以下启动子在本文中称为“诱导型或抑制型启动子”。
根据第一个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：
·pSAM4-甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°52)，
·pCUP1-1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°53)，
·pCUP1.cgla–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°54)，
·pCUP1.sba–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°55)，
·pACU1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°56)，
·pACU2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°57)，
·pACU3p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°58)，
·pACU4p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°59)，
·pACU5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°60)，
·pACU6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°61)，
·pACU7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°62)，
·pACU8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°63)，
·pACU9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°64)，
·pACU10p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°65)，
·pACU11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°66)，
·pACU12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°67)，
·pACU13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°68)，
·pACU14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°69)，
·pACU15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°70)，
·pGAL/CUP1p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°71)，
·pCRS5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°72)，和
·pCHA1–苏氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°73)。
根据该实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以特别地独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。
因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜或苏氨酸的存在来诱导这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜或苏氨酸的量减少时，它们的活性降低，即，被抑制。
根据第二个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子和可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：
·pCTR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°74)，
·pCTR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°75)，
·pCUR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°76)，
·pCUR2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°77)，
·pCUR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°78)，
·pCUR4–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°79)，
·pCUR5p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°80)，
·pCUR6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°81)，
·pCUR7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°82)，
·pCUR8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°83)，
·pCUR9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°84)，
·pCUR10–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°85)，
·pCUR11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°86)，
·pCUR12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°87)，
·pCUR13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°88)，
·pCUR14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°89)，
·pCUR15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°90)，
·pCUR16–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°91)，
·pCUR17–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°92)，
·pLYS1–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°93)，
·pLYS4–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°94)，
·pLYS9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°95)，
·pLYR1p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°96)，
·pLYR2p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°97)，
·pLYR3p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°98)，
·pLYR4p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°99)，
·pLYR5p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°100)，
·pLYR6p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°101)，
·pLYR7p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°102)，
·pLYR8–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°103)，
·pLYR9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°104)，
·pLYR10–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°105)，
·pLYR11–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°106)，
·pMET17–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°107)，
·pMET6–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°108)，
·pMET14–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°109)，
·pMET3–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°110)，
·pSAM1–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°111)，和
·pSAM2–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°112)，
·pMDH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°49)，
·pJEN1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°132)，
·pICL1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°133)，
·pADH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°134)，和
·pMLS1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°135)。
根据该实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用葡萄糖诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子。
因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的存在量，来抑制这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的量减少时它们的活性增加，即被诱导。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、pCHA1、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。
更具体地，所述启动子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：38至112和130至135具有至少80％同一性的序列。
也可以使用如Blazeck&Alper(2013)Biotechnol.J.8 46-58中描述的合成型启动子。
本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以源自来自酵母纲的任何生物，并且特别地可以独立地源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)、Saccharomyces castelii、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castelii)、解脂假丝酵母(Yarrowia lipolitica)和产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)。
本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以优选源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、Saccharomyces castelii、贝酵母、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母和乳酸克鲁维酵母。
终止子
如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的转录终止子序列。
所述转录终止子(相同或不同)可见于文献Yamanishi等人(2013)ACS syntheticbiology 2,337-347。
在本发明中更特别感兴趣的终止子可以选自由以下组成的组：
·tTDH2，来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶2的基因(TDH2基因＝序列SEQ IDN°113)，
·tCYC1(＝序列SEQ ID N°114)，
·tTDH3(＝序列SEQ ID N°115)，和
·tADH1，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH1基因＝序列SEQ ID N°116)，
·tADH2，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH2基因＝序列SEQ ID N°117)，
·tTPI1来自编码磷酸甘油醛异构酶(Triose Phosphate Isomerase)的基因(TPI1基因＝序列SEQ ID N°118)，
·tMET17，来自编码O-乙酰基高丝氨酸-O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserine-O-acetyl serine sulfhydrylase)的基因(Met17基因＝序列SEQ ID N°119)，
·tENO2，来自编码烯醇酶II的基因(ENO2基因＝序列SEQ ID N°120)，
·tMET3(＝序列SEQ ID N°121)，和
·tPGK1，来自编码3-磷酸甘油酸激酶的基因(PGK1基因＝序列SEQ ID N°122)，
·tDIT1(＝序列SEQ ID N°123)
·tRPL3(＝序列SEQ ID N°124)
·tRPL41B(＝序列SEQ ID N°125)
·tRPL15A(＝序列SEQ ID N°126)
·tIDP1(＝序列SEQ ID N°127)。
更具体地，所述终止子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：113至127具有至少80％同一性的序列。
重组酵母
通常，与细菌相比，酵母可以快速生长并且可以以更高的密度培养，并且在工业环境中不需要无菌环境。此外，与细菌细胞相比，酵母细胞可以更容易地从培养基中分离出来，从而大大简化了产物提取和纯化的过程。
优选地，本发明的酵母可以选自酵母菌属、念珠菌属、阿舒囊霉属(Ashbya)、德克拉酵母属(Dekkera)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、德巴利酵母属(Debaryomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、路德酵母属(Lodderomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Zigosaccharomyces、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属、酒香酵母属(Brettanomycces)、隐球菌属(Cryptococcus)或马拉色菌属(Malassezia)。
更优选地，酵母可以是酵母菌属、德克拉酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、有孢酵母属、Zigosaccharomyces属或酒香酵母属的Crabtree阳性酵母。
更优选地，酵母可以选自酿酒酵母、布拉迪酵母、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、贝酵母或Zigosaccharomyces bailii、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera brucelensis)、中间型德克酵母(Dekkeraintermedia)、卡斯酒香酵母(Brettanomycces custersii)、中间型酒香酵母(Brettanomycces intermedius)、嗜热克鲁维酵母(Kluyveromyces themotolerens)、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)、光滑有孢圆酵母(Torulaspora glabrata)。
更优选地，重组酵母可以属于酵母菌属，并且优选地是酿酒酵母物种。
如上所述，根据本发明的重组酵母具有丙酮酸脱羧酶活性，该活性通过插入至少一种选自本说明书中公开的DNA构建体而被降低。
被实施以在基因内插入特定DNA构建体的方法属于本领域技术人员的常识。在下文的实施例中更详细地描述了相关方法。
培养条件
本发明还涉及重组酵母(例如如上定义的)在生产甲硫氨酸和/或其衍生物中的用途。
本发明还涉及甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产方法，其包括以下步骤：
-提供如前所述的重组微生物，在含有碳源的培养基中培养所述重组微生物，和
-回收甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物。
通常，本发明的微生物在合适的培养基中在约20℃至约37℃范围内的温度下，优选在范围为27至34℃的温度下生长。
当根据本发明的重组酵母属于酿酒酵母物种时，在合适的培养基中温度可以有利地在27至34℃的范围内。
适合酵母的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如肉汤，其包括酵母氮碱、硫酸铵和右旋糖作为碳/能源，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖的对于最快生长而言最佳比例的混合物。也可以使用其他限定的或合成的生长培养基，并且微生物或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的合适的培养基。
术语“合适的培养基”是以上定义的。
用于根据本发明的重组酵母的已知培养基的实例是本领域技术人员已知的，并且在以下出版物中给出：D.Burke等人,Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000)。
用于发酵的合适的pH范围可以在pH 3.0至pH 7.5之间，其中优选pH 4.5至pH 6.5作为初始条件。
发酵可以在需氧条件或微需氧条件下进行。
发酵培养基中产物的量可以使用本领域已知的多种方法来确定，例如高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。
本方法可以采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭的体系，其中培养基的组成在发酵开始时就设定好了，并且在发酵过程中不会发生人为改变。因此，在发酵开始时，用所需的一种或多种生物接种培养基，并且在不向该体系中添加任何物质的情况下能够发生发酵。然而，通常，“分批”发酵是就添加碳源而言的分批，并且经常尝试控制诸如温度、pH和氧浓度之类的因素。在分批体系中，该体系的代谢物和生物质组成一直在变化直至发酵停止。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进入高生长对数期，最后进入稳定期，在稳定期生长速率降低或停止。如果不进行处理，稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常负责最终产物或中间体的大量生产。
本发明中也可以使用补料分批体系(Fed-Batch system)。补料分批体系与典型的分批体系类似，不同之处在于，随着发酵的进行，以增量方式添加碳源底物。当分解代谢物阻抑(例如葡萄糖阻抑)易于抑制细胞的代谢并且希望培养基中底物的量有限时，补料分批体系是有用的。补料分批体系中实际底物浓度的测量很困难，因此是根据可测量因素(例如pH值、溶氧量和废弃(如C02)的分压)的变化进行估算的。
发酵是本领域常见且公知的，并且实例可见于Sunderland等人，(1992)，其通过引用并入本文。尽管本发明以分批模式进行，但是可以预期该方法将适用于连续发酵。
连续发酵是一种开放体系，其中向生物反应器中连续添加确定的发酵培养基，并同时去除等量的条件培养基以进行流程。连续发酵通常使培养物保持恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。例如，一种方法将使限制性营养物质例如碳源或氮水平保持在恒定速率，并允许所有其他参数发生变化。在其他体系中，可以连续改变影响生长的许多因素，而使细胞浓度(通过培养基浊度测量)保持恒定。连续体系力争维持稳态生长条件，因此由于培养基被抽出而导致的细胞损失必须与发酵中的细胞生长速率相平衡。为连续发酵过程调节营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域众所周知的。
预期可以使用分批、补料分批或连续方法实施本发明，并且任何已知的发酵方式将是合适的。另外，预期可以将细胞固定在作为全细胞催化剂的基质上，并使其经受发酵条件以进行生产。
为了仍然改善甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的生产，一个特定的实施方案可以由以下构成：在合适的培养基(例如如上提到的)中培养重组酵母细胞，其中所述培养基包含最适量的碳源，特别是葡萄糖。
优选地，仅在整个培养期间的一部分期间在这种最佳培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在培养开始后10小时或更长时间，涵盖在培养开始后11、12、13、14、15或16小时或更长时间，将酵母细胞在所述最佳培养基中孵育。
优选地，在培养开始后5小时至15小时的时间段内，包括6小时至10小时，例如8小时，将细胞在这样的最佳培养基中培养。
在优选的实施方案中，所述最佳培养基中包含的碳源由葡萄糖组成。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含12％w/w或更多的葡萄糖，包括15％w/w或更多的葡萄糖。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含至多40％w/w的葡萄糖，其包含至多35％w/w的葡萄糖。
因此，在上述优选实施方案中，根据本发明的用于生产甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的方法还可以在步骤(a)和(c)之间包括中间步骤(b)，该中间步骤(b)由以下构成：在所述最佳培养基中培养所述酵母细胞。
甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的纯化
根据本发明的一个特定方面，甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的发酵生产包括从培养基中分离甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的步骤。从培养基中回收甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物是本领域技术人员的常规工作。可以通过本领域众所周知的多种技术来实现，包括但不限于蒸馏、气体汽提(gas-stripping)、渗透蒸发(pervaporation)、选择性沉淀或液体萃取。本领域的专家知晓如何根据待分离材料的特性来调整各种技术的参数。
作为本发明的微生物模型的酵母被保留，因为合成的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物被完全输出到细胞外，从而简化了纯化过程。
合成的甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物可以通过蒸馏收集。蒸馏可以涉及不同于培养基的任选组分，以便通过形成共沸物(特别是与水)来促进甲硫氨酸和/或甲硫氨酸衍生物的分离。该任选组分是有机溶剂，例如环己烷、戊烷、丁醇、苯、甲苯、三氯乙烯、辛烷、二乙醚或其混合物。
用选自氦气、氩气、二氧化碳、氢气、氮气或其混合物的汽提气体进行气体汽提。
用有机溶剂作为疏水相(例如戊烷、己烷、庚烷或十二烷)进行液体萃取。
甲硫氨酸衍生物
根据本发明的甲硫氨酸衍生物是可以由甲硫氨酸在被本发明的生产甲硫氨酸的微生物中(特别是本发明的生产甲硫氨酸的酵母中)天然和/或人工存在的至少一种酶修饰后获得的化合物。
这种甲硫氨酸衍生物的实例可以是例如2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)或2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)。
优选地，所述甲硫氨酸衍生物选自2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)和2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)，优选为HMB。
这些化合物可以例如如下获得：
Figure BDA0002362608730001081
在整篇说明书(包括权利要求书)中，除非另有说明，否则表述“包含”应理解为与“包含至少一种”同义。
除非另有说明，否则术语“在...与...之间”和“从...至...的范围”应理解为包括界限值。
下面的实施例和附图是通过举例说明的方式提出的，而不是暗示对本发明的限制。
实施例
实施例1：制备根据本发明的重组酿酒酵母菌株的方案
下文实施的所有重组酿酒酵母菌株均是使用标准酵母分子遗传学方法(D.Burke、D.Dawson、T.Stearns CSHL Press的Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000))从标准菌株构建的。
利用酵母有效重组具有序列同源性的游离DNA末端的能力，将下述基因簇同时整合到重组酵母中。
另外，为了更好地理解以下基因型；
-ade2、his3、leu2、trp1和ura3是营养缺陷型标记基因。
-小写字母表示所考虑的基因是无活性的，大写字母表示活性基因。
-基因名称后的“::”：是指该基因被随后的内容中断(如果插入了多个基因，则将它们标注在方括号[]中)。基因的中断伴随编码序列的整体缺失，但保留了启动子。因此，后面有“::”的基因是无活性的，并以小写字母表示。如果未指定，则插入的基因的转录受被破坏的基因的启动子控制。
-“基因.Kl”是指该基因源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
更特别地，待克隆的编码序列是人工合成的。对于异源序列(非酵母的)，对核酸序列进行修饰以获得使用酵母密码子用法的同义编码序列。使用限制酶和经典克隆技术，将每个合成序列克隆在转录启动子和转录终止子之间。每个启动子序列的前面是与上游基因的终止子序列同源的50至200个核苷酸序列。类似地，每个基因(包含启动子-编码序列-终止子的基因)的终止子的后面是与紧随其后的基因同源的序列。因此，每个待整合的单元与单元上游和单元下游都有50-200个核苷酸重叠。对于第一个单元，启动子的前面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。类似地，对于最后一个单元，终止子的后面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。
然后从质粒构建体PCR扩增每个单元，得到具有重叠序列的线性DNA的X单元。为了选择重组事件，该基因中的至少一个是营养缺陷型标记。将所有线性片段同时转化到酵母中，并针对与所用标记相关的营养缺陷型选择重组酵母。然后通过PCR和测序验证序列的完整性。
实施例2：生产甲硫氨酸的比较例
A.首先，获得两种重组菌株：YA2326-14和YA2408-27。这两种菌株已经被重组，以便仅包含根据本发明的一部分修饰。
相应地，这两种菌株如下：
菌株YA2326-14：Matα,ade2,agp3::loxP,bap3::loxP,can1-100,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],leu2,mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,trp1::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
菌株YA2408-27：Matα,ade2,agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],leu2,mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,trp1::[pACU1-AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3,ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
获得了第三种菌株DA705-1，其包含两种菌株YA2326-14和YA2408-27的组合修饰。相应地，DA705-1是根据本发明的菌株。
DA705-1：(YA2408-27 x YA2326-14)：ade2/ade2,agp3::loxP/agp3::loxP,bap3::loxP/bap3::loxP,CAN1-100/can1-100,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1]/hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],leu2/leu2,mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg]/mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,sam1::loxP/sam1::loxP,trp1::[pACU1-AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
PPC-5是PPC的更稳定形式，其中已在N+1中添加了丙氨酸。
使所有这些菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和CH3SNa 1g/L中生长24小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
用不同菌株获得的甲硫氨酸量分别为：
-YA2326-14：1.47g/L-1。
-YA2408-27：1.5g/L-1。
-DA705-1：1.9g/L-1。
由该对比实验得出的结果是，与不包含本发明的所有遗传修饰的其他重组菌株相比，当在相同条件下培养时，包含本发明的修饰的重组菌株生产更大量的甲硫氨酸。
B.还获得了另外三种重组菌株：YA1919-13、YA2058-33和YA2058-27。
这三种菌株如下：
菌株YA1919-13：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6
YA2058-23：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x2
YA2058-37：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3--GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC5.Ec-URA3]x7,
his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3
使三种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和MeSNa 1g/L中生长48小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
用这三种菌株获得的甲硫氨酸量分别为：
-YA1919-13：3.9g/L-1。
-YA2058-23：6.1g/L-1。
-YA2058-37：7.1g/L-1。
本发明的重组酵母中HOM3的受控强表达明显改善了它们的甲硫氨酸生产。
C.除了菌株YA1919-13，还获得了另外两种重组菌株：YA2160-40和YA2230-9。
YA2160-40：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,trp1::[pSAM4-TPO1-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5
YA2230-9：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3--GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,
trp1::[pTDH3-GDH.E.Ca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5
使这三种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和MeSNa 1g/L中生长48小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
用这三种菌株获得的甲硫氨酸量分别为：
-YA1919-13：3.9g/L-1。
-YA2160-40：7.4g/L-1。
-YA2230-9：9.6g/L-1。
本发明的重组酵母中HOM3的受控强表达结合TPO1的强受控表达明显改善了它们的甲硫氨酸生产。
此外，本发明的重组酵母中HOM3的强受控表达结合GDH的组成型强过表达明显改善了它们的甲硫氨酸生产。
D.除了菌株YA1919-13，还获得了另一种重组菌株：YA2231-8。
YA2231-8：agp3::loxP,bap3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6,trp1::[pSAM4-AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x4
使这两种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和MeSNa 1g/L中生长48小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
用这三种菌株获得的甲硫氨酸量分别为：
-YA1919-13：3.9g/L-1。
-YA2231-8：7g/L-1。
本发明的重组酵母中HOM3的受控强表达结合AAT2的受控强表达明显改善了它们的甲硫氨酸生产。
E.获得了根据本发明的另外三种重组菌株：YA2679-28、YA2687-142和YA3083-58C。
相应地，这三种菌株如下：
YA2679-28：MAT-α,gnp1::[LEU2.Kl,pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-tRPL3,pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[LEU2.Kl,pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-4],sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPI1]x9,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1.Sc]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At-tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3.Sc]x11
YA2687-142：MAT-α,gnp1::[LEU2.Kl,pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-tRPL3,pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[LEU2.Kl,pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-6],sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPI1].
PYK1-4和PYK1-6是PYK1的不稳定形式，其根据N-端规则去稳定化，这是本领域技术人员熟知的(Gibbs等人(2014)Trends in Cell Biology,10,603-610)。
YA3083-58C：MAT-a,agp3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET25-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2,lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x7,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-HOM2-1-tTDH3],sam1::loxP,trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
使这三种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和MeSNa 1g/L中生长48小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
虽然未重组的相应酵母没有生产可检测量的甲硫氨酸，但菌株YA2679-28在24小时内生产了2g.L-1的甲硫氨酸，菌株YA2687-142在相同的时间内生产了2.2g.L-1的甲硫氨酸，菌株YA3083-58C在24小时内生产了2.2g.L-1的甲硫氨酸。
F.在发酵罐中用根据本发明获得的以下两种重组菌株进行了另外的实验：
DA964-31：MAT-a/MAT-α,ade2/ade2,agp3::loxP/agp3::loxP,bap3::loxP/bap3::loxP,CAN1-100/can1-100,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,sam1::loxP/sam1::[LEU2.Kl-pACU8-HOM2-1-tRPL15A,pACU5-TPO1-3-tTPI1],trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH-.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1047-1：MAT-a/MAT-α,ADE2/ADE2,agp3::loxP/agp3::loxP,BAP3/bap3::loxP,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3],sam1::loxP/sam1::loxP,trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
已经将这些菌株在YE(酵母提取物中)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和500MCuSO4中，按照“补料分批”技术(如Peng等人(2017)biotechnology for buefuels 10-43中描述的)，在发酵罐中培养。
此外，培养基含有1g/L的MeSH和/或1g/L的MeSNA。
然后如前所述测量甲硫氨酸的产量，用这两种菌株获得的甲硫氨酸的量分别为：
(i)在存在MeSH的情况下：
-DA964-31：70小时后，32g/L-1。
-DA1047-1：50小时后，16g/L-1。
(ii)在MeSNa存在下：
-DA964-31：63小时后，20g/L-1。
-DA1047-1：47小时后，11g/L-1。
当在MeSH而不是MeSNa的存在下培养菌株时，可获得更高量的甲硫氨酸。在此同样地，相应的非重组菌株未生产任何可测量量的甲硫氨酸。
G.还测定了下文示出的本发明的另外两种重组菌株的甲硫氨酸。
菌株YA3984-2：MAT-α,gap1::HIS5.Sp-loxP,gnp1::[RS-pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPI1]x4,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
菌株YA4178：MAT-a,gap1::loxP,gnp1::[pENO2-ADH2-tIDP1,pADH1-AAT2-tRPL15A,pTEF3-MDH3-1-tRPL3,pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1,pCCW12-ME3.At-tRPL3],his3,leu2,mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2,pENO2-TPO1-3-tMET17,pCCW12-MET17-tRPL41B,pTDH3-MET2-tRPL3,pCUP1-1-HOM3-tDIT1,pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1,pCCW12-ME3.At-tRPL3,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF1-HOM2-tTDH3,pPDC1-MDH3-1-tRPL15A,pADH1-HOM6-tENO2],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1,HIS5.Sp-loxP],sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPI1]x10,trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
PYK1-7是带有降解决定子标记的PYK1人工等位基因。
PEPCK-1是一种通过甘氨酸修饰2位氨基酸精氨酸而稳定化的PEPCK形式。
使这两种菌株在25ml的2％酵母提取物、10％葡萄糖，50mM尿素和500μM Cu(SO4)中生长7小时，然后加入终浓度为500μM的Cu(SO4)2，并缓慢(0.25ml/h)加入4ml的CH3SNa(23g/l)。在25h30小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
虽然未重组的相应酵母无法生产可检测量的甲硫氨酸，但菌株YA3984-2在25h30内生产了1.32g.L-1的甲硫氨酸，菌株YA4178在相同的时间内生产了1.26g.L-1的甲硫氨酸。
实施例3：本发明的生产甲硫氨酸的菌株
还测定了下文示出的本发明的两种重组菌株的甲硫氨酸。
菌株YA2573-36B：Mat a,agp3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],leu2,mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,pyk1::[TRP1.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACU1-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYK1],pyk2::[LEU2.Kl-RS-pADH1-HOM2-1],sam1::loxP,trp1::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
菌株YA2691-2：Mat a,agp3::loxP,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5,hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1],leu2,mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg],met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,pyk1::[TRP1.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACU1-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYK1],pyk2::[LEU2.Kl-RS-pADH1-HOM2-1],sam1::loxP,sam3::[pCUP1-1-CGS1-mut-pACU6-THR1-SAM3]x4,trp1::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
使这两种菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM和CH3SNa 1g/L中生长24小时。8小时后添加500μM的CuSO4。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中甲硫氨酸的含量。
用这两种菌株获得的甲硫氨酸量分别为：
-YA2573-36B：1.8g/L-1。
-YA2691-2：2.1g/L-1。
实施例4：本发明的生产甲硫氨酸和甲硫氨酸衍生物的菌株
A.还测定了下文示出的本发明的两种重组菌株的甲硫氨酸和KMB生产。
这两种菌株是：
YA3344-12：MAT-α,ADE2,agp3::loxP,aro10::[pENO2-SAM2-pENO2-ARO8-tTDH3]x6,bap3::loxP,CAN1-100,gap1::loxP,gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2,lyp1::[pCUP1-MET17.Rp-1-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP,pdc1::loxP,pdc6::loxP,sam1::loxP,sam2::[LEU2.Kl-pACU8-HOM2-1-tRPL15A,pACU5-TPO1-3-tTPI1],trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1025-9：MAT-a/MAT-α,ade2/ade2,agp3::loxP/agp3::loxP,ARO10/aro10::[pENO2-SAM2-pENO2-ARO8-tTDH3]x11,bap3::loxP/bap3::loxP,CAN1-100/can1-100,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,sam1::loxP/sam1::loxP,sam2::[LEU2.Kl-pACU8-HOM2-1-tRPL15A]/sam2::[LEU2.Kl-pACU8-HOM2-1-tRPL15A],trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
已经将这些菌株在YE(酵母提取物中)2％、葡萄糖8％、(NH4)2SO4 50mM、1g/L的MeSNa和500μM的CuSO4中，按照“补料分批”技术(如Peng等人(2017)biotechnology forbuefuels 10-43.doi:10.1186/s13068-017-0728-x中描述的)，在发酵罐中培养。
然后按照前述方法测定甲硫氨酸和KMB的生产，用这两种菌株获得的甲硫氨酸和KMB的量分别为：
(i)YA3344-12：39小时后，0.5g/L-1的甲硫氨酸和1.2g/L-1的KMB。
(ii)DA1025-9：39小时后，7.5g/L-1的甲硫氨酸和8g/L-1的KMB。
在这些培养条件下，相应的非重组菌株不会产生可检测量的KMB。
B.还测定了下文示出的本发明的三种重组菌株的甲硫氨酸和HMB生产。
这三种菌株是：
DA1047-1：MAT-a/MAT-α,ADE2/ADE2,agp3::loxP/agp3::loxP,BAP3/bap3::loxP,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3],sam1::loxP/sam1::loxP,trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1555-2：MAT-a/MAT-α,ADE2/ADE2,agp3::loxP/agp3::loxP,BAP3/bap3::loxP,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3],sam1::loxP/sam1::loxP,sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH1-0.Ll-tTPI1]x1/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH1-0.Ll-tTPI1]x2,trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1156-11：DA1555-2：MAT-a/MAT-α,ADE2/ADE2,agp3::loxP/agp3::loxP,BAP3/bap3::loxP,gap1::loxP/gap1::loxP,gnp1::loxP/gnp1::loxP,his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6,hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1],leu2/leu2,LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5,mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1],mup3::loxP/mup3::loxP,pdc1::loxP/pdc1::loxP,pdc6::loxP/pdc6::loxP,pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3],sam1::loxP/sam1::loxP,sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPI1]x1/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPI1]x2,trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-1.Ec-tIDP1]x8,ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
菌株已经在锥形瓶：酵母提取物2％、葡萄糖8％、CuSO4 500μM、CH3SNa 10g/l中培养了24小时。通过LC-MS(LC：柱子：Hi-Plex H 300*7.7mm Ref PL1170-6830 Agilent，洗脱液85％甲酸0.5％，15％乙腈，电离ESI-，质谱仪Quattro Micro API Waters)在培养上清液中计量甲硫氨酸、KMB和HMB。
在这些培养条件下，相应的非重组菌株不会产生可检测量的KMB，并且不能够产生HMB。
用这三种菌株获得的甲硫氨酸、KMB和HMB的量分别为：
(i)DA1047-1：2.3g/L-1的甲硫氨酸、0.3g/L-1的KMB和0.1g/L-1的HMB(48小时后)。
(ii)DA1555-2：36小时后，0.3g/L-1的甲硫氨酸、0.15g/L-1的KMB和2.8g/L-1的HMB。
(iii)DA1156-11：44小时后，0.4g/L-1的甲硫氨酸、0.15g/L-1的KMB和2.4g/L-1的HMB。
可以看出，在根据本发明的重组菌株中ARO8的过表达以及不同形式的KDH的过表达会导致产生HMB。此外，可以看出，在当前实施例中，没有转换为HMB的KMB的量非常低。
序列表
<110> 安迪苏法国联合股份有限公司
<120> 甲硫氨酸生产酵母
<130> PR74636
<150> EP17305906
<151> 2017-07-11
<160> 135
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<400> 1
atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60
attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga 120
tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180
tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240
gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300
ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360
gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420
gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480
ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540
actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt 600
ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660
aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720
atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780
tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840
gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900
gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960
ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020
tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080
gcaagaaact tgatttaa 1098
<210> 2
<211> 1098
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<400> 2
atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60
attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga 120
tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180
tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240
gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300
ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360
gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420
gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480
ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540
actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatc 600
ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660
aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720
atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780
tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840
gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900
gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960
ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020
tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080
gcaagaaact tgatttaa 1098
<210> 3
<211> 365
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<220>
<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)
<400> 3
Met Ala Gly Lys Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val
1 5 10 15
Gly Gln Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ala Asn His Pro His Phe Glu Leu
20 25 30
Lys Val Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr Val Asp
35 40 45
Ala Val Asn Trp Lys Gln Thr Asp Leu Leu Pro Glu Ser Ala Thr Asp
50 55 60
Ile Ile Val Ser Glu Cys Lys Ser Glu Phe Phe Lys Glu Cys Asp Ile
65 70 75 80
Val Phe Ser Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Ala Ile Glu Lys Glu
85 90 95
Phe Met Glu Ala Gly Ile Ala Ile Val Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg
100 105 110
Arg Glu Gln Asp Val Pro Leu Ile Val Pro Val Val Asn Pro Glu His
115 120 125
Leu Asp Ile Val Ala Gln Lys Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gln Gly Lys
130 135 140
Pro Arg Pro Gly Phe Ile Ile Cys Ile Ser Asn Cys Ser Thr Ala Gly
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp
165 170 175
Ala Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Phe Ser
180 185 190
Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile
195 200 205
Gly Gly Glu Glu Asp Lys Met Glu Trp Glu Thr Lys Lys Ile Leu Ala
210 215 220
Pro Leu Ala Glu Asp Lys Thr His Val Lys Leu Leu Thr Pro Glu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Val Ser Ala Gln Cys Asn Arg Val Ala Val Ser Asp Gly His
245 250 255
Thr Glu Cys Ile Ser Leu Arg Phe Lys Asn Arg Pro Ala Pro Ser Val
260 265 270
Glu Gln Val Lys Thr Cys Leu Lys Glu Tyr Val Cys Asp Ala Tyr Lys
275 280 285
Leu Gly Cys His Ser Ala Pro Lys Gln Thr Ile His Val Leu Glu Gln
290 295 300
Pro Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg Asn Arg Asp Ser Gly Tyr
305 310 315 320
Gly Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Glu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Lys
325 330 335
Met Val Val Leu Ser His Asn Thr Ile Ile Gly Ala Ala Gly Ser Gly
340 345 350
Val Leu Ile Ala Glu Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ile
355 360 365
<210> 4
<211> 1583
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)
<220>
<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)
<400> 4
atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt 60
ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct 120
aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc 180
aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct 240
gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc 300
attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg 360
gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat 420
ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac 480
cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc 540
agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc 600
ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt 660
ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata 720
gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact 780
gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct 840
tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt 900
agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt 960
atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac 1020
ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat 1080
gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct 1140
caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa 1200
gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa 1260
gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt 1320
tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact 1380
cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata 1440
tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta 1500
ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa 1560
caattgaaaa gacttggaat taa 1583
<210> 5
<211> 526
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)
<220>
<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)
<400> 5
Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp
20 25 30
Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val
35 40 45
Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr
50 55 60
Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu
65 70 75 80
Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala
85 90 95
Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp
100 105 110
Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys
115 120 125
Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys
130 135 140
Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg
145 150 155 160
Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp
165 170 175
Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln
180 185 190
Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile
195 200 205
Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu
210 215 220
Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala
225 230 235 240
Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly
245 250 255
Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp
260 265 270
Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu
275 280 285
Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro
290 295 300
Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile
305 310 315 320
Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro
325 330 335
Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala
340 345 350
Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser
355 360 365
Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile
370 375 380
Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val
385 390 395 400
His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser
405 410 415
Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile
420 425 430
Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln
435 440 445
Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly
450 455 460
Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser
465 470 475 480
Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His
485 490 495
Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His
500 505 510
Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile
515 520 525
<210> 6
<211> 1461
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2; METX)
<220>
<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2; METX)
<400> 6
atgtcgcata ctttaaaatc gaaaacgctc caagagctgg acattgagga gattaaggaa 60
actaacccat tgctcaaact agttcaaggg cagaggattg ttcaagttcc ggaactagtg 120
cttgagtctg gcgtggtcat aaataatttc cctattgctt ataagacgtg gggtacactg 180
aatgaagctg gtgataatgt tctggtaatt tgtcatgcct tgactgggtc cgcagatgtt 240
gctgactggt ggggccctct tctgggtaac gacttagcat tcgacccatc aaggtttttt 300
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aagaatatgg ttgctctggc gacatcagca agacattctg cctggtgcat atcgtggtct 600
gaggctcaaa gacaatcgat ttactcagat cccaactact tggacgggta ctatccggta 660
gaggagcaac ctgtggccgg actatcggct gcacgtatgt ctgcattgtt gacgtacagg 720
acaagaaaca gtttcgagaa caaattctcc agaagatctc cttcaatagc acaacaacaa 780
aaagctcaaa gggaggagac acgcaaacca tctactgtca gcgaacactc cctacaaatc 840
cacaatgatg ggtataaaac aaaagccagc actgccatcg ctggcatttc tgggcaaaaa 900
ggtcaaagcg tggtgtccac cgcatcttct tcggattcat tgaattcttc aacatcgatg 960
acttcggtaa gttctgtaac gggtgaagtg aaggacataa agcctgcgca gacgtatttt 1020
tctgcacaaa gttacttgag gtaccagggc acaaagttca tcaataggtt cgacgccaat 1080
tgttacattg ccatcacacg taaactggat acgcacgatt tggcaagaga cagagtagat 1140
gacatcactg aggtcctttc taccatccaa caaccatccc tgatcatcgg tatccaatct 1200
gatggactgt tcacatattc agaacaagaa tttttggctg agcacatacc gaagtcgcaa 1260
ttagaaaaaa ttgaatctcc cgaaggccac gatgccttcc tattggagtt taagctgata 1320
aacaaactga tagtacaatt tttaaaaacc aactgcaagg ccattaccga tgccgctcca 1380
agagcttggg gaggtgacgt tggtaacgat gaaacgaaga cgtctgtctt tggtgaggcc 1440
gaagaagtta ccaactggta g 1461
<210> 7
<211> 486
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2; METX)
<220>
<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2; METX)
<400> 7
Met Ser His Thr Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Glu
1 5 10 15
Glu Ile Lys Glu Thr Asn Pro Leu Leu Lys Leu Val Gln Gly Gln Arg
20 25 30
Ile Val Gln Val Pro Glu Leu Val Leu Glu Ser Gly Val Val Ile Asn
35 40 45
Asn Phe Pro Ile Ala Tyr Lys Thr Trp Gly Thr Leu Asn Glu Ala Gly
50 55 60
Asp Asn Val Leu Val Ile Cys His Ala Leu Thr Gly Ser Ala Asp Val
65 70 75 80
Ala Asp Trp Trp Gly Pro Leu Leu Gly Asn Asp Leu Ala Phe Asp Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Phe Ile Ile Cys Leu Asn Ser Met Gly Ser Pro Tyr Gly
100 105 110
Ser Phe Ser Pro Leu Thr Ile Asn Glu Glu Thr Gly Val Arg Tyr Gly
115 120 125
Pro Glu Phe Pro Leu Cys Thr Val Arg Asp Asp Val Arg Ala His Arg
130 135 140
Ile Val Leu Asp Ser Leu Gly Val Lys Ser Ile Ala Cys Val Ile Gly
145 150 155 160
Gly Ser Met Gly Gly Met Leu Ser Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Gly
165 170 175
Lys Glu Tyr Val Lys Asn Met Val Ala Leu Ala Thr Ser Ala Arg His
180 185 190
Ser Ala Trp Cys Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Arg Gln Ser Ile Tyr
195 200 205
Ser Asp Pro Asn Tyr Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Glu Glu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Arg Met Ser Ala Leu Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Thr Arg Asn Ser Phe Glu Asn Lys Phe Ser Arg Arg Ser Pro Ser Ile
245 250 255
Ala Gln Gln Gln Lys Ala Gln Arg Glu Glu Thr Arg Lys Pro Ser Thr
260 265 270
Val Ser Glu His Ser Leu Gln Ile His Asn Asp Gly Tyr Lys Thr Lys
275 280 285
Ala Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ile Ser Gly Gln Lys Gly Gln Ser Val
290 295 300
Val Ser Thr Ala Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Ser Ser Thr Ser Met
305 310 315 320
Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Asp Ile Lys Pro Ala
325 330 335
Gln Thr Tyr Phe Ser Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Thr Lys
340 345 350
Phe Ile Asn Arg Phe Asp Ala Asn Cys Tyr Ile Ala Ile Thr Arg Lys
355 360 365
Leu Asp Thr His Asp Leu Ala Arg Asp Arg Val Asp Asp Ile Thr Glu
370 375 380
Val Leu Ser Thr Ile Gln Gln Pro Ser Leu Ile Ile Gly Ile Gln Ser
385 390 395 400
Asp Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Ile
405 410 415
Pro Lys Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Ser Pro Glu Gly His Asp Ala
420 425 430
Phe Leu Leu Glu Phe Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ile Val Gln Phe Leu
435 440 445
Lys Thr Asn Cys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Pro Arg Ala Trp Gly
450 455 460
Gly Asp Val Gly Asn Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala
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Glu Glu Val Thr Asn Trp
485
<210> 8
<211> 1335
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)
<220>
<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)
<400> 8
atgccatctc atttcgatac tgttcaacta cacgccggcc aagagaaccc tggtgacaat 60
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ttggctgttt cctccggtca agccgctcaa acccttgcca tccaaggttt ggcacacact 300
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tcgttcaaaa gatttggtat cgaggctaga tttgttgaag gtgacaatcc agaagaattc 420
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gtcgttgaca acacatttgg tgccggtggt tacttctgtc agccaattaa atacggtgct 600
gatattgtaa cacattctgc taccaaatgg attggtggtc atggtactac tatcggtggt 660
attattgttg actctggtaa gttcccatgg aaggactacc cagaaaagtt ccctcaattc 720
tctcaacctg ccgaaggata tcacggtact atctacaatg aagcctacgg taacttggca 780
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gcctctttct tgctactaca aggtgttgaa acattatctt tgagagctga aagacacggt 900
gaaaatgcat tgaagttagc caaatggtta gaacaatccc catacgtatc ttgggtttca 960
taccctggtt tagcatctca ttctcatcat gaaaatgcta agaagtatct atctaacggt 1020
ttcggtggtg tcttatcttt cggtgtaaaa gacttaccaa atgccgacaa ggaaactgac 1080
ccattcaaac tttctggtgc tcaagttgtt gacaatttaa agcttgcctc taacttggcc 1140
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ggccaaaaac catga 1335
<210> 9
<211> 444
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)
<220>
<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)
<400> 9
Met Pro Ser His Phe Asp Thr Val Gln Leu His Ala Gly Gln Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Asp Asn Ala His Arg Ser Arg Ala Val Pro Ile Tyr Ala Thr
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Thr Ser Tyr Val Phe Glu Asn Ser Lys His Gly Ser Gln Leu Phe Gly
35 40 45
Leu Glu Val Pro Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Phe Gln Asn Pro Thr Ser
50 55 60
Asn Val Leu Glu Glu Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Gly Ala Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ser Gly Gln Ala Ala Gln Thr Leu Ala Ile Gln Gly
85 90 95
Leu Ala His Thr Gly Asp Asn Ile Val Ser Thr Ser Tyr Leu Tyr Gly
100 105 110
Gly Thr Tyr Asn Gln Phe Lys Ile Ser Phe Lys Arg Phe Gly Ile Glu
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Ala Arg Phe Val Glu Gly Asp Asn Pro Glu Glu Phe Glu Lys Val Phe
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Asp Glu Arg Thr Lys Ala Val Tyr Leu Glu Thr Ile Gly Asn Pro Lys
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Tyr Asn Val Pro Asp Phe Glu Lys Ile Val Ala Ile Ala His Lys His
165 170 175
Gly Ile Pro Val Val Val Asp Asn Thr Phe Gly Ala Gly Gly Tyr Phe
180 185 190
Cys Gln Pro Ile Lys Tyr Gly Ala Asp Ile Val Thr His Ser Ala Thr
195 200 205
Lys Trp Ile Gly Gly His Gly Thr Thr Ile Gly Gly Ile Ile Val Asp
210 215 220
Ser Gly Lys Phe Pro Trp Lys Asp Tyr Pro Glu Lys Phe Pro Gln Phe
225 230 235 240
Ser Gln Pro Ala Glu Gly Tyr His Gly Thr Ile Tyr Asn Glu Ala Tyr
245 250 255
Gly Asn Leu Ala Tyr Ile Val His Val Arg Thr Glu Leu Leu Arg Asp
260 265 270
Leu Gly Pro Leu Met Asn Pro Phe Ala Ser Phe Leu Leu Leu Gln Gly
275 280 285
Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Ala Glu Arg His Gly Glu Asn Ala Leu
290 295 300
Lys Leu Ala Lys Trp Leu Glu Gln Ser Pro Tyr Val Ser Trp Val Ser
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Tyr Pro Gly Leu Ala Ser His Ser His His Glu Asn Ala Lys Lys Tyr
325 330 335
Leu Ser Asn Gly Phe Gly Gly Val Leu Ser Phe Gly Val Lys Asp Leu
340 345 350
Pro Asn Ala Asp Lys Glu Thr Asp Pro Phe Lys Leu Ser Gly Ala Gln
355 360 365
Val Val Asp Asn Leu Lys Leu Ala Ser Asn Leu Ala Asn Val Gly Asp
370 375 380
Ala Lys Thr Leu Val Ile Ala Pro Tyr Phe Thr Thr His Lys Gln Leu
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Asn Asp Lys Glu Lys Leu Ala Ser Gly Val Thr Lys Asp Leu Ile Arg
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Val Ser Val Gly Ile Glu Phe Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Phe Gln
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Gln Ser Phe Glu Thr Val Phe Ala Gly Gln Lys Pro
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)
<220>
<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)
<400> 10
atggttcgtg ccttcaaaat taaagttcca gcttcttccg ccaatatcgg ccctggttat 60
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<210> 11
<211> 357
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)
<220>
<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)
<400> 11
Met Val Arg Ala Phe Lys Ile Lys Val Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ile
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Gly Pro Gly Tyr Asp Val Leu Gly Val Gly Leu Ser Leu Phe Leu Glu
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195 200 205
Gln Trp Asn Pro Ala Ile Lys Cys Ile Ala Ile Ile Pro Gln Phe Glu
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Leu Ser Thr Ala Asp Ser Arg Gly Val Leu Pro Lys Ala Tyr Pro Thr
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Gln Asp Leu Val Phe Asn Leu Gln Arg Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala
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Asp Arg Val His Gln Pro Tyr Arg Lys Thr Leu Ile Pro Gly Leu Thr
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Ser Val Glu Gln Gln
355
<210> 12
<211> 2461
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<223> 胱硫醚γ合酶1 (CGS1)
<220>
<223> 胱硫醚γ合酶1 (CGS1)
<400> 12
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atttcgattt gtagatctca gcaaaatcca tgtcttgaga gaatgattaa tgggcctttt 2460
t 2461
<210> 13
<211> 507
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<223> 胱硫醚γ合酶1 (CGS1)
<220>
<223> 胱硫醚γ合酶1 (CGS1)
<400> 13
Met Ser Ser Arg Ile Leu Arg Phe Pro Pro Asn Phe Val Arg Gln Leu
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Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ala Val Ser Ser Ala Ala
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Asn Thr Ser Ala Tyr Phe Phe Lys Lys Thr Ala Glu Leu Ile Asp Phe
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Tyr Arg Lys Thr Arg Ile Phe Met Glu Asn Phe Leu Pro Lys Leu Gly
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Ile Thr Val Thr Val Ile Asp Pro Ala Asp Ile Ala Gly Leu Glu Ala
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Leu Asn Gln Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser
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Ala Thr Lys Tyr Ile Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Cys Ile
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Cys Gly Ser Leu Lys Leu Val Ser Glu Ile Arg Asn Leu His His Val
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Leu Gly Gly Pro Leu Asn Pro Asn Ala Ala Tyr Leu Ile Ile Arg Gly
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<210> 14
<211> 1257
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)
<220>
<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)
<400> 14
atgtctgcca ctctgttcaa taacatcgaa ttgctgcccc ctgatgccct ttttggtatt 60
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ctttcaacgg tctctcccgt ctttgtctgt cagtcctttg ccaagaacgc cggtatgtac 780
ggtgagcgtg taggttgttt ccatctagca cttacaaaac aagctcaaaa caaaactata 840
aagcctgctg ttacatctca attggccaaa atcattcgta gtgaagtgtc caacccaccc 900
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<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)
<220>
<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)
<400> 15
Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala
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Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys
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180 185 190
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195 200 205
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340 345 350
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355 360 365
Gln Met Val Lys Arg Leu Glu Glu Thr His Ala Val Tyr Leu Val Ala
370 375 380
Ser Gly Arg Ala Ser Ile Ala Gly Leu Asn Gln Gly Asn Val Glu Tyr
385 390 395 400
Val Ala Lys Ala Ile Asp Glu Val Val Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ala
405 410 415
Lys Leu
<210> 16
<211> 1317
<212> DNA
<213> 尖尾内旋纤毛虫（Entodinium caudatum）
<220>
<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)
<220>
<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)
<400> 16
atgatagatt tagaagcgag aaaccctgct caacccgaat tcattcaagc cagtagagaa 60
gtaatcgaat cgatcattga tgttgttaat agcaatccga aatacctgga aaacaaaatt 120
ttggagagaa ttacggaacc aaacctaatt cacgaattca aagtcgaatg ggagaatgac 180
aagcacgaaa tcatggtgaa caaaggttat cgtattcagt tcaataatgc gataggtccc 240
tataagggag gcctaaggtt tcacagagca gtcactctag gtactctgaa attccttggt 300
tttgaacaga tatttaagaa ttccttgaca ggattaccta tgggaggtgg caaaggtggt 360
tcagattttg atcctagagg taaatcagat gccgagattt taagattctg taggtctttt 420
atgacttcgt tgttcaaata tattgggcca gagatagatg ttcctgctgg agatataggt 480
gtcggaggta gggaaattgg ttacttgttt ggccaataca aaagactgac ccaacaacat 540
gaaggagttc taactggtaa gggtcttaac tggggtggct ctcttgttag acctgaagcc 600
acaggttttg gaacgatgta ttttgctaac gaagtcttac atgcacatgg tgacgacatc 660
aaggggaaaa ccattgccat atccggattt ggtaatgttg cctttggtgc tgtcttaaaa 720
gcgaaacaat taggcgctaa ggtagtcact atatctggcc cagatggtta catttatgac 780
gagaatggga taaacaccga cgagaaaatc aactacatgt tggaattaag agcctcaaat 840
aatgatgtgg ttgcgccatt tgcagagaag tttggtgcaa aattcatacc agggaagaag 900
ccatgggaag ttccagtgga tatggctttt ccctgtgcca ttcagaacga attgaatgcc 960
gaagatgctg ccactttaca taagaatgga gtgaaatatg tgatcgagac atccaatatg 1020
ggctgtacag cagatgctgt gcaatacttc attaagaacc gtattgtttt cgctccgggt 1080
aaagcagcta atgctggtgg tgttgcagta tctgggttgg aaatgagcca aaactcaatg 1140
aagttgaact ggacagctga agaagttgac gctaaattga agaatatcat gaccaatatt 1200
catgcaagtt gcgtaaagga aggaaaagag agtgacgggt atatcaatta cgttaaaggc 1260
gcaaatatag caggcttcaa gaaagtagct gatgcaatgg tagatcttgg ctattaa 1317
<210> 17
<211> 438
<212> PRT
<213> 尖尾内旋纤毛虫（Entodinium caudatum）
<220>
<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)
<220>
<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)
<400> 17
Met Ile Asp Leu Glu Ala Arg Asn Pro Ala Gln Pro Glu Phe Ile Gln
1 5 10 15
Ala Ser Arg Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Val Val Asn Ser Asn
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Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Lys Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Pro Asn
35 40 45
Leu Ile His Glu Phe Lys Val Glu Trp Glu Asn Asp Lys His Glu Ile
50 55 60
Met Val Asn Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Phe Asn Asn Ala Ile Gly Pro
65 70 75 80
Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Arg Ala Val Thr Leu Gly Thr Leu
85 90 95
Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu
100 105 110
Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Arg Gly Lys
115 120 125
Ser Asp Ala Glu Ile Leu Arg Phe Cys Arg Ser Phe Met Thr Ser Leu
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Phe Lys Tyr Ile Gly Pro Glu Ile Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly
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Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu
165 170 175
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180 185 190
Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu Ala Thr Gly Phe Gly Thr Met Tyr Phe
195 200 205
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210 215 220
Ile Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn Val Ala Phe Gly Ala Val Leu Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gln Leu Gly Ala Lys Val Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly
245 250 255
Tyr Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Ile Asn Thr Asp Glu Lys Ile Asn Tyr
260 265 270
Met Leu Glu Leu Arg Ala Ser Asn Asn Asp Val Val Ala Pro Phe Ala
275 280 285
Glu Lys Phe Gly Ala Lys Phe Ile Pro Gly Lys Lys Pro Trp Glu Val
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Pro Val Asp Met Ala Phe Pro Cys Ala Ile Gln Asn Glu Leu Asn Ala
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Glu Asp Ala Ala Thr Leu His Lys Asn Gly Val Lys Tyr Val Ile Glu
325 330 335
Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Phe Ile Lys
340 345 350
Asn Arg Ile Val Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val
355 360 365
Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Lys Leu Asn Trp
370 375 380
Thr Ala Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu Lys Asn Ile Met Thr Asn Ile
385 390 395 400
His Ala Ser Cys Val Lys Glu Gly Lys Glu Ser Asp Gly Tyr Ile Asn
405 410 415
Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala
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Met Val Asp Leu Gly Tyr
435
<210> 18
<211> 1080
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)
<220>
<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)
<400> 18
atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc 60
ttggatcaat tgttagccat gaagtctacc attacttaca atctagttct tttggctgaa 120
gctgagcgtt ctttaatctc caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag 180
gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg 240
aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt 300
ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt 360
tcctctgatt tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc 420
tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt 480
caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt 540
ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt 600
gctaaaaaat tgggttatac tgaaccagat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt 660
gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc 720
ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc 780
ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact 840
gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccaccaaatc tgtgtctgta 900
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gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttaa 1080
<210> 19
<211> 308
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)
<220>
<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)
<400> 19
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Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr
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Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys
35 40 45
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Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile
100 105 110
Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys
115 120 125
Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala
130 135 140
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Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr
165 170 175
Leu Ser Tyr Ile Phe Asn Glu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Asn Asp Val
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195 200 205
Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Asn Gly Leu Asp Val Ala Arg Lys Val
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Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser
225 230 235 240
Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser
245 250 255
Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr
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Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile
275 280 285
Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys
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Tyr Asp Tyr Ser
305
<210> 20
<211> 1503
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 芳香族氨基转移酶I (ARO8)
<220>
<223> 芳香族氨基转移酶I (ARO8)
<400> 20
atgactttac ctgaatcaaa agacttttct tacttgtttt cggatgaaac caatgctcgt 60
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aaagacttga aggaaagaga gaaggcacaa agttctccaa agcaggacca tgacgaattt 840
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ttgcttggcc tgcgtcatga atacactttg aaacgtgact gtgccatcga tgccctttac 1140
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tag 1503
<210> 21
<211> 500
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 芳香族氨基转移酶I (ARO8)
<220>
<223> 芳香族氨基转移酶I (ARO8)
<400> 21
Met Thr Leu Pro Glu Ser Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Phe Ser Asp Glu
1 5 10 15
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Tyr Phe Pro Trp Asp Asn Leu Ser Val Asp Ser Pro Lys Pro Pro Phe
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Gly Val Ile Thr Phe Pro Val Pro Ile Asp Ala Asp Gly Ile Ile Pro
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195 200 205
Pro Lys Leu Leu Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Thr Gly Thr
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Tyr Asp Phe Leu Ile Val Glu Asp Glu Pro Tyr Tyr Phe Leu Gln Met
245 250 255
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260 265 270
Pro Lys Gln Asp His Asp Glu Phe Leu Lys Ser Leu Ala Asn Thr Phe
275 280 285
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290 295 300
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Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Leu Ser Leu His Glu Met Thr Ile Gln Ala
325 330 335
Pro Ala Gly Phe Thr Gln Val Leu Val Asn Ala Thr Leu Ser Arg Trp
340 345 350
Gly Gln Lys Gly Tyr Leu Asp Trp Leu Leu Gly Leu Arg His Glu Tyr
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Gln Ser Asp Ala Phe Val Ile Asn Pro Pro Ile Ala Gly Met Phe Phe
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405 410 415
Asn Ser Asp Pro Tyr Gln Leu Glu Gln Ser Leu Tyr His Lys Val Val
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<210> 22
<211> 1134
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 胞浆支链氨基酸（BCAA）氨基转移酶 (BAT2)
<220>
<223> 胞浆支链氨基酸（BCAA）氨基转移酶 (BAT2)
<400> 22
atgatgacct tggcacccct agacgcctcc aaagttaaga taactaccac acaacatgca 60
tctaagccaa aaccgaacag tgagttagtg tttggcaaga gcttcacgga ccacatgtta 120
actgcggaat ggacagctga aaaagggtgg ggtaccccag agattaaacc ttatcaaaat 180
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accatgaatg cttttttcgt gtttaaagat agtaaaacgg gcaagaagga actagttact 780
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<210> 23
<211> 377
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 胞浆支链氨基酸（BCAA）氨基转移酶 (BAT2)
<220>
<223> 胞浆支链氨基酸（BCAA）氨基转移酶 (BAT2)
<400> 23
Met Met Thr Leu Ala Pro Leu Asp Ala Ser Lys Val Lys Ile Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gln His Ala Ser Lys Pro Lys Pro Asn Ser Glu Leu Val Phe Gly
20 25 30
Lys Ser Phe Thr Asp His Met Leu Thr Ala Glu Trp Thr Ala Glu Lys
35 40 45
Gly Trp Gly Thr Pro Glu Ile Lys Pro Tyr Gln Asn Leu Ser Leu Asp
50 55 60
Pro Ser Ala Val Val Phe His Tyr Ala Phe Glu Leu Phe Glu Gly Met
65 70 75 80
Lys Ala Tyr Arg Thr Val Asp Asn Lys Ile Thr Met Phe Arg Pro Asp
85 90 95
Met Asn Met Lys Arg Met Asn Lys Ser Ala Gln Arg Ile Cys Leu Pro
100 105 110
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115 120 125
Gln Asp Lys Cys Leu Val Pro Glu Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Tyr Ile
130 135 140
Arg Pro Thr Leu Ile Gly Thr Thr Ala Gly Leu Gly Val Ser Thr Pro
145 150 155 160
Asp Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ile Cys Cys Pro Val Gly Pro Tyr Tyr
165 170 175
Lys Thr Gly Phe Lys Ala Val Arg Leu Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Thr
180 185 190
Arg Ala Trp Pro Gly Gly Cys Gly Asp Lys Lys Leu Gly Ala Asn Tyr
195 200 205
Ala Pro Cys Val Leu Pro Gln Leu Gln Ala Ala Ser Arg Gly Tyr Gln
210 215 220
Gln Asn Leu Trp Leu Phe Gly Pro Asn Asn Asn Ile Thr Glu Val Gly
225 230 235 240
Thr Met Asn Ala Phe Phe Val Phe Lys Asp Ser Lys Thr Gly Lys Lys
245 250 255
Glu Leu Val Thr Ala Pro Leu Asp Gly Thr Ile Leu Glu Gly Val Thr
260 265 270
Arg Asp Ser Ile Leu Asn Leu Ala Lys Glu Arg Leu Glu Pro Ser Glu
275 280 285
Trp Thr Ile Ser Glu Arg Tyr Phe Thr Ile Gly Glu Val Thr Glu Arg
290 295 300
Ser Lys Asn Gly Glu Leu Leu Glu Ala Phe Gly Ser Gly Thr Ala Ala
305 310 315 320
Ile Val Ser Pro Ile Lys Glu Ile Gly Trp Lys Gly Glu Gln Ile Asn
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<210> 24
<211> 939
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<400> 24
atgcgaatta cgatagcggg tgctggtgct atgggctctc gcttcggatt aatgcttcac 60
cgcggtggca atgaagttac cctagtggat ggatggttgg aacatgttac agccatcaaa 120
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aagaaactag ctgacatcct gagcgcctct gggttaaatg ccaattattc cgacaacatc 540
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gtggttgaac atgtagaaac atgcttcgat cccgaaacta ttggcttgca ctacccatcg 780
atgtatcaag acctgattaa taacaatcgt ttgactgaga tagactacat aaatggagct 840
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ttagttcata gtaaagagga gttgctcaaa gcaaaataa 939
<210> 25
<211> 939
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<400> 25
atgagaatca caatcgccgg agccggggct atgggatctc gctttggact tatgttacat 60
aagggtggaa atgaagtaac gttaatcgac ggttggccag agcatgtaaa agcaatcaaa 120
gaacatggct tgagagctaa ctataacggt gaagaattga cagctcactt gtctgtggag 180
cttcaaagcg aaatcagttc taaagaaaag accgacctca tcatactgtt cacgaaagct 240
atgcagcttg ataagatgct ccaagatata aaacccctga tagatgagca cacgaaggtc 300
ctatgtcttt taaatggcat tggacacgag gacacgattg aaaagtatgt gtccaagaat 360
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aagaagctcg cagaaattct ttcggaatca ggtctaaatg caaaatattc caacaacatt 540
cattactcaa tctaccgtaa ggcgtgcgtt aatggaacca tgaatggttt gtgtacaatt 600
ttagacacga atatggccgg tttaggcgag acaaagcctg cgcatgatat ggtcgttacc 660
atcgtcaatg aatttgctgc cgtggctaag tttgagaatg ttaatctcga cattgctgaa 720
gtggtacagc atgttgaaac ttgcttcgat ccgtccacaa ttggcttaca ttacccatct 780
atgtatcagg acttaatcaa gaataatcgt cttacagaga ttgattatat aaatggcgcc 840
gtttcccgaa agggcaagaa gtacaacgtc gcaactccat attgtgactt cttgactcag 900
ttagtacata gtaaagagga actgctaaag gcaaagtaa 939
<210> 26
<211> 312
<212> PRT
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<400> 26
Met Arg Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Ala Met Gly Ser Arg Phe Gly
1 5 10 15
Leu Met Leu His Arg Gly Gly Asn Glu Val Thr Leu Val Asp Gly Trp
20 25 30
Leu Glu His Val Thr Ala Ile Lys Glu His Gly Leu Gln Ala Asn Phe
35 40 45
Asn Gly Glu Glu Ile Thr Ala His Leu Ser Val Glu Leu Gln Ser Asn
50 55 60
Ile Ser Ser Glu Glu Lys Thr Asp Leu Ile Ile Leu Phe Thr Lys Ala
65 70 75 80
Met Gln Leu Asp Lys Met Leu Gln Asp Ile Lys Pro Leu Ile Ala Glu
85 90 95
His Thr Lys Val Leu Cys Leu Leu Asn Gly Ile Gly His Glu Asp Ile
100 105 110
Ile Glu Lys Tyr Val Ser Lys Asn Asn Ile Phe Ile Gly Asn Thr Met
115 120 125
Trp Thr Ala Gly Leu Glu Gly Pro Gly Lys Ala Lys Leu Phe Gly Asn
130 135 140
Gly Ser Val Glu Leu Gln Asn Phe Ile Pro Gly Glu Glu Glu Thr Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Ala Asp Ile Leu Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ala Asn Tyr
165 170 175
Ser Asp Asn Ile His Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Ala Cys Val Asn Gly
180 185 190
Thr Met Asn Gly Leu Cys Thr Ile Leu Asp Thr Asn Met Ala Gly Leu
195 200 205
Gly Ala Thr Lys Pro Ala His Asp Met Val Val Thr Ile Val Lys Glu
210 215 220
Phe Ala Ala Val Ala Lys His Glu Asp Val Asn Leu Asp Ile Asp Glu
225 230 235 240
Val Val Glu His Val Glu Thr Cys Phe Asp Pro Glu Thr Ile Gly Leu
245 250 255
His Tyr Pro Ser Met Tyr Gln Asp Leu Ile Asn Asn Asn Arg Leu Thr
260 265 270
Glu Ile Asp Tyr Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Lys Gly Lys Lys Tyr
275 280 285
Gln Ile Ala Thr Pro Tyr Cys Asp Phe Leu Thr Gln Leu Val His Ser
290 295 300
Lys Glu Glu Leu Leu Lys Ala Lys
305 310
<210> 27
<211> 312
<212> PRT
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<220>
<223> 2-羟酸脱氢酶 (KDH)
<400> 27
Met Arg Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Ala Met Gly Ser Arg Phe Gly
1 5 10 15
Leu Met Leu His Lys Gly Gly Asn Glu Val Thr Leu Ile Asp Gly Trp
20 25 30
Pro Glu His Val Lys Ala Ile Lys Glu His Gly Leu Arg Ala Asn Tyr
35 40 45
Asn Gly Glu Glu Leu Thr Ala His Leu Ser Val Glu Leu Gln Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Ser Lys Glu Lys Thr Asp Leu Ile Ile Leu Phe Thr Lys Ala
65 70 75 80
Met Gln Leu Asp Lys Met Leu Gln Asp Ile Lys Pro Leu Ile Asp Glu
85 90 95
His Thr Lys Val Leu Cys Leu Leu Asn Gly Ile Gly His Glu Asp Thr
100 105 110
Ile Glu Lys Tyr Val Ser Lys Asn Asn Ile Phe Ile Gly Asn Thr Met
115 120 125
Trp Thr Ala Gly Leu Glu Gly Pro Gly Lys Ala Lys Leu Phe Gly Asp
130 135 140
Gly Ser Val Glu Leu Gln Asn Leu Ile Ser Gly Glu Glu Glu Thr Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Ala Glu Ile Leu Ser Glu Ser Gly Leu Asn Ala Lys Tyr
165 170 175
Ser Asn Asn Ile His Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Ala Cys Val Asn Gly
180 185 190
Thr Met Asn Gly Leu Cys Thr Ile Leu Asp Thr Asn Met Ala Gly Leu
195 200 205
Gly Glu Thr Lys Pro Ala His Asp Met Val Val Thr Ile Val Asn Glu
210 215 220
Phe Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu Asn Val Asn Leu Asp Ile Ala Glu
225 230 235 240
Val Val Gln His Val Glu Thr Cys Phe Asp Pro Ser Thr Ile Gly Leu
245 250 255
His Tyr Pro Ser Met Tyr Gln Asp Leu Ile Lys Asn Asn Arg Leu Thr
260 265 270
Glu Ile Asp Tyr Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Lys Gly Lys Lys Tyr
275 280 285
Asn Val Ala Thr Pro Tyr Cys Asp Phe Leu Thr Gln Leu Val His Ser
290 295 300
Lys Glu Glu Leu Leu Lys Ala Lys
305 310
<210> 28
<211> 1908
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 苯丙酮酸脱羧酶 (ARO10)
<220>
<223> 苯丙酮酸脱羧酶 (ARO10)
<400> 28
atggcacctg ttacaattga aaagttcgta aatcaagaag aacgacacct tgtttccaac 60
cgatcagcaa caattccgtt tggtgaatac atatttaaaa gattgttgtc catcgatacg 120
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cctagtgttg aatcagctgg cctaagatgg gtcggcacgt gtaatgaact gaacgccgct 240
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gttttgcaca ttgttggtgt ggccaagtcc atagattcgc gttcaagtaa ctttagtgat 420
cggaacctac atcatttggt cccacagcta catgattcaa attttaaagg gccaaatcat 480
aaagtatatc atgatatggt aaaagataga gtcgcttgct cggtagccta cttggaggat 540
attgaaactg catgtgacca agtcgataat gttatccgcg atatttacaa gtattctaaa 600
cctggttata tttttgttcc tgcagatttt gcggatatgt ctgttacatg tgataatttg 660
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ggagacgtac tgactgatag gtatggtgtg agtaactttt tgaacaagct tatctgcaaa 840
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acttatatgg gtcaatataa tggtaaagaa ggtttaaaac aagtctatga acattttgaa 960
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acttttactt ataaaccaaa tgctaaaatc attcaatttc atccgaatta tattcgcctt 1080
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gttggaattg ccatgcaaga ccactcaaac gctcacatca atggtggcaa cgtaaaagag 1500
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<210> 29
<211> 635
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 苯丙酮酸脱羧酶 (ARO10)
<220>
<223> 苯丙酮酸脱羧酶 (ARO10)
<400> 29
Met Ala Pro Val Thr Ile Glu Lys Phe Val Asn Gln Glu Glu Arg His
1 5 10 15
Leu Val Ser Asn Arg Ser Ala Thr Ile Pro Phe Gly Glu Tyr Ile Phe
20 25 30
Lys Arg Leu Leu Ser Ile Asp Thr Lys Ser Val Phe Gly Val Pro Gly
35 40 45
Asp Phe Asn Leu Ser Leu Leu Glu Tyr Leu Tyr Ser Pro Ser Val Glu
50 55 60
Ser Ala Gly Leu Arg Trp Val Gly Thr Cys Asn Glu Leu Asn Ala Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Ser Asn Lys Ile Gly Cys Leu
85 90 95
Ile Thr Thr Tyr Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Leu Asn Gly Ile Ala
100 105 110
Gly Ser Phe Ala Glu Asn Val Lys Val Leu His Ile Val Gly Val Ala
115 120 125
Lys Ser Ile Asp Ser Arg Ser Ser Asn Phe Ser Asp Arg Asn Leu His
130 135 140
His Leu Val Pro Gln Leu His Asp Ser Asn Phe Lys Gly Pro Asn His
145 150 155 160
Lys Val Tyr His Asp Met Val Lys Asp Arg Val Ala Cys Ser Val Ala
165 170 175
Tyr Leu Glu Asp Ile Glu Thr Ala Cys Asp Gln Val Asp Asn Val Ile
180 185 190
Arg Asp Ile Tyr Lys Tyr Ser Lys Pro Gly Tyr Ile Phe Val Pro Ala
195 200 205
Asp Phe Ala Asp Met Ser Val Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Val Pro
210 215 220
Arg Ile Ser Gln Gln Asp Cys Ile Val Tyr Pro Ser Glu Asn Gln Leu
225 230 235 240
Ser Asp Ile Ile Asn Lys Ile Thr Ser Trp Ile Tyr Ser Ser Lys Thr
245 250 255
Pro Ala Ile Leu Gly Asp Val Leu Thr Asp Arg Tyr Gly Val Ser Asn
260 265 270
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275 280 285
Val Met Gly Lys Ser Val Ile Asp Glu Ser Asn Pro Thr Tyr Met Gly
290 295 300
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370 375 380
Lys Arg Ile Asp Val Ser Lys Leu Ser Leu Gln Tyr Asp Ser Asn Val
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405 410 415
Gln Ser Ser Ile Ile Thr Gln Val His Leu Gln Lys Thr Met Pro Lys
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Asn Val Lys Glu Asp Tyr Lys Pro Arg Leu Ile Leu Phe Glu Gly Asp
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Gly Ala Ala Gln Met Thr Ile Gln Glu Leu Ser Thr Ile Leu Lys Cys
515 520 525
Asn Ile Pro Leu Glu Val Ile Ile Trp Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Ile
530 535 540
Glu Arg Ala Ile Met Gly Pro Thr Arg Ser Tyr Asn Asp Val Met Ser
545 550 555 560
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565 570 575
Tyr Thr Asn Ser Thr Leu Ile Gln Cys Pro Ser Lys Leu Ala Leu Lys
580 585 590
Leu Glu Glu Leu Lys Asn Ser Asn Lys Arg Ser Gly Ile Glu Leu Leu
595 600 605
Glu Val Lys Leu Gly Glu Leu Asp Phe Pro Glu Gln Leu Lys Cys Met
610 615 620
Val Glu Ala Ala Ala Leu Lys Arg Asn Lys Lys
625 630 635
<210> 30
<211> 1341
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 30
atgggtattg tcgtaatagg tactaaccat gccggaatag ctacagcaaa taccttaatc 60
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gctgcgttga atgctaaata a 1341
<210> 31
<211> 1380
<212> DNA
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 31
atgtctaaga tagtggtagt tggtgctaac catgcaggaa ctgcttgcat caatacgatg 60
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<210> 32
<211> 1341
<212> DNA
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 32
atgtctgtgg ttgtcgtagg ctgtacacat gctggtacta gtgcagtgaa atctatccta 60
gctaatcatc ccgaagctga agtcactgtt tatgaacgta atgacaacat atccttcttg 120
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tgtgttggct ttagaccaaa taccgaactt ttgaaagaca aagttgatat gttgcctaac 780
ggtgcaattg aggttaacga gtatatgcaa acgtccaatc cagatatctt tgctgctggt 840
gattcagccg tagtgcatta caacccatcg caaacgaaga attatattcc cttagcgact 900
aatgcagtaa gacagggtat gttggtgggg agaaacttga cagaacagaa acttgcctat 960
agaggcaccc aaggtacgtc tggcttgtac ttgttcggtt ggaaaattgg ctcaacagga 1020
gtaaccaaag aatcggcaaa attgaatggg ttagatgttg aagctacagt ctttgaggat 1080
aactatagac ctgaattcat gccaacaacc gaaaaggtgc tgatggagct ggtgtacgaa 1140
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gcagctctgg agaacatgta a 1341
<210> 33
<211> 1356
<212> DNA
<213> 短乳杆菌（Lactobacillus brevis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 33
atgtctaagg ttaccgtggt aggttgtaca catgccggta cttttgcaat caaacagatt 60
ttggcagaac atcctgatgc agaagtaaca gtctatgaga gaaatgacgt gattagcttc 120
ttgtcgtgtg gcatagcgtt gtacttgggt gggaaagttg ctgaccctca agggcttttc 180
tactcatcac cagaagagtt acaaaagctt ggggcgaatg tccaaatgaa ccacaacgtt 240
ttagcgatag atccagatca aaagactgtt actgttgaag atctaacgag tcatgctcag 300
acaacagaat cctatgacaa gttagtcatg acttcaggtt cttggccgat agttcccaaa 360
ataccaggta ttgactccga tagagtcaag ctgtgcaaga attgggctca tgcacaagct 420
ttgattgaag atgctaaaga agcgaaaaga attactgtca ttggcgctgg ttatatcggt 480
gccgaattgg ccgaagcgta ttctactaca ggtcacgacg taacgttgat agacgcaatg 540
gatagagtaa tgcccaaata ctttgatgca gattttaccg atgtcattga gcaagattat 600
cgtgatcatg gagtgcaatt agccttgagt gaaactgttg aatcgtttac agacagtgct 660
acaggattga ccataaagac tgacaagaat agttacgaaa cagatcttgc catcttatgc 720
attggcttta gaccaaatac ggatctgctg aaaggaaaag ttgatatggc accaaatggt 780
gctattatta ccgatgacta tatgcgttcc tctaatccgg acatatttgc tgcaggagac 840
tctgctgcag ttcactataa ccctacacac cagaatgcat atatcccact agccacaaat 900
gctgtgagac aaggtatatt agtaggcaag aatttggtca aaccgaccgt taaatacatg 960
ggtacgcaaa gctcttcagg tcttgccctg tacgatagga ctattgtttc gaccggctta 1020
acgctagcag cagctaaaca acagggtgtt aatgctgaac aggtgatcgt tgaggacaat 1080
tatagacctg agtttatgcc ttcaactgaa cccgtgctaa tgagcttagt ctttgatcca 1140
gatactcata ggatcttagg aggagctttg atgtccaaat acgatgtatc ccagtctgca 1200
aacaccttgt ctgtgtgtat ccaaaacgag aatactattg atgacttagc catggttgat 1260
atgcttttcc aacctaactt cgatagacca ttcaactatc taaacatttt ggctcaagct 1320
gctcaagcca aagtagctca atcagtaaac gcctag 1356
<210> 34
<211> 446
<212> PRT
<213> 乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 34
Met Gly Ile Val Val Ile Gly Thr Asn His Ala Gly Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Asn Thr Leu Ile Asp Gln Tyr Pro Gly His Glu Ile Val Met Ile Asp
20 25 30
Arg Asn Ser Asn Met Ser Tyr Leu Gly Cys Gly Thr Ala Ile Trp Val
35 40 45
Gly Arg Gln Ile Glu Lys Pro Asp Glu Leu Phe Tyr Ala Lys Ala Glu
50 55 60
Asp Phe Glu Lys Lys Gly Val Lys Ile Leu Thr Glu Thr Glu Val Ser
65 70 75 80
Glu Ile Asp Phe Thr Asn Lys Met Ile Tyr Ala Lys Ser Lys Thr Gly
85 90 95
Glu Lys Ile Thr Glu Ser Tyr Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Ser
100 105 110
Arg Pro Ile Ile Pro Asn Leu Pro Gly Lys Asp Leu Lys Gly Ile His
115 120 125
Phe Leu Lys Leu Phe Gln Glu Gly Gln Ala Ile Asp Glu Glu Phe Ala
130 135 140
Lys Asn Asp Val Lys Arg Ile Ala Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Thr Glu Ile Ala Glu Ala Ala Lys Arg Arg Gly Lys Glu Val Leu Leu
165 170 175
Phe Asp Ala Glu Ser Thr Ser Leu Ala Ser Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe
180 185 190
Ala Lys Gly Met Asp Glu Asn Leu Ala Gln His Gly Ile Glu Leu His
195 200 205
Phe Gly Glu Leu Ala Gln Glu Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly His Val
210 215 220
Ser Gln Ile Val Thr Asn Lys Ser Thr Tyr Asp Val Asp Leu Val Ile
225 230 235 240
Asn Cys Ile Gly Phe Thr Ala Asn Ser Ala Leu Ala Gly Glu His Leu
245 250 255
Glu Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Asn Lys His Gln Gln Ser
260 265 270
Ser Asp Pro Asp Val Tyr Ala Val Gly Asp Val Ala Thr Ile Tyr Ser
275 280 285
Asn Ala Leu Gln Asp Phe Thr Tyr Ile Ala Leu Ala Ser Asn Ala Val
290 295 300
Arg Ser Gly Ile Val Ala Gly His Asn Ile Gly Gly Lys Ser Ile Glu
305 310 315 320
Ser Val Gly Val Gln Gly Ser Asn Gly Ile Ser Ile Phe Gly Tyr Asn
325 330 335
Met Thr Ser Thr Gly Leu Ser Val Lys Ala Ala Lys Lys Ile Gly Leu
340 345 350
Glu Val Ser Phe Ser Asp Phe Glu Asp Lys Gln Lys Ala Trp Phe Leu
355 360 365
His Glu Asn Asn Asp Ser Val Lys Ile Arg Ile Val Tyr Glu Thr Lys
370 375 380
Ser Arg Arg Ile Ile Gly Ala Gln Leu Ala Ser Lys Ser Glu Ile Ile
385 390 395 400
Ala Gly Asn Ile Asn Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu Lys Lys Thr
405 410 415
Ile Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn
420 425 430
Ser Pro Tyr Asn Tyr Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Ala Lys
435 440 445
<210> 35
<211> 459
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 35
Met Ser Lys Ile Val Val Val Gly Ala Asn His Ala Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ile Asn Thr Met Leu Asp Asn Phe Gly Asn Glu Asn Glu Ile Val Val
20 25 30
Phe Asp Gln Asn Ser Asn Ile Ser Phe Leu Gly Cys Gly Met Ala Leu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Gln Ile Asp Gly Ala Glu Gly Leu Phe Tyr Ser Asp
50 55 60
Lys Glu Lys Leu Glu Ala Lys Gly Ala Lys Val Tyr Met Asn Ser Pro
65 70 75 80
Val Leu Ser Ile Asp Tyr Asp Asn Lys Val Val Thr Ala Glu Val Glu
85 90 95
Gly Lys Glu His Lys Glu Ser Tyr Glu Lys Leu Ile Phe Ala Thr Gly
100 105 110
Ser Thr Pro Ile Leu Pro Pro Ile Glu Gly Val Glu Ile Val Lys Gly
115 120 125
Asn Arg Glu Phe Lys Ala Thr Leu Glu Asn Val Gln Phe Val Lys Leu
130 135 140
Tyr Gln Asn Ala Glu Glu Val Ile Asn Lys Leu Ser Asp Lys Ser Gln
145 150 155 160
His Leu Asp Arg Ile Ala Val Val Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Val Glu
165 170 175
Leu Ala Glu Ala Phe Glu Arg Leu Gly Lys Glu Val Val Leu Val Asp
180 185 190
Ile Val Asp Thr Val Leu Asn Gly Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Thr Gln
195 200 205
Met Met Ala Lys Asn Leu Glu Asp His Asn Ile Arg Leu Ala Leu Gly
210 215 220
Gln Thr Val Lys Ala Ile Glu Gly Asp Gly Lys Val Glu Arg Leu Ile
225 230 235 240
Thr Asp Lys Glu Ser Phe Asp Val Asp Met Val Ile Leu Ala Val Gly
245 250 255
Phe Arg Pro Asn Thr Ala Leu Ala Asp Gly Lys Ile Glu Leu Phe Arg
260 265 270
Asn Gly Ala Phe Leu Val Asp Lys Lys Gln Glu Thr Ser Ile Pro Asp
275 280 285
Val Tyr Ala Val Gly Asp Cys Ala Thr Val Tyr Asp Asn Ala Arg Lys
290 295 300
Asp Thr Ser Tyr Ile Ala Leu Ala Ser Asn Ala Val Arg Thr Gly Ile
305 310 315 320
Val Gly Ala Tyr Asn Ala Cys Gly His Glu Leu Glu Gly Ile Gly Val
325 330 335
Gln Gly Ser Asn Gly Ile Ser Ile Tyr Gly Leu His Met Val Ser Thr
340 345 350
Gly Leu Thr Leu Glu Lys Ala Lys Ala Ala Gly Tyr Asn Ala Thr Glu
355 360 365
Thr Gly Phe Asn Asp Leu Gln Lys Pro Glu Phe Met Lys His Asp Asn
370 375 380
His Glu Val Ala Ile Lys Ile Val Phe Asp Lys Asp Ser Arg Glu Ile
385 390 395 400
Leu Gly Ala Gln Met Val Ser His Asp Ile Ala Ile Ser Met Gly Ile
405 410 415
His Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu His Val Thr Ile Asp Lys Leu
420 425 430
Ala Leu Thr Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn Lys Pro Tyr Asn
435 440 445
Tyr Ile Thr Met Ala Ala Leu Thr Ala Glu Lys
450 455
<210> 36
<211> 446
<212> PRT
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 36
Met Ser Val Val Val Val Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Lys Ser Ile Leu Ala Asn His Pro Glu Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu
20 25 30
Arg Asn Asp Asn Ile Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Tyr Val
35 40 45
Gly Gly Val Val Lys Asn Ala Ala Asp Leu Phe Tyr Ser Asn Pro Glu
50 55 60
Glu Leu Ala Ser Leu Gly Ala Thr Val Lys Met Glu His Asn Val Glu
65 70 75 80
Glu Ile Asn Val Asp Asp Lys Thr Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Thr
85 90 95
Gly Ala Thr Glu Thr Val Ser Tyr Asp Lys Leu Val Met Thr Thr Gly
100 105 110
Ser Trp Pro Ile Ile Pro Pro Ile Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asn Ile
115 120 125
Leu Leu Cys Lys Asn Tyr Ser Gln Ala Asn Val Ile Ile Glu Lys Ala
130 135 140
Lys Asp Ala Lys Arg Val Val Val Val Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Ile
145 150 155 160
Glu Leu Val Glu Ala Phe Val Glu Ser Gly Lys Gln Val Thr Leu Val
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Arg Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Asp Lys Pro Phe Thr
180 185 190
Asp Val Leu Glu Lys Glu Leu Val Asp Arg Gly Val Asn Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Glu Asn Val Gln Gln Phe Val Ala Asp Glu Gln Gly Lys Val Ala
210 215 220
Lys Val Ile Thr Pro Ser Gln Glu Phe Glu Ala Asp Met Val Ile Met
225 230 235 240
Cys Val Gly Phe Arg Pro Asn Thr Glu Leu Leu Lys Asp Lys Val Asp
245 250 255
Met Leu Pro Asn Gly Ala Ile Glu Val Asn Glu Tyr Met Gln Thr Ser
260 265 270
Asn Pro Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Ser Ala Val Val His Tyr Asn
275 280 285
Pro Ser Gln Thr Lys Asn Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg
290 295 300
Gln Gly Met Leu Val Gly Arg Asn Leu Thr Glu Gln Lys Leu Ala Tyr
305 310 315 320
Arg Gly Thr Gln Gly Thr Ser Gly Leu Tyr Leu Phe Gly Trp Lys Ile
325 330 335
Gly Ser Thr Gly Val Thr Lys Glu Ser Ala Lys Leu Asn Gly Leu Asp
340 345 350
Val Glu Ala Thr Val Phe Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro
355 360 365
Thr Thr Glu Lys Val Leu Met Glu Leu Val Tyr Glu Lys Gly Thr Gln
370 375 380
Arg Ile Val Gly Gly Gln Leu Met Ser Lys Tyr Asp Ile Thr Gln Ser
385 390 395 400
Ala Asn Thr Leu Ser Leu Ala Val Gln Asn Lys Met Thr Val Glu Asp
405 410 415
Leu Ala Ile Ser Asp Phe Phe Phe Gln Pro His Phe Asp Arg Pro Trp
420 425 430
Asn Tyr Leu Asn Leu Leu Ala Gln Ala Ala Leu Glu Asn Met
435 440 445
<210> 37
<211> 451
<212> PRT
<213> 短乳杆菌（Lactobacillus brevis）
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<220>
<223> NADH氧化酶 (NOXE)
<400> 37
Met Ser Lys Val Thr Val Val Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Phe Ala
1 5 10 15
Ile Lys Gln Ile Leu Ala Glu His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr
20 25 30
Glu Arg Asn Asp Val Ile Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Tyr
35 40 45
Leu Gly Gly Lys Val Ala Asp Pro Gln Gly Leu Phe Tyr Ser Ser Pro
50 55 60
Glu Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Asn Val Gln Met Asn His Asn Val
65 70 75 80
Leu Ala Ile Asp Pro Asp Gln Lys Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Thr
85 90 95
Ser His Ala Gln Thr Thr Glu Ser Tyr Asp Lys Leu Val Met Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Trp Pro Ile Val Pro Lys Ile Pro Gly Ile Asp Ser Asp Arg
115 120 125
Val Lys Leu Cys Lys Asn Trp Ala His Ala Gln Ala Leu Ile Glu Asp
130 135 140
Ala Lys Glu Ala Lys Arg Ile Thr Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly
145 150 155 160
Ala Glu Leu Ala Glu Ala Tyr Ser Thr Thr Gly His Asp Val Thr Leu
165 170 175
Ile Asp Ala Met Asp Arg Val Met Pro Lys Tyr Phe Asp Ala Asp Phe
180 185 190
Thr Asp Val Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Asp His Gly Val Gln Leu Ala
195 200 205
Leu Ser Glu Thr Val Glu Ser Phe Thr Asp Ser Ala Thr Gly Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Thr Asp Lys Asn Ser Tyr Glu Thr Asp Leu Ala Ile Leu Cys
225 230 235 240
Ile Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Gly Lys Val Asp Met
245 250 255
Ala Pro Asn Gly Ala Ile Ile Thr Asp Asp Tyr Met Arg Ser Ser Asn
260 265 270
Pro Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Ser Ala Ala Val His Tyr Asn Pro
275 280 285
Thr His Gln Asn Ala Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln
290 295 300
Gly Ile Leu Val Gly Lys Asn Leu Val Lys Pro Thr Val Lys Tyr Met
305 310 315 320
Gly Thr Gln Ser Ser Ser Gly Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Thr Ile Val
325 330 335
Ser Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ala Lys Gln Gln Gly Val Asn Ala
340 345 350
Glu Gln Val Ile Val Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro Ser
355 360 365
Thr Glu Pro Val Leu Met Ser Leu Val Phe Asp Pro Asp Thr His Arg
370 375 380
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Met Ser Lys Tyr Asp Val Ser Gln Ser Ala
385 390 395 400
Asn Thr Leu Ser Val Cys Ile Gln Asn Glu Asn Thr Ile Asp Asp Leu
405 410 415
Ala Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Arg Pro Phe Asn
420 425 430
Tyr Leu Asn Ile Leu Ala Gln Ala Ala Gln Ala Lys Val Ala Gln Ser
435 440 445
Val Asn Ala
450
<210> 38
<211> 554
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pTDH3" <223> "pTDH3
<220>
<223> pTDH3
<220>
<223> pTDH3
<400> 38
ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 60
tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 120
aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 180
tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 240
ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 300
ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 360
aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 420
agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 480
tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca 540
cataaacaaa caaa 554
<210> 39
<211> 550
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pENO2" <223> "pENO2
<220>
<223> pENO2
<220>
<223> pENO2
<400> 39
cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac 60
caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa aactggcatc cactaattga tacatctaca 120
caccgcacgc cttttttctg aagcccactt tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg 180
aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca 240
tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact 300
atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat 360
ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca 420
aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt 480
tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca 540
tacaataata 550
<210> 40
<211> 419
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pTEF Kl" <223> "pTEF Kl
<220>
<223> pTEF Kl
<220>
<223> pTEF Kl
<400> 40
ctctctcgca ataacaatga acactgggtc aatcatagcc tacacaggtg aacagagtag 60
cgtttataca gggtttatac ggtgattcct acggcaaaaa tttttcattt ctaaaaaaaa 120
aaagaaaaat ttttctttcc aacgctagaa ggaaaagaaa aatctaatta aattgatttg 180
gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa 240
aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta 300
ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg 360
tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa 419
<210> 41
<211> 598
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pTEF3" <223> "pTEF3
<220>
<223> pTEF3
<220>
<223> pTEF3
<400> 41
ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60
atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120
ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180
cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240
cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300
ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360
ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420
gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480
taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540
ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa 598
<210> 42
<211> 383
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pTEF1" <223> "pTEF1
<220>
<223> pTEF1
<220>
<223> pTEF1
<400> 42
gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60
ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 120
tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 180
cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 240
gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 300
ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctacgata cagttctcac 360
atcacatccg aacataaaca acc 383
<210> 43
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pADH1" <223> "pADH1
<220>
<223> pADH1
<220>
<223> pADH1
<400> 43
gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat 60
aataccttcg ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag 120
ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg 180
gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt 240
ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt 300
ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa 360
aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt 420
tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca 480
cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga 540
aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt 600
ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt 660
tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 700
<210> 44
<211> 549
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGPM 1" <223> "pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
<400> 44
gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata 60
tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg 120
tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc 180
ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg 240
gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag 300
ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg 360
agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa 420
agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat 480
taccttcctt tgtaattttt tttgtaatta ttcttcttaa taatccaaac aaacacacat 540
attacaata 549
<210> 45
<211> 650
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pFBA1" <223> "pFBA1
<220>
<223> pFBA1
<220>
<223> pFBA1
<400> 45
acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct 60
tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa 120
tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg 180
ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct 240
ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac 300
tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg 360
ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat 420
caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt 480
aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa 540
agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc 600
ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 650
<210> 46
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pPDC1" <223> "pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<400> 46
ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 60
cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 120
cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 180
taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 240
ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 300
tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 360
ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 420
tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 480
ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 540
aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 600
gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 660
tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 700
<210> 47
<211> 998
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCCW12" <223> "pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<400> 47
aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60
aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120
tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180
aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240
gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300
ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360
agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420
agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480
gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540
cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600
aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660
agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720
cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780
cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840
ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900
ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960
attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998
<210> 48
<211> 700
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGK1" <223> "pGK1
<220>
<223> pGK1
<220>
<223> pGK1
<400> 48
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700
<210> 49
<211> 913
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMDH2" <223> "pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<400> 49
ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca 60
cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct 120
ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat 180
catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg 240
cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta 300
tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc 360
atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa 420
tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc 480
cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat 540
tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg 600
gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt 660
ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc 720
gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat 780
tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt 840
cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa 900
aagttatagt aac 913
<210> 50
<211> 406
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pURA3" <223> "pURA3
<220>
<223> pURA3
<220>
<223> pURA3
<400> 50
ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat 60
gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt 120
atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc 180
ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg 240
aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact 300
tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt 360
aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc 406
<210> 51
<211> 535
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pRPLA1" <223> "pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<400> 51
tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc 60
tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt 120
agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt 180
ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta 240
tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta 300
catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt 360
ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt 420
gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt 480
ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa 535
<210> 52
<211> 400
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pSAM4" <223> "pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<400> 52
agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga 60
attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc 120
ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga 180
gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag 240
tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt 300
gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg 360
aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa 400
<210> 53
<211> 505
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pCUP1-1" <223> "pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<400> 53
cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg 60
acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt 120
attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca 180
ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg 240
tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc 300
gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa 360
tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct 420
tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca 480
atcaatcaat caatcatcac ataaa 505
<210> 54
<211> 500
<212> DNA
<213> 光滑念珠菌（Candida glabrata）
<220>
<223> pCUP1.Cgla" <223> "pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<400> 54
cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg 60
gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc 120
aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt 180
ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag 240
aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata 300
gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag 360
ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga 420
aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta 480
gtattttgct ttagttgtta 500
<210> 55
<211> 425
<212> DNA
<213> 贝酵母（Saccharomyces bayanus）
<220>
<223> pCUP1.Sba" <223> "pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<400> 55
agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60
tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120
acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180
tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240
tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300
aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360
tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420
ataaa 425
<210> 56
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU1" <223> "pACU1
<220>
<223> pACU1
<220>
<223> pACU1
<400> 56
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 540
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 600
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 660
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 720
tctattaccc ccatccatac a 741
<210> 57
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU2" <223> "pACU2
<220>
<223> pACU2
<220>
<223> pACU2
<400> 57
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg 360
tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg 420
ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg 480
gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac 540
tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg 600
atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc 660
ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca 720
gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 757
<210> 58
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU3p" <223> "pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<400> 58
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180
attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240
gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480
caaggagaaa aaactata 498
<210> 59
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU4p" <223> "pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<400> 59
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480
caaggagaaa aaactata 498
<210> 60
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU5" <223> "pACU5
<220>
<223> pACU5
<220>
<223> pACU5
<400> 60
ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa 60
ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa 120
tcaatttcct acctgaatct aaaattcccg gaattcgaaa aagacatttt tgctgtcagt 180
cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt 240
ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgaat tccgagcaga tccgccaggc 300
gtgtatatat agcgtggatg gccaggcaac tttagtgctg acacatacag gcatatatat 360
atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct 420
tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat 480
tactatactt ctatagacac acaaacacaa atacacacac taaattaata 530
<210> 61
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU6" <223> "pACU6
<220>
<223> pACU6
<220>
<223> pACU6
<400> 61
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600
ctaccaacga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840
tacaattcta ttacccccat ccataca 867
<210> 62
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU7" <223> "pACU7
<220>
<223> pACU7
<220>
<223> pACU7
<400> 62
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600
tctttttcga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840
tacaattcta ttacccccat ccataca 867
<210> 63
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU8" <223> "pACU8
<220>
<223> pACU8
<220>
<223> pACU8
<400> 63
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600
ctaccaacga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc 660
tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa 720
aaaagactac caacgaattc gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc 780
ttttgctggc atttcttcca gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc 840
cagcaaaaaa gactaccaac gaattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119
<210> 64
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU9" <223> "pACU9
<220>
<223> pACU9
<220>
<223> pACU9
<400> 64
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa 240
gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc tggcatttct tccagaagca 300
aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa aaaagactac caacgaattc 360
gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc ttttgctggc atttcttcca 420
gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc cagcaaaaaa gactaccaac 480
gaattcgggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat 540
ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta 600
agaatttttg aaaattcaat ataa 624
<210> 65
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU10p" <223> "pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<400> 65
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca 300
gcggaaaaga cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg 360
acagtgactg acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac 420
ggttcagcgg aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat 480
ctcttgacag tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc 540
tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa 600
aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tccaattcgg atgataatgc 660
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 720
attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 780
tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 840
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 876
<210> 66
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU11" <223> "pACU11
<220>
<223> pACU11
<220>
<223> pACU11
<400> 66
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180
aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact 240
ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt 300
agtttctttg gttgtattga tcatttggtt catcgtggtt cattaatttt ttttctccat 360
tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat 420
gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga 480
ttgttaaaaa cgtatttata gcaaacgcaa ttgtaattaa ttcttatttt gtatcttttc 540
ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac 600
accaagcaac taatactata acatacaata ata 633
<210> 67
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU12" <223> "pACU12
<220>
<223> pACU12
<220>
<223> pACU12
<400> 67
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600
tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840
acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119
<210> 68
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU13" <223> "pACU13
<220>
<223> pACU13
<220>
<223> pACU13
<400> 68
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420
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tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540
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tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840
acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg 900
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<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180
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cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt 300
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accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac 480
tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc 540
cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga 600
agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag 660
catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca 720
ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg 780
aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta 840
tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt 900
cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt 960
cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a 1011
<210> 70
<211> 398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pACU15" <223> "pACU15
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<220>
<223> pACU15
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tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60
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tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt 240
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aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc 360
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<223> pGAL/CUP1p
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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
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aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat 360
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cacataaa 428
<210> 72
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pCRS5
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gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc 420
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<210> 73
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pCHA1
<220>
<223> pCHA1
<400> 73
gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt 60
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ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat 240
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ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt 360
atcaaattgt ttgcgatgag ataagataaa agggacaata tgaggaggaa cacaggtata 420
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<210> 74
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<220>
<223> pCTR1
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caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat 60
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acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt 180
attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc 240
tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat 300
ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat 360
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tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat 480
aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat 540
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a 601
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pCTR3
<220>
<223> pCTR3
<400> 75
gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt 60
cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa 120
ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg 180
agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc 240
aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag 300
attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa 360
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cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga 480
gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag 522
<210> 76
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
<223> pCUR1
<400> 76
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420
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ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt 660
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<210> 77
<211> 674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR2" <223> "pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<400> 77
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt 360
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tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 660
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<220>
<223> pCUR3
<400> 78
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
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gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 540
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tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 780
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<212> DNA
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<220>
<223> pCUR4
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ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 480
gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatggcacg atcctcaatt 540
gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatcccatg acaattctaa 600
ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga 660
aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt 720
taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat 780
ctactatttc cttcgtgtaa tacagggtcg tcagatacat agatacaatt ctattacccc 840
catccataca 850
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<211> 491
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR5p" <223> "pCUR5p
<220>
<223> pCUR5p
<220>
<223> pCUR5p
<400> 80
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 180
caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 240
caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg 300
gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag 360
ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa 420
atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag 480
aaaaaactat a 491
<210> 81
<211> 833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR6" <223> "pCUR6
<220>
<223> pCUR6
<220>
<223> pCUR6
<400> 81
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 360
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 420
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 480
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt catgatcgca aaatggcaaa tggcacgtga 540
agctgtcgat attggggaac tgtggtggtt ggcaaatgac taattaagtt agtcaaggcg 600
ccatcctcat gaaaactgtg taacataata accgaagtgt cgaaaaggtg gcaccttgtc 660
caattgaaca cgctcgatga aaaaaataag atatatataa ggttaagtaa agcgtctgtt 720
agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg 780
taatacaggg tcgtcagata catagataca attctattac ccccatccat aca 833
<210> 82
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR7" <223> "pCUR7
<220>
<223> pCUR7
<220>
<223> pCUR7
<400> 82
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 360
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 420
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 480
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 540
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 600
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 660
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 720
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 780
ctttttacaa caaatataaa aca 803
<210> 83
<211> 863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR8" <223> "pCUR8
<220>
<223> pCUR8
<220>
<223> pCUR8
<400> 83
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 420
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840
ctttttacaa caaatataaa aca 863
<210> 84
<211> 863
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR9" <223> "pCUR9
<220>
<223> pCUR9
<220>
<223> pCUR9
<400> 84
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 420
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840
ctttttacaa caaatataaa aca 863
<210> 85
<211> 923
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR10" <223> "pCUR10
<220>
<223> pCUR10
<220>
<223> pCUR10
<400> 85
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 480
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 540
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 600
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 660
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 720
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 780
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 840
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 900
ctttttacaa caaatataaa aca 923
<210> 86
<211> 983
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR11" <223> "pCUR11
<220>
<223> pCUR11
<220>
<223> pCUR11
<400> 86
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 540
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960
ctttttacaa caaatataaa aca 983
<210> 87
<211> 1043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR12" <223> "pCUR12
<220>
<223> pCUR12
<220>
<223> pCUR12
<400> 87
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 420
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 600
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020
ctttttacaa caaatataaa aca 1043
<210> 88
<211> 1043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR13" <223> "pCUR13
<220>
<223> pCUR13
<220>
<223> pCUR13
<400> 88
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 600
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020
ctttttacaa caaatataaa aca 1043
<210> 89
<211> 1223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR14" <223> "pCUR14
<220>
<223> pCUR14
<220>
<223> pCUR14
<400> 89
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 600
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 660
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 720
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 780
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 840
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 900
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 960
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1020
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1080
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1140
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1200
ctttttacaa caaatataaa aca 1223
<210> 90
<211> 1283
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR15" <223> "pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<400> 90
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 420
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 600
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 660
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 720
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 780
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 840
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 900
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 960
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 1020
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1080
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1140
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1200
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1260
ctttttacaa caaatataaa aca 1283
<210> 91
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR16" <223> "pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<400> 91
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180
cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc 240
acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat 300
atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct 360
ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc 420
tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa 480
gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa 540
aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt 600
gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc 660
aactaatact ataacataca ataata 686
<210> 92
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCUR17" <223> "pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<400> 92
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 240
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 300
cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca 360
tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc 420
tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt 480
ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca 540
agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta 600
aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct 660
tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag 720
caactaatac tataacatac aataata 747
<210> 93
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pLYS1" <223> "pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<400> 93
gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat 60
gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta 120
tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa 180
tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat 240
actaagtcga tgagtcaaaa aagactctta tacatttata cattttgcat tattattttt 300
tttttccagc ggaatttgga attccgctct caaccgccaa aattcccctg cgatttcagc 360
gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct 420
tccctgacgg aaactggtat tttaggaggc ataccataag ataacaacga aaacgcttta 480
tttttcacac aaccgcaaaa 500
<210> 94
<211> 650
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pLYS4" <223> "pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<400> 94
ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc 60
actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga 120
tacaacagca ccaaacaccg aaaagaatag ccaaagctgt cctctggtgt tggaaaaact 180
ggaaaaaacg caactgcgtt ggctgctacg gtgaaaaatt ttcctatgac ttttttcact 240
gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca 300
atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt 360
cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc 420
agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac 480
acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc 540
tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac 600
tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag 650
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<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
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<220>
<223> pLYS9
<220>
<223> pLYS9
<400> 95
acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg 60
atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca 120
actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac 180
cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt 240
agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag 300
tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag 360
atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa 420
attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt 480
aacgtattat atattttaat 500
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> pLYR1p
<220>
<223> pLYR1p
<400> 96
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240
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aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420
caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480
gagaaaaaac tata 494
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<211> 494
<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> pLYR2p
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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
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ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360
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caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480
gagaaaaaac tata 494
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<212> DNA
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<223> pLYR3p
<220>
<223> pLYR3p
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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300
ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360
tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600
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<211> 616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
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tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<223> pLYR7p
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<220>
<223> pLYR9
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
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<223> pMET17
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acaattctat tacccccatc cataca 686
<210> 108
<211> 510
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMET6" <223> "pMET6
<220>
<223> pMET6
<220>
<223> pMET6
<400> 108
ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt 60
gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt 120
agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc atggcagctc 180
tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg ctcaattgag 240
aactgtgaat gtgaatatgg aacaaatgcg atagatgcac taatttaagg gaagctagct 300
agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat aagtgataga 360
tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc 420
ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa gaaacaaaat 480
accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 510
<210> 109
<211> 508
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMET14" <223> "pMET14
<220>
<223> pMET14
<220>
<223> pMET14
<400> 109
cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat 60
gtagcagata actctgcact tctagaatca ttccactacg acatttggct catcaccagc 120
tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc 180
tttcatttcg gcgtgatggt acggcaccca cggttcctta cattattctc gaaaaatagc 240
tgcacgcttt tccaggaata aaagaccgtg ccactaattt cacgtgatca atatatttac 300
aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac 360
ttcatgaatt tgtcaaaata tctatataag atgcaaaatt tctatacaac atcagttgcg 420
tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga 480
attatttctc caagcacact gtacacca 508
<210> 110
<211> 552
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMET3" <223> "pMET3
<220>
<223> pMET3
<220>
<223> pMET3
<400> 110
aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt 60
agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg 120
acacacttgt agcgccaacg cgcatcctac ggattgctga cagaaaaaaa ggtcacgtga 180
ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca 240
ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300
cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360
cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420
aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480
gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540
agtataatta ac 552
<210> 111
<211> 363
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pSAM1" <223> "pSAM1
<220>
<223> pSAM1
<220>
<223> pSAM1
<400> 111
gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60
tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt 120
tcttttttcg ggttcttgtc tcgacgaaat tttagcctca tcgtagtttt tcactctggt 180
atcgatgaaa aagggaagag taaaaagttt tccgtttagt acttaatggg attggtttgg 240
gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa 300
aaaaaataga gtaaaaacca ggaatttacc ctaaaaacaa gaaaaaataa gataaacgaa 360
aat 363
<210> 112
<211> 500
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pSAM2" <223> "pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<400> 112
gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa 60
ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat 120
cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac 180
gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata 240
ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat 300
cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat 360
aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc 420
ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac 480
gacaatatac aaacataatc 500
<210> 113
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tTDH2" <223> "tTHD2
<220>
<223> tTDH2
<220>
<223> tTHD2
<400> 113
atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60
acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120
gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180
aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240
cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300
<210> 114
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tCYC1" <223> "tCYC1
<220>
<223> tCYC1
<220>
<223> tCYC1
<400> 114
acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60
cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120
cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180
ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240
agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc 300
<210> 115
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tTDH3" <223> "tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<400> 115
gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60
tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120
tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180
atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240
aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300
<210> 116
<211> 354
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tADH1" <223> "tADH1
<220>
<223> tADH1
<220>
<223> tADH1
<400> 116
actagttcta gagcggccgc caccgcggtg ggcgaatttc ttatgattta tgatttttat 60
tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt 120
aaaacgaaaa ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt 180
atagcatgag gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca 240
aatcgctccc catttcaccc aattgtagat atgctaactc cagcaatgag ttgatgaatc 300
tcggtgtgta ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tcca 354
<210> 117
<211> 301
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tADH2" <223> "tADH2
<220>
<223> tADH2
<220>
<223> tADH2
<400> 117
gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60
tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120
ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180
attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240
acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300
t 301
<210> 118
<211> 299
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tTPI1" <223> "tTPI1
<220>
<223> tTPI1
<220>
<223> tTPI1
<400> 118
gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60
taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa 120
atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180
cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240
gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299
<210> 119
<211> 299
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tMET17" <223> "tMET17
<220>
<223> tMET17
<220>
<223> tMET17
<400> 119
gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60
tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120
tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180
gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240
ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299
<210> 120
<211> 305
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tENO2" <223> "tENO2
<220>
<223> tENO2
<220>
<223> tENO2
<400> 120
ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60
gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata 120
cagttttata agttactttt tcaaagactc gtgctgtcta ttgcataatg cactggaagg 180
ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac 240
atggatgata agaaaacatg gagtacagtc actttgagaa ccttcaatca gctggtaacg 300
tcttc 305
<210> 121
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tMET3" <223> "tMET3
<220>
<223> tMET3
<220>
<223> tMET3
<400> 121
tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat 60
aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag 120
aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa 180
acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt 240
attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc 300
<210> 122
<211> 301
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tPGK1" <223> "tPGK1
<220>
<223> tPGK1
<220>
<223> tPGK1
<400> 122
attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60
gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120
ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180
taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240
tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300
a 301
<210> 123
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tDIT1" <223> "tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<400> 123
taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60
cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120
atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180
tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240
caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300
<210> 124
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL3" <223> "tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<400> 124
gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60
aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120
gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180
tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240
ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300
<210> 125
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL41B" <223> "tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<400> 125
gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt 60
tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa 120
tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta 180
ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt 240
tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct 300
<210> 126
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tRPL15A" <223> "tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<400> 126
gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60
actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120
tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc 180
cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg 240
gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca 300
<210> 127
<211> 300
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> tIDP1" <223> "tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<400> 127
tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta 60
gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat 120
atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg 180
gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta 240
gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt 300
<210> 128
<211> 1089
<212> DNA
<213> 克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）
<220>
<223> Leu2" <223> "Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 128
atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60
gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120
catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180
ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240
ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300
tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360
aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420
tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480
agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540
ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600
agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660
ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720
attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780
ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840
ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900
gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960
agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020
ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080
ttggcttaa 1089
<210> 129
<211> 362
<212> PRT
<213> 克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）
<220>
<223> Leu2 " <223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 129
Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu
1 5 10 15
Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg
20 25 30
Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala
35 40 45
Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser
50 55 60
Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp
65 70 75 80
Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys
85 90 95
Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp
100 105 110
Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr
115 120 125
Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu
130 135 140
Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr
145 150 155 160
Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala
165 170 175
Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn
180 185 190
Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile
195 200 205
Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser
210 215 220
Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val
245 250 255
Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu
260 265 270
Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser
275 280 285
Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu
290 295 300
Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly
305 310 315 320
Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg
325 330 335
Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala
340 345 350
Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala
355 360
<210> 130
<211> 499
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pNUP57
<220>
<223> pNUP57
<400> 130
tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60
gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120
cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180
agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240
atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300
tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360
aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420
atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480
ttgttgacca attgatcac 499
<210> 131
<211> 451
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pGAP1
<220>
<223> pGAP1
<400> 131
cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60
ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120
ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180
ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240
tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300
tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360
aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420
agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451
<210> 132
<211> 998
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pJEN1
<220>
<223> pJEN1
<400> 132
aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60
gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120
gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180
tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240
aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300
tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360
gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420
aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480
tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540
ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600
atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660
agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720
tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780
ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840
caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900
tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960
gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998
<210> 133
<211> 450
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pICL1
<220>
<223> pICL1
<400> 133
ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60
ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120
aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180
atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240
gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300
ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360
tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420
tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450
<210> 134
<211> 598
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pADH2
<220>
<223> pADH2
<400> 134
tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60
gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120
atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180
taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240
acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300
accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420
atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480
ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540
atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598
<210> 135
<211> 793
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> pMLS1
<220>
<223> pMLS1
<400> 135
tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60
gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120
tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180
agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240
cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300
gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360
gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420
ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480
atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540
tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600
tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660
aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720
tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780
aagaattaag aaa 793

Claims (25)

1.一种生产甲硫氨酸和/或生产甲硫氨酸衍生物的重组酵母，在其基因组中：
(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
(B)至少一种编码天冬氨酸激酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且
(C)(i)a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码甲硫氨酸合酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；
和/或
(ii)a)至少一种编码高丝氨酸激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码具有改善的O-磷酸-L-高丝氨酸(OHPS)依赖性甲硫氨酸合酶活性的胱硫醚γ-合酶1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
2.根据权利要求1所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码天冬氨酸转氨酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母，在其基因组中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的内源性核酸已被删除，或者
(ii)至少一种、优选所有编码S-腺苷甲硫氨酸合酶SAM1和/或SAM2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母，在其基因组中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶I ARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的内源性核酸已被删除，或者
(ii)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶IARO8和/或胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母，在其基因组中，独立地：
(i)至少一种、优选所有编码芳香族氨基转移酶IARO8的核酸，和/或
(ii)至少一种、优选所有编码胞浆支链氨基酸(BCAA)氨基转移酶基因BAT2的核酸，
过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
8.根据权利要求7所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码2-羟酸脱氢酶(KDH)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码胱硫醚γ-裂解酶CYS3的核酸独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码胱硫醚β-合酶CYS4的核酸独立地处于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组酵母，在其基因组中：
a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶MET2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，
和/或
至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，并且
b)至少一种编码O-乙酰高丝氨酸-O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶MET17的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸独立地处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组酵母，在其基因组中进行了以下修饰中的至少一种：
(A)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP3的核酸已经被插入；
(B)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码支链氨基酸通透酶3BAP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码支链氨基酸通透酶3BAP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的支链氨基酸通透酶3BAP3的核酸已经被插入；
(C)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码支链氨基酸通透酶2BAP2的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码支链氨基酸通透酶2BAP2的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)已经插入了至少一种编码不稳定的支链氨基酸通透酶2BAP2的核酸已经被插入；
(D)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶GAP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入；
(E)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入；
(F)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入；
(G)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3的核酸已经被插入；
(H)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的内源性核酸，并且任选地：
(i)至少一种编码高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或
(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的核酸已经被插入；
(I)至少一种编码可能的转运蛋白AQR1的核酸过表达；和/或
(J)至少一种编码多胺转运蛋白1TPO1的核酸过表达。
14.根据权利要求13所述的重组酵母，在其基因组中已经进行了至少两种，特别是至少三种权利要求8中给出的修饰。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的重组酵母，其中编码天冬氨酸激酶HOM3的核酸是来自酵母，优选来自酿酒酵母的核酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组酵母，其中编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶METX的核酸是来自细菌的核酸，特别是来自独立地选自由以下组成的组的细菌的核酸：谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、淡紫灰链霉菌、问号钩端螺旋体、肺炎链球菌和结核分枝杆菌。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的重组酵母，其中编码突变的胱硫醚γ-合酶1CGS1的核酸是源自植物的核酸，并且优选是来自拟南芥的胱硫醚γ合酶1。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的重组酵母，其中，所插入的至少一种编码S-腺苷甲硫氨酸SAM1和/或SAM2、胱硫醚γ-裂解酶CYS3、胱硫醚β-合酶CYS4、高丝氨酸激酶THR1、通用氨基酸通透酶AGP3、支链氨基酸通透酶3BAP3、支链氨基酸通透酶2BAP2、通用氨基酸通透酶GAP1、高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1、通用氨基酸通透酶AGP1、低亲和力甲硫氨酸通透酶MUP3和高亲和力甲硫氨酸通透酶MUP1的核酸独立地是来自酵母、优选来自酿酒酵母的核酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组酵母，其中强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组酵母，其中诱导型或抑制型启动子独立地选自由以下组成的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的重组酵母，其中弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的重组酵母，其中诱导型或抑制型启动子独立地选自由以下组成的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子和可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。
23.生产甲硫氨酸和/或至少一种其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在培养基中培养如权利要求1至22中任一项所定义的重组酵母，所述培养基优选包含MeSH、MeSNa和/或MeSMe；和
(b)从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或至少一种其衍生物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述培养基包含至少一种碳源，优选地选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。
25.如权利要求1至22中任一项所定义的重组酵母用于生产甲硫氨酸和/或其衍生物的用途，特别是用于生产甲硫氨酸和/或2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)和/或2-酮基-4-甲硫基丁酸(KMB)，优选用于生产甲硫氨酸和/或2-羟基-4-(甲硫基)丁酸(HMB)的用途。
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CN113106029A (zh) * 2021-04-20 2021-07-13 南京工业大学 一种过表达aro8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

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