CN112639117A

CN112639117A - 谷胱甘肽的制造方法

Info

Publication number: CN112639117A
Application number: CN201980054912.8A
Authority: CN
Inventors: 岩本裕一; 岩崎晃; 加藤祐章
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2021-04-09
Also published as: JPWO2020050273A1; WO2020050273A1

Abstract

本发明的目的在于提供基于酵母制造谷胱甘肽的廉价且高效的制造方法。本发明提供以将酵母在碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上的培养基中进行培养为特征的谷胱甘肽的制造方法、以及促进基于酵母的谷胱甘肽的生产的方法。

Description

谷胱甘肽的制造方法

技术领域

本发明涉及基于酵母制造谷胱甘肽的方法、促进基于酵母的谷胱甘肽的生产的方法、基于酵母的谷胱甘肽的生产的促进剂、以及适合基于酵母的谷胱甘肽的生产的培养基组合物。

背景技术

以啤酒酵母、面包酵母为代表的属于酵母(Saccharomyces)属菌的酵母平衡性良好地含有天然的维生素B族、氨基酸及矿物质等，除了用于啤酒、面包的制造以外，也被有效地充分利用。例如，干燥酵母在日本长期被用作医药品、食品原料及调味料等，被认为是营养价值和安全性高的原材料。另外，近年来，也被广泛地用作酵母提取物的原料酵母。

酵母提取物由酵母的培养物制备，包含丰富的氨基酸等，一直以来被用作用于赋予鲜味、醇厚感的调味料等食品添加剂。特别是由于最近喜好天然的倾向增高，因此作为调味料的酵母提取物的需求具有增加的倾向。可以期待由包含丰富的呈味成分的酵母制备的酵母提取物可作为更优异的调味料来使用，因此积极地进行了包含更多呈味成分的酵母的开发。

作为酵母菌体内的代表性的含硫化合物，可以列举谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸。通常，谷胱甘肽广泛分布于酵母及动物的肝脏等，是与生物体内的氧化还原反应密切相关的三肽，作为发挥肝功能恢复作用、解毒作用、以及通过清除活性氧而防止细胞老化的作用等重要功能的物质，是极其有用的物质。对于谷胱甘肽，作为其形态，存在还原型谷胱甘肽(以下，简称为GSH)和氧化型谷胱甘肽(以下，简称为GSSG)，所述氧化型谷胱甘肽是2个还原型谷胱甘肽通过半胱氨酸残基以二硫键键合而成的。两者均可在生物体内生物合成，在氧化还原反应中发挥重要的作用。GSSG在生物体内通过谷胱甘肽还原酶暂时转变为GSH，一边循环一边发挥作用。因此，在给予了GSSG的情况下，预计具有与GSH相同的作用(例如，Journal of Nutritional Science and Vitaminology，第44卷，第613页，1998年等)。

通常，使用甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，利用以MET基因(甲硫氨酸合成基因)组为代表的多个基因的转印及翻译产物来合成含硫化合物。因此，为了得到更高产含硫化合物的酵母，广泛地进行了使酵母具有的这些与含硫化合物的合成相关基因发生突变来制造含有大量含硫化合物的酵母突变株的尝试。例如，作为制造含有大量谷胱甘肽的酵母的方法，进行了通过以下方式来提高培养菌体内的谷胱甘肽含量而改善生产性的尝试，所述方式为：对谷胱甘肽生产所使用的酵母进行突变处理(专利文献1～3)、通过基因重组导入与谷胱甘肽合成相关的酶(专利文献4～8)；以及在培养基中添加作为构成谷胱甘肽的3种氨基酸的L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸(专利文献9～12)。

另外，专利文献13公开了基于发酵法的谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：用含有甲硫氨酸和赖氨酸的培养基对属于念珠菌属或酒香酵母属的甲硫氨酸和L-赖氨酸营养缺陷型的微生物进行培养。在专利文献13中，作为含有甲硫氨酸和赖氨酸的培养基，记载了含有甲硫氨酸200～500μg/mL、以及L-赖氨酸300～750μg/mL的培养基。

另一方面，专利文献14中记载了一种酵母用培养基，其是对酵母赋予与YPD培养基相同程度或更高的增殖能力的培养基，所述培养基包含作为碳源的糖类、作为氮源的氨基酸类、维生素类、肌醇、锌离子、钾离子、以及镁离子，且肌醇浓度为50～100mg/L。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭59-151894号公报

专利文献2：特公平03-18872号公报

专利文献3：日本特开平10-191963号公报

专利文献4：日本特开昭61-52299号公报

专利文献5：日本特开昭62-275685号公报

专利文献6：日本特开昭63-129985号公报

专利文献7：日本特开昭64-51098号公报

专利文献8：日本特开平4-179484号公报

专利文献9：日本特开昭47-16990号公报

专利文献10：日本特开昭48-92579号公报

专利文献11：日本特开昭51-139686号公报

专利文献12：日本特开昭53-94089号公报

专利文献13：日本特开昭48-61689号公报

专利文献14：WO2014/030774

发明内容

发明要解决的课题

为了以更低成本高效率地在工业上批量生产谷胱甘肽本身、富含谷胱甘肽的酵母提取物等，重要的是利用谷胱甘肽含量高的酵母。如专利文献1中记载的方法那样，通过从进行突变处理等实施了遗传修饰的酵母中筛选谷胱甘肽含量更高的酵母的方法，虽然可以得到含有大量谷胱甘肽的酵母，但突变处理及筛选需要费时费力，而且很多情况下不一定能够得到含有大量谷胱甘肽的酵母。

本发明提供用于提高基于酵母的谷胱甘肽的生产性的廉价且高效的方法。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在培养酵母属酵母等酵母时，通过在培养基中添加给定量以上的赖氨酸等碱性氨基酸，可以提高该酵母的谷胱甘肽含量，高效率的生产谷胱甘肽，从而完成了本发明。

即，本发明包含以下的发明。

[1]一种谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：

在碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上的培养基中对酵母进行培养。

[2]根据[1]所述的方法，其中，所述酵母含有还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，并且，将还原型谷胱甘肽重量设为100时，氧化型谷胱甘肽重量为20以上。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比谷胱甘肽还原酶活性降低了的酵母。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述酵母缺损了编码谷胱甘肽还原酶的基因。

[5]根据[3]或[4]所述的方法，其中，所述谷胱甘肽还原酶选自下述(1a)～(1e)：

(1a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

(1b)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质、

(1c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质、

(1d)由与具有和序列号2互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质、以及、

(1e)由序列号2所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和/或谷胱甘肽合成酶活性增强了的酵母。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述酵母是通过包含编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的碱基序列的DNA、和/或包含编码谷胱甘肽合成酶的碱基序列的DNA进行转化而得到的酵母。

[8]根据[6]或[7]所述的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶选自下述(2a)～(2e)：

(2a)由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

(2b)由序列号3所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质、

(2c)由与序列号3所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质、

(2d)由与具有和序列号4互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质、以及

(2e)由序列号4所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。

[9]根据[6]或[7]所述的方法，其中，所述谷胱甘肽合成酶选自下述(3a)～(3e)：

(3a)由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

(3b)由序列号5所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质、

(3c)由与序列号5所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质、

(3d)由与具有和序列号6互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质、以及

(3e)由序列号6所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比谷胱甘肽转运酶活性增强了的酵母。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述酵母是通过包含编码谷胱甘肽转运酶的碱基序列的DNA进行转化而得到的酵母。

[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，所述谷胱甘肽转运酶选自下述(4a)～(4e)：

(4a)由序列号7所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

(4b)由序列号7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质、

(4c)由与序列号7所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质、

(4d)由与具有和序列号8互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质、以及、

(4e)由序列号8所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，所述酵母为酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、或毕赤酵母属(Pichia)的酵母。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的方法，其中，所述酵母为碱性氨基酸非营养缺陷型的酵母。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含糖蜜作为碳源。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的方法，其中，在培养开始时，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上。

[17]根据[1]～[16]中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为2g/L以上。

[18]根据[1]～[16]中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为4g/L以上。

[19]根据[1]～[18]中任一项所述的方法，其中，所述碱性氨基酸为赖氨酸。

[20]一种促进基于酵母的谷胱甘肽的生产的方法，该方法包括：

在碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上的培养基中对酵母进行培养。

[21]根据[20]所述的方法，其中，所述酵母具有[2]～[14]中任一项所限定的特征。

[22]根据[20]或[21]所述的方法，其中，所述培养基包含糖蜜作为碳源。

[23]根据[20]～[22]中任一项所述的方法，其中，在培养开始时，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上。

[24]根据[20]～[23]中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为2g/L以上。

[25]根据[20]～[23]中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为4g/L以上。

[26]根据[20]～[25]中任一项所述的方法，其中，所述碱性氨基酸为赖氨酸。

[27]一种基于酵母的谷胱甘肽的生产的促进剂，其包含碱性氨基酸。

[28]根据[27]所述的促进剂，其中，所述酵母具有[2]～[14]中任一项所限定的特征。

[29]根据[27]或[28]所述的促进剂，其中，所述碱性氨基酸为赖氨酸。

[30]一种酵母用培养基组合物，其中，碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上，且包含糖蜜作为碳源。

[31]根据[30]所述的酵母用培养基组合物，其用于具有[2]～[14]中任一项所限定的特征的酵母的培养。

[32]根据[30]或[31]所述的酵母用培养基组合物，其中，碱性氨基酸浓度为2g/L以上。

[33]根据[30]或[31]所述的酵母用培养基组合物，其中，碱性氨基酸浓度为4g/L以上。

[34]根据[30]～[33]中任一项所述的酵母用培养基组合物，其中，所述碱性氨基酸为赖氨酸。

本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请2018-167655号的公开内容。

发明的效果

根据本发明，可以通过在包含足够量的赖氨酸等碱性氨基酸的培养基中对酵母进行培养这样的简单的工序，促进基于酵母的谷胱甘肽的生产，高效地制造谷胱甘肽。另外，作为待使用的酵母，优选为以将还原型谷胱甘肽(GSH)重量设为100时氧化型谷胱甘肽(GSSG)重量优选为20以上、更优选为40以上、更优选为60以上、更优选为100以上、更优选为120以上的菌体内含量比含有GSH及GSSG的酵母。

具体实施方式

以下，对本发明的方法详细地进行说明。

本发明的方法的特征在于，在赖氨酸等碱性氨基酸的浓度为0.8g/L以上的培养基中对酵母进行培养。通过在该条件下对酵母进行培养，可以促进基于酵母的谷胱甘肽的生产，能够得到含有大量谷胱甘肽的酵母(谷胱甘肽含量高的酵母)。通过0.8g/L以上浓度的碱性氨基酸的存在而促进基于酵母的谷胱甘肽的生产、实现大量含有谷胱甘肽的效果(提高酵母的谷胱甘肽含量的效果)的原因尚不明确。

通过本发明的方法培养的酵母(本发明的酵母)没有特别限定，可以是野生株(天然的酵母)，也可以是通过突变处理得到的突变株，优选为通过突变处理得到的突变株。需要说明的是，在本发明及本申请说明书中，“野生株”是指自然界原本存在的酵母，即未对基因实施人工突变处理的酵母。与此相对，“突变株”是指对基因实施人工突变处理而得到的酵母。

需要说明的是，在本发明中，突变处理只要是能够使酵母等生物所具有的基因的一部分发生突变的处理即可，没有特别限定，可以使用制备酵母等微生物的突变株时通常使用的任意方法来进行。例如，通过使用紫外线、电离辐射、亚硝酸、亚硝基胍、乙基甲磺酸酯(Ethylmethane sulufonate，以下简称为EMS)等作为突变原对酵母进行处理，可以对酵母进行突变处理。

另外，本发明的酵母优选为以将还原型谷胱甘肽(GSH)重量设为100时氧化型谷胱甘肽(GSSG)重量优选为20以上、更优选为40以上、更优选为60以上、更优选为100以上、更优选为120以上的方式含有GSH及GSSG的酵母，即优选为含有大量GSSG的酵母。含有大量GSSG的酵母进一步优选以将GSH重量设为100时GSSG重量优选为300以下、更优选为200以下、更优选为150以下的方式含有GSH及GSSG。

另外，本发明的酵母特别可以是谷胱甘肽还原酶活性降低的酵母、和/或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)和/或谷胱甘肽合成酶(GSH2)和/或谷胱甘肽转运酶(YCF1)的活性增强的酵母。

在本发明中，“酶活性增强”是指：目标酶(想要使活性增强的酶)的活性与野性株等亲株相比增强。另外，“酶活性增强”不仅包含在本来具有目标酶活性的酵母株中使目标酶活性增强的情况，而且还包含对本来不具有目标酶活性的酵母株赋予目标酶活性的情况。作为本发明中想要使活性增强的酶，可以示例出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽转运酶。

酶活性的增强例如可以通过人为地改变酵母的基因来实现。这样的改变例如可以通过使编码目标酶的基因的表达增加而实现。

基因表达的增加例如可以通过将染色体上的基因的启动子取代为更强力的启动子来实现。“更强力的启动子”是指：基因的转录与本来存在的野生型的启动子相比提高的启动子。作为更强力的启动子，可以通过使用各种报告基因获得原有启动子的高活性型启动子。另外，作为更强力的启动子，可以使用公知的高表达启动子，例如，PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等基因的启动子。需要说明的是，取代为强力的启动子可以与后述的基因拷贝数的增加组合而利用。作为利用了更强力的启动子的例子，公开了通过用强转录启动子取代染色体DNA上的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的启动子而使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增强的方法(大竹康之等，生物科学与工业，第50卷第10号，第989～994页，1992年))。

另外，基因表达的增加例如也可以通过使基因的拷贝数增加来实现。

基因的拷贝数的增加可以通过利用DNA对酵母进行转化而实现，所述DNA包含编码想要增强活性的目标酶的氨基酸序列的碱基序列。基于上述DNA的酵母的转化可以使用包含上述DNA的载体来进行。包含上述DNA的载体可以是导入酵母的基因组DNA的载体，也可以是在酵母细胞内能够自主复制的载体。

上述载体可以进一步包含与编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列可发挥作用地连接的启动子等控制因子。这里，控制因子是指，具有功能性启动子、任意相关的转录要素(例如，增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)等的碱基序列。另外，可发挥作用地连接是指，调节基因表达的启动子、增强子等各种调节元件与编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列在宿主细胞中以可发挥作用的状态连接。控制因子的类型可根据宿主而改变是本领域技术人员公知的事项。上述载体优选进一步包含选择标记基因的碱基序列。

包含DNA的载体向酵母基因组DNA的导入例如可以利用同源重组来进行，所述DNA包含编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列。例如，通过将在酵母的染色体的基因组DNA中存在大量拷贝的序列作为标靶进行同源重组，可以向基因组DNA导入基因的大量拷贝。作为基因组DNA中存在大量拷贝的序列，可举出由特有的短重复序列构成的自主复制序列(ARS)、存在约150拷贝的rDNA序列。使用含有ARS的质粒进行酵母的转化的实例记载于国际公开95/32289号小册子。另外，也可以将基因导入转座子，并且将其转移到基因组DNA来导入基因的大量拷贝。

另外，作为通过将上述可自主复制的载体导入酵母来实现基因拷贝数的增加时所使用的上述可自主复制的载体，例如，可以优选使用具有CEN4的复制起点的质粒、具有2μmDNA的复制起点的多拷贝型质粒。也可以将目标基因(包含编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列的DNA)与适合的启动子组合并插入而成的载体导入宿主酵母，使目标基因表达。另外，在使用包含适于使目标基因表达的启动子的载体的情况下，也可以利用载体中的启动子使目标基因表达。

作为获得包含DNA的载体对宿主酵母进行转化的方法的一例，可以示例出以下方法，所述DNA包含编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列。在宿主酵母的基因组DNA序列中，合成具有如下碱基序列的DNA-F2，所述碱基序列是在与编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列的上游区域同源的碱基序列添加限制酶A的切割序列而成的。另一方面，合成具有如下碱基序列的DNA-R2，所述碱基序列是在与上述碱基序列的下游区域的互补碱基序列同源的碱基序列添加限制酶B的切割序列而成的。接下来，以宿主酵母的基因组DNA作为模板，以DNA-F2及DNA-R2作为引物，进行PCR扩增，用限制酶A及限制酶B对扩增后的DNA进行切断，与同样用限制酶A及限制酶B切断且带有选择标记的载体连接，制备重组载体，将该重组载体导入宿主酵母，得到转化体。另外，可以基于In-Fusion cloning kit(Takara Bio公司制)、Gibsonassembly系统、NEBuilder(New England Biolabs公司制)等的说明书进行引物设计及实验操作，将包含编码目标酶氨基酸序列的碱基序列的DNA的PCR片段无缝连接于载体，制备重组载体，将该重组载体导入宿主酵母，得到转化体。重组载体向宿主酵母的导入方法没有特别限定，可以使用例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、土壤杆菌感染法、基因枪法、聚乙二醇法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、阳离子性脂质介导的转染、转导或感染等。通过包含编码目标酶氨基酸序列的碱基序列的DNA进行转化而得到的酵母株可以以重组载体中的选择标记为指标进行筛选。

另外，酶活性增强的改变例如可以通过增加目标酶的比活性来实现。比活性增加了的酶例如可以探索各种生物而获得。另外，也可以通过在原有的酶中导入突变来获得高比活性型的酶。比活性的增加可以单独使用，也可以与如上所述使基因的表达增加的方法任意组合而使用。

目标酶活性增强的确认可以通过测定该酶的活性而进行。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性可以通过Jackson的方法(Jackson,R.C.,Biochem.J.,111,309(1969))进行测定。谷胱甘肽合成酶活性可以通过Gushima等的方法(Gushima,T.et al.,J.Appl.Biochem.,5,210(1983))进行测定。谷胱甘肽转运酶活性可以通过参考THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY Vol.273,No.50,12月11日发行,第33449-33454页,1998而进行测定。

编码目标酶的基因的转录量增大的确认可以通过将由该基因所转录的mRNA的量与亲株进行比较而进行。作为评价mRNA的量的方法，可举出Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。mRNA的量优选与亲株相比例如增大至1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。

目标酶的量增大的确认可以使用抗体利用蛋白质印迹法而进行(Molecularcloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。目标酶的量优选与亲株相比例如增大至1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。

在本发明的酵母具有2倍体以上的倍数性、且通过染色体的改变而酶活性增强的情况下，本发明的酵母只要可以蓄积谷胱甘肽，则可以杂合具有以酶活性增强的方式改变了的染色体和野生型染色体，也可以是以酶活性增强的方式改变了的染色体的纯合子。

本发明中“酶活性降低”是指目标酶活性与野性株等亲株相比降低，包括活性完全消失的情况。酶活性降低的酵母是处于编码目标酶(想要使活性降低的酶)的基因失去功能的状态、或者该功能减少了的状态的酵母，具体而言，可以列举：处于作为上述基因的转录产物的mRNA、作为翻译产物的蛋白质的表达量降低了的状态的酵母、处于上述mRNA或上述蛋白质不正常发挥作为mRNA或蛋白质的功能的状态的酵母。作为本发明中想要使活性降低的酶，可以示例出谷胱甘肽还原酶。

酶活性的降低例如可以通过人为地改变酵母的基因来实现。这种改变例如可以利用突变处理、基因重组技术、使用了RNAi的基因表达抑制处理等来实现。

作为突变处理，可以列举：紫外线照射、或利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、乙基甲磺酸酯(EMS)、甲基甲磺酸酯(MMS)等通常突变处理所使用的诱变剂进行的处理。

作为基因重组技术，例如可以利用公知的技术(FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Dec.1995,p7171-7177、Curr Genet 1986；10(8):573-578、WO 98/14600等)。

酶活性降低的改变例如可以通过使编码目标酶的基因的表达降低而实现。这里，编码目标酶的基因代表性地包含于宿主酵母的基因组DNA。编码目标酶的基因是指包含编码目标酶的氨基酸序列的碱基序列的基因，只要没有特别限定，则不仅表示氨基酸序列的编码区域，而且也不区分其表达调节序列(启动子序列等)、外显子序列、内含子序列等。在对表达调节序列进行改变的情况下，表达调节序列优选改变1个碱基以上，更优选改变2个碱基以上，特别优选改变3个碱基以上。

酶活性降低的改变更优选包含宿主酵母的基因组DNA中编码目标酶的基因的缺损。作为上述基因的缺损，可以是表达调节序列的一部分或全部的缺损，也可以是目标酶的氨基酸序列的编码区域的一部分或全部的缺损。这里，“缺损”是指缺失或损伤，优选为缺失。

包含宿主酵母的基因组DNA中上述基因的前后的序列在内，可以使全部基因缺失。在使目标酶的氨基酸序列的编码区域的一部分或全部缺失的情况下，只要能够实现酶活性的降低，则可以使N末端区域、内部区域、C末端区域等任意区域缺失。通常，缺失的区域长者可以可靠地将基因失活。另外，缺失的区域的前后的序列优选阅读框不一致。在优选的实施方式中，使用基因组DNA中缺失了编码目标酶的基因中氨基酸序列的编码区域和/或表达调节序列的至少一部分的酵母，所述缺失的部分为例如相对于编码区域和/或表达调节序列总体的碱基数由优选为50％以上、更优选为60％以上、更优选为70％以上、更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为100％的碱基数构成的区域。

另外，作为酶活性降低的编码目标酶的氨基酸序列的基因的缺损的其它例子，可以示例出：在基因组DNA上的编码目标酶的基因的编码区域导入氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失1～2个碱基的移码突变等上述基因的损伤。

另外，酶活性降低的编码目标酶的氨基酸序列的基因的缺损例如可以通过将其它序列插入基因组DNA上的编码目标酶的基因的表达调节序列或编码区域而实现。插入部位可以是基因的任意区域，插入序列长者可以可靠地将基因失活。另外，插入部位的前后的序列优选阅读框不一致。作为其它序列，只要使编码的蛋白质的功能降低或消失即可，没有特别限制，可以举出例如标记基因、对谷胱甘肽等γ-谷氨酰化合物的生产有用的基因。

如上所述使基因组DNA上的基因缺损可以通过如下方式实现：例如，制备将编码目标酶的氨基酸序列的基因改变为不产生正常发挥功能的蛋白质的非活性基因，利用包含该非活性基因的重组DNA对酵母进行转化，在非活性基因和基因组DNA上的基因中引起同源重组，由此将基因组DNA上的基因取代为非活性基因。此时，按照宿主的营养缺陷性等表型，重组DNA中预先包含标记基因时容易进行操作。另外，上述重组DNA预先通过用限制酶进行切断等制成直链状时，可以高效地获得在基因组DNA中引入重组DNA的株。由非活性基因编码的蛋白质即使生成，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。

根据使用的重组DNA的结构，作为同源重组的结果，有时野生型基因和非活性基因以包夹有重组DNA的其它部分(例如载体部分及标记基因)的状态被插入基因组DNA。由于在该状态下野生型基因起作用，因此，根据需要在该2个基因间再次引起同源重组，使1个拷贝的野生型基因与载体部分及标记基因同时从基因组DNA中脱落，筛选残留有非活性基因的序列。

另外，例如，用包含任意的序列、且在该任意的序列的两端具备基因组DNA上的取代对象部位(代表性地为编码目标酶的基因的一部分或全部)的上游及下游的序列的线状DNA对酵母进行转化，在取代对象部位的上游及下游分别引起同源重组，由此可以通过1个步骤将取代对象部位取代为该任意的序列。作为该任意的序列，例如可以使用含有标记基因的序列。标记基因也可以随后根据需要除去。在除去标记基因的情况下，也可以将同源重组用的序列添加于标记基因的两端，以便可以有效地除去标记基因。

目标酶活性降低的确认可以通过测定该酶的活性来进行。例如，谷胱甘肽还原酶的活性可以通过公知的方法(Cosmo Bio公司制谷胱甘肽还原酶测定试剂盒商品编号7510-100-K等)进行测定。

编码目标酶的基因的转录量降低的确认可以通过将由同源基因转录的mRNA的量与亲株进行比较而进行。作为评价mRNA的量的方法，可举出Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。mRNA的量优选与亲株相比降低至例如50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。

目标酶的量降低的确认可以使用抗体利用蛋白质印迹法而进行(Molecularcloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001))。目标酶的量优选与亲株相比降低至例如50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。

作为酵母的转化法，可以采用原生质体法、KU法(H.Ito et al.,J.Bateriol.,153-163(1983))、KUR法(Fermentation and Industry,vol.43,p.630-637(1985))、电穿孔法(Luis et al.,FEMS Micro biology Letters 165(1998)335-340)、使用载体DNA的方法(Gietz R.D.and Schiestl R.H.,Methods Mol.Cell.Biol.5:255-269(1995))等通常用于酵母的转化的方法。另外，关于酵母的胞子形成、单倍体酵母的分离等操作，记载于“化学和生物实验线31酵母的实验技术”，初版，广川书店；“生物手册系列10利用酵母的基因实验法”初版，羊土社等。

本发明的酵母具有2倍体以上的倍数性时，本发明的酵母只要能够积蓄谷胱甘肽等γ-谷氨酰化合物，就可以杂合具有以酶活性降低的方式进行了改变的基因和野生型基因，通常优选为以酶活性降低的方式进行了改变的基因的纯合子。

(1)谷胱甘肽还原酶

谷胱甘肽还原酶是指具有利用NADPH(还原型烟酰胺二核苷酸磷酸)将下述式(2)所示的氧化型谷胱甘肽进行还原的活性的酶。

谷胱甘肽还原酶活性受到抑制的酵母的将GSSG转变为GSH的活性低，因此易于积蓄GSSG。这样的谷胱甘肽还原酶活性受到抑制的酵母特别优选为以将GSH重量设为100时GSSG重量优选为20以上、更优选为40以上、更优选为60以上、更优选为100以上、更优选为120以上的方式含有GSH及GSSG的含有大量GSSG的酵母。谷胱甘肽还原酶活性受到抑制的酵母进一步优选以将GSH重量设为100时GSSG重量优选为300以下、更优选为200以下、更优选为150以下的方式含有GSH及GSSG。

[化学式1]

本发明中的谷胱甘肽还原酶只要是具有利用NADPH或NADH将二硫键进行还原的活性(即、谷胱甘肽还原酶活性)的酶即可，没有特别限定，例如，优选为以下(1a)～(1e)中的任一种：

(1a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

(1d)由与具有和序列号2互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质、以及

这里，上述(1a)～(1e)中的任意蛋白质并不限定于仅由上述(1a)～(1e)限定的氨基酸序列构成的多肽链所组成的形式，可以是该多肽链被糖链等化学修饰而成的形式，也可以是该多肽链与其它多肽链融合而成的融合蛋白的形式。

上述(1b)中记载的由序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质可以按照“Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.,1989)”等中记载的公知的方法来制备，只要具有谷胱甘肽还原酶活性就包含于上述蛋白质。

作为通过取代、插入、缺失和/或添加而改变了的氨基酸序列，可以仅包含1种改变(例如取代)，也可以包含2种以上的改变(例如取代和插入)。另外，在取代的情况下，取代的氨基酸优选为具有与取代前的氨基酸类似的性质的氨基酸(同族氨基酸)。这里，将以下列举的各组的同一组内的氨基酸作为同族氨基酸。

(第1组：中性非极性氨基酸)Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Pro、Phe

(第2组：中性极性氨基酸)Ser、Thr、Gln、Asn、Trp、Tyr

(第3组：酸性氨基酸)Glu、Asp

(第4组：碱性氨基酸)His、Lys、Arg

在上述(1b)中，“1个或多个”氨基酸是指例如1～60个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、进一步优选为1～5个、1～4个、1～3个或1～2个氨基酸。

在上述(1c)中，与序列号1所示的氨基酸序列的序列同一性优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，最优选为99％以上。对于氨基酸序列的序列同一性而言，将序列号1或2所示的氨基酸序列与要评价的氨基酸序列进行比较，用在两者序列中氨基酸一致的位置的数量除以比较的总氨基酸数再乘以100，用所得的值表示。

在上述(1d)中，与具有和序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是指，将由和序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，通过在严格的条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或Southern杂交法等而得到的DNA。

杂交可以按照“Molecular Cloning,A laboratory manual,second edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)”等所记载的方法进行。这里，在严格的条件下进行杂交的DNA可以举出例如使用固定有来自菌落或噬菌斑的DNA的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下于65℃下进行杂交之后，使用2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65℃条件下清洗过滤器而可以获得的DNA。优选为通过在65℃下用1倍浓度的SSC溶液清洗而可以获得的DNA，更优选为通过在65℃下用0.5倍浓度的SSC溶液清洗而可以获得的DNA，进一步优选为通过在65℃下用0.2倍浓度的SSC溶液清洗而可以获得的DNA，最优选为通过在65℃下用0.1倍浓度的SSC溶液清洗而可以获得的DNA。

如上所述，记载了杂交条件，但杂交条件并不特别限于这些条件。作为影响杂交的严格性的要素，可以认为是温度或盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就可以通过适当选择这些要素而实现最优的严格性。

作为可在上述条件下进行杂交的DNA，可以列举与序列号2所示的DNA的序列同一性为70％以上、优选为74％以上、更优选为79％以上、进一步优选为85％以上、进一步更优选为90％以上、进一步更优选为95％以上、进一步更优选为97％以上、进一步更优选为98％以上、最优选为99％以上的DNA。

对于DNA的序列同一性(％)而言，将所对比的2个DNA最优排列，用核酸碱基(例如A、T、C、G、U、或I)在两者的序列中一致的位置的数量除以比较的碱基总数，再将该结果乘以100，用得到的数值表示。

DNA的序列同一性例如可以使用以下的序列分析用工具进行计算：GCG WisconsinPackage(Program Manual for The Wisconsin Package,Version8,1994年9月,GeneticsComputer Group,575Science Drive Medison,Wisconsin,USA53711；Rice,P.(1996)Program Manual for EGCG Package,Peter Rice,The Sanger Centre,Hinxton Hall,Cambridge,CB10 1RQ,England)、以及the.e.xPASy World Wide Web分子生物学用服务器(Geneva University Hospital and University of Geneva,Geneva,Switzerland)。

在上述(1e)中，序列号2所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA可以按照“Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley andSons,Inc.,1989)”等所记载的公知的方法来制备。

作为通过取代、插入、缺失和/或添加而改变的碱基序列，可以仅包含1种改变(例如取代)，也可以包含2种以上的改变(例如取代和插入)。

在上述(1e)中，对于“1个或多个”碱基而言，只要由该DNA编码的蛋白质具有谷胱甘肽还原酶活性即可，没有特别限定，是指例如为1～150个、优选为1～100个、更优选为1～50个、进一步优选为1～20个、进一步更优选为1～10个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个碱基。

作为确认上述(1a)～(1e)的蛋白质为具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质的方法，可以列举例如如下方法：使用DNA重组法制备表达想要确认活性的蛋白质的转化体，使用该转化体制造该蛋白质后，使该蛋白质、以及氧化型谷胱甘肽、NADPH存在于水性介质中，利用HPLC等分析在该水性介质中是否生成、积蓄还原型谷胱甘肽或NADP。

在本发明中，谷胱甘肽还原酶活性与亲株相比，优选降低至50％以下，更优选降低至20％以下，进一步优选降低至10％以下，特别优选降低至5％以下。另外，谷胱甘肽还原酶活性特别优选实质上消失。

作为本发明中的谷胱甘肽还原酶，在上述蛋白质中，优选为由序列号1所示的氨基酸序列构成的GLR1。序列号2示出了编码序列号1所示的GLR1的氨基酸序列的GLR1基因的碱基序列。

上述(1b)、(1c)、(1d)或(1e)的蛋白质的谷胱甘肽还原酶活性优选与上述(1a)的蛋白质的谷胱甘肽还原酶活性为相同程度或更高，更优选为上述(1a)的蛋白质的谷胱甘肽还原酶活性的50％以上、80％以上、90％以上或100％以上，更优选为200％以下或150％以下。

(2)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

本发明中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶只要是具有使谷氨酸与半胱氨酸缩合而合成γ-谷氨酰半胱氨酸的活性(即，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性)的酶即可，没有特别限定，例如，优选为以下(2a)～(2e)中的任一种：

(2a)由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

这里，上述(2a)～(2e)中任一种蛋白质并不限定于仅由上述(2a)～(2e)限定的氨基酸序列构成的多肽链所组成的形式，可以是该多肽链被糖链等化学修饰而成的形式，也可以是该多肽链与其它多肽链融合而成的融合蛋白的形式。

上述(2b)中记载的由序列号3所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质可以按照上述(1)中记载的方法来制备，只要具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性就包含于上述蛋白质。

作为通过取代、插入、缺失和/或添加而改变了的氨基酸序列，可以仅包含1种改变(例如取代)，也可以包含2种以上的改变(例如取代和插入)。另外，在取代的情况下，取代的氨基酸优选为具有与取代前的氨基酸类似的性质的氨基酸(同族氨基酸)。对于同族氨基酸，如上所述。

在上述(2b)中，“1个或多个”氨基酸是指例如1～60个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、进一步优选为1～5个、1～4个、1～3个或1～2个氨基酸。

在上述(2c)中，与序列号3所示的氨基酸序列的序列同一性优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，最优选为99％以上。氨基酸序列的序列同一性可以通过(1)中上述的方法计算。

在上述(2d)中，与具有和序列号4所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是指，将由和序列号4所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，通过在严格的条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或Southern杂交法等而得到的DNA。杂交的条件等如(1)中所述。

作为可在上述条件下进行杂交的DNA，可以列举与序列号4所示的DNA的序列同一性为70％以上、优选为74％以上、更优选为79％以上、进一步优选为85％以上、进一步更优选为90％以上、进一步更优选为95％以上、进一步更优选为97％以上、进一步更优选为98％以上、最优选为99％以上的DNA。DNA的序列同一性(％)如(1)中所述。

在上述(2e)中，序列号4所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA可以按照(1)中所述的方法来制备。

在上述(2e)中，对于“1个或多个”碱基而言，只要编码该DNA的蛋白质具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性即可，没有特别限定，是指例如为1～150个、优选为1～100个、更优选为1～50个、进一步优选为1～20个、进一步更优选为1～10个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个碱基。

作为确认上述(2a)～(2e)的蛋白质为具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质的方法，可以列举例如如下方法：例如，使用DNA重组法制备表达想要确认活性的蛋白质的转化体，使用该转化体制造该蛋白质后，使该蛋白质、以及L-谷氨酸及L-半胱氨酸存在于水性介质中，利用HPLC等分析在该水性介质中是否生成、积蓄γ-谷氨酰半胱氨酸。优选在上述水性介质中根据需要进一步存在ATP。

作为本发明中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，在上述蛋白质中，优选为由序列号3所示的氨基酸序列构成的GSH1。序列号4中示出了编码序列号3所示的GSH1的氨基酸序列的GSH1基因的碱基序列。

上述(2b)、(2c)、(2d)或(2e)的蛋白质的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性优选与上述(2a)的蛋白质的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性为相同程度或更高，更优选为上述(2a)的蛋白质的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的50％以上、80％以上、90％以上或100％以上，更优选为200％以下或150％以下。

(3)谷胱甘肽合成酶

本发明中的谷胱甘肽合成酶只要是具有使γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸缩合而合成谷胱甘肽的活性(即，谷胱甘肽合成酶活性)的酶即可，没有特别限定，例如，优选为以下(3a)～(3e)中的任一种：

(3a)由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

这里，上述(3a)～(3e)中任一种蛋白质并不限定于仅由上述(3a)～(3e)限定的氨基酸序列构成的多肽链所组成的形式，可以是该多肽链被糖链等化学修饰而成的形式，也可以是该多肽链与其它多肽链融合而成的融合蛋白的形式。

上述(3b)中记载的由序列号5所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质可以按照上述(1)中记载的方法来制备，只要具有谷胱甘肽合成酶活性就包含于上述蛋白质。

作为通过取代、插入、缺失和/或添加而改变了的氨基酸序列，可以仅包含1种改变(例如取代)，也可以包含2种以上的改变(例如取代和插入)。另外，在取代的情况下，取代的氨基酸优选为具有与取代前的氨基酸类似的性质的氨基酸(同族氨基酸)。对于同族氨基酸，如(1)中所述。

在上述(3b)中，“1个或多个”氨基酸是指例如1～60个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、进一步优选为1～5个、1～4个、1～3个或1～2个氨基酸。

在上述(3c)中，与序列号5所示的氨基酸序列的序列同一性优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，最优选为99％以上。氨基酸序列的序列同一性可以通过(1)中上述的方法计算。

在上述(3d)中，与具有和序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是指，将由和序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，通过在严格条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或Southern杂交法等而得到的DNA。杂交的条件等如(1)中所述。

作为可在上述条件下进行杂交的DNA，可以列举与序列号6所示的DNA的序列同一性为70％以上、优选为74％以上、更优选为79％以上、进一步优选为85％以上、进一步更优选为90％以上、进一步更优选为95％以上、进一步更优选为97％以上、进一步更优选为98％以上、最优选为99％以上的DNA。DNA的序列同一性(％)如(1)中所述。

在上述(3e)中，序列号6所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA可以按照(1)中所述的方法来制备。

在上述(3e)中，对于“1个或多个”碱基而言，只要该DNA所编码的蛋白质具有谷胱甘肽合成酶活性即可，没有特别限定，是指例如为1～150个、优选为1～100个、更优选为1～50个、进一步优选为1～20个、进一步更优选为1～10个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个碱基。

作为确认上述(3a)～(3e)的蛋白质为具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质的方法，可以列举例如如下方法：例如，使用DNA重组法制备表达想要确认活性的蛋白质的转化体，使用该转化体制造该蛋白质后，使该蛋白质、以及γ-谷氨酰半胱氨酸及甘氨酸存在于水性介质中，利用HPLC等分析在该水性介质中是否生成、积蓄谷胱甘肽。优选在上述水性介质中根据需要进一步存在ATP。

作为本发明中的谷胱甘肽合成酶，优选为由序列号5所示的氨基酸序列构成的GSH2。序列号6中示出了编码序列号5所示的GSH2的氨基酸序列的GSH2基因的碱基序列。

上述(3b)、(3c)、(3d)或(3e)的蛋白质的谷胱甘肽合成酶活性优选与上述(3a)的蛋白质的谷胱甘肽合成酶活性为相同程度或更高，更优选为上述(3a)的蛋白质的谷胱甘肽合成酶活性的50％以上、80％以上、90％以上或100％以上，更优选为200％以下或150％以下。

(4)谷胱甘肽转运酶

在本发明中，谷胱甘肽转运酶是指具有将细胞质的谷胱甘肽转运至液泡的功能(即，谷胱甘肽转运酶活性)的酶，只要具有该功能即可，没有特别限定。

谷胱甘肽转运酶优选为以下(4a)～(4e)中的任一种：

(4a)由序列号7所示的氨基酸序列构成的蛋白质、

这里，上述(4a)～(4e)中任一种蛋白质并不限定于仅由上述(4a)～(4e)限定的氨基酸序列构成的多肽链所组成的形式，可以是该多肽链被糖链等化学修饰而成的形式，也可以是该多肽链与其它多肽链融合而成的融合蛋白的形式。

上述(4b)中记载的由序列号7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了取代、插入、缺失和/或添加的氨基酸序列构成的蛋白质可以按照上述(1)中记载的方法来制备，只要具有谷胱甘肽转运酶活性就包含于上述蛋白质。

在上述(4b)中，“1个或多个”氨基酸是指例如1～60个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、进一步优选为1～5个、1～4个、1～3个或1～2个氨基酸。

在上述(4c)中，与序列号7所示的氨基酸序列的序列同一性优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，进一步优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为97％以上，进一步优选为98％以上，最优选为99％以上。氨基酸序列的序列同一性可以通过(1)中上述的方法计算。

在上述(4d)中，与具有和序列号8所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA是指，将由和序列号8所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，通过在严格条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或Southern杂交法等而得到的DNA。杂交的条件等如(1)中所述。

作为可在上述条件下进行杂交的DNA，可以列举与序列号8所示的DNA的序列同一性为70％以上、优选为74％以上、更优选为79％以上、进一步优选为85％以上、进一步更优选为90％以上、进一步更优选为95％以上、进一步更优选为97％以上、进一步更优选为98％以上、最优选为99％以上的DNA。DNA的序列同一性(％)如(1)中所述。

在上述(4e)中，序列号8所示的碱基序列中1个或多个碱基发生了取代、缺失、插入和/或添加的DNA可以按照(1)中所述的方法来制备。

在上述(4e)中，对于“1个或多个”碱基而言，该DNA所编码的蛋白质只要具有谷胱甘肽转运酶活性即可，没有特别限定，是指例如为1～150个、优选为1～100个、更优选为1～50个、进一步优选为1～20个、进一步更优选为1～10个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个碱基。

作为本发明中的谷胱甘肽转运酶，优选为由序列号7所示的氨基酸序列构成的YCF1。序列号8中示出了编码序列号7所示的YCF1的氨基酸序列的YCF1基因的碱基序列。

上述(4b)、(4c)、(4d)或(4e)的蛋白质的谷胱甘肽转运酶活性优选与上述(4a)的蛋白质的谷胱甘肽转运酶活性为相同程度或更高，更优选为上述(4a)的蛋白质的谷胱甘肽转运酶活性的50％以上、80％以上、90％以上或100％以上，更优选为200％以下或150％以下。

(5)本发明的酵母

本发明的酵母只要是具有谷胱甘肽生产能力的酵母，就没有特别限制，可举出例如：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomycescarlesbergensis)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、鲁酵母(Saccharomycesrouxii)等酵母菌属、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)等念珠菌属、粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)等裂殖酵母属、易变球拟酵母(Toluropsis versatilis)、嗜石油球拟酵母(Toluropsis petrophilum)等球拟酵母属、毕赤酵母(Pichia)属、酒香酵母(Brettanomyces)属、芽生圆酵母(Mycotorula)属、红酵母(Rhodotorula)属、汉逊酵母(Hansenula)属、内孢霉(Endomyces)属等酵母。其中，优选为酵母属、念珠菌属、或毕赤酵母属的酵母，进一步优选为酵母菌属的酿酒酵母、念珠菌属的产朊假丝酵母。例如，作为亲株，可以优选使用Saccharomyces cerevisiae 24-51-78(保藏编号：FERM BP-19072)。Saccharomyces cerevisiae 24-51-78于2002年10月18日在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(日本千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 120号室)进行了国际保藏(保藏人所附的用于识别的标记：Saccharomycescerevisiae 24-51-78、保藏编号：FERM BP-19072)。

(6)含有碱性氨基酸的培养基

在本发明中，“碱性氨基酸”代表性地为选自赖氨酸、精氨酸及组氨酸中的1种以上，更优选为选自赖氨酸及精氨酸中的1种以上，最优选为赖氨酸。碱性氨基酸优选为L体。

本发明中使用的培养基的碱性氨基酸的浓度为0.8g/L以上，优选为1g/L以上，更优选为2g/L以上，特别优选为4g/L以上。在包含2种以上碱性氨基酸的情况下，只要碱性氨基酸的总浓度为上述范围即可，更优选各碱性氨基酸的浓度分别为0.8g/L以上，优选为1g/L以上，更优选为2g/L以上，特别优选为4g/L以上。

本发明中使用的培养基的碱性氨基酸的浓度上限没有特别限定，通常为100g/L以下，优选为50g/L以下，更优选为20g/L以下。在包含2种以上碱性氨基酸的情况下，各碱性氨基酸的浓度分别通常为100g/L以下，优选为50g/L以下，更优选为20g/L以下。

碱性氨基酸可以以盐的形式存在。

本发明中使用的培养基优选在酵母培养开始时以上述的浓度范围含有碱性氨基酸。本发明人等出乎意料地发现，在培养开始时于以上述浓度范围包含碱性氨基酸的培养基中对酵母进行培养的情况下，含有大量谷胱甘肽的效果特别高。在该情况下，酵母培养中，碱性氨基酸在培养基中的浓度低于0.8g/L也在本实施方式的范围内。

本发明中使用的培养基只要是含有碱性氨基酸的培养基即可，其它成分没有特别限定。即，只要适当含有碳源、氮源、无机物、其它营养物等，合成培养基、半合成培养基、天然(复合)培养基均可以使用。

本发明中使用的培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基，特别优选为液体培养基。

作为含有碱性氨基酸的培养基中包含的碳源，可以使用糖蜜、葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、木糖、半乳糖、淀粉、淀粉水解物液等各种碳水化合物原料。另外，也可以使用丙酮酸、醋酸、乳酸等各种有机酸、天冬氨酸、丙氨酸等各种氨基酸类。

含有碱性氨基酸的培养基的特别优选的实施方式包含糖蜜作为碳源。糖蜜是指由甘蔗、甜菜等原料纯化砂糖时产生的以糖为主成分的粘且黑褐色的液体副产物。含有碱性氨基酸的培养基更优选为以糖蜜中包含的糖计含有1重量％以上、更优选含有2重量％以上、更优选含有3重量％以上的量的糖蜜的液体培养基，糖蜜的含量的上限没有特别限定，例如，以糖蜜中包含的糖计，包含为10重量％以下、5重量％以下、4重量％以下的量的糖蜜的液体培养基。含有碱性氨基酸的培养基可以进一步包含除糖蜜以外的碳源，更优选为将糖蜜设为碳源总体的至少10重量％以上的培养基(糖蜜培养基)。糖蜜中包含的糖可以在酸水解后通过Bertrand法进行测定。

作为含有碱性氨基酸的培养基中包含的氮源，可以使用氨或氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机或有机铵盐类、或尿素和其它含氮化合物、或胨、NZ胺、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物、脱脂大豆或其消化物、水解物等氮性有机物质或天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸等各种氨基酸。

作为含有碱性氨基酸的培养基中包含的无机物，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等。

(7)基于酵母的谷胱甘肽的生产

本发明的方法包括在含有给定浓度的碱性氨基酸的培养基中对酵母进行培养。

培养在振荡培养、通气搅拌深部培养等好气培养条件下实施。培养时pH被优选控制为3.0～8.0、更优选为4.0～6.0、最优选为5.0。作为pH控制的中和剂，可以使用氨水、氢氧化钠、碳酸铵等。相对于培养基1L，对好气培养时的培养基的空气供给量优选为0.2L/分钟以上，更优选为0.5L/分钟以上，进一步优选为1L/分钟以上。另外，在使用发酵罐(Jarfermentor)进行培养的情况下，搅拌数优选为200rpm以上，更优选为300rpm以上，进一步优选为400rpm以上。发酵罐的容量没有特别限定，例如可以示例出总容量2L的发酵罐。另外，培养时的温度通常为20～45℃，优选为25～35℃，最优选为28～32℃。培养期间通常为16小时～72小时，优选为24小时～48小时。向培养基中加入的初期细胞浓度(进料浓度)因酵母的种类、培养基组成等而异，但初始浑浊度(OD600)优选为0.01～2.0，更优选为0.02～1.0，进一步优选为0.1～0.4。关于葡萄糖等上述碳源，可以应用在培养初期一并装入而进行培养的分批方式、随着培养期间而一点点添加的补料分批方式中的任意方式，但根据本发明人等的研究结果，虽然根据使用的微生物而不同，根据补料分批方式，增殖速度提高，最终菌浓度也成为更高水平，菌体内的谷胱甘肽合成相关酶的活性也升高，因此更优选。作为在补料分批方式中确定葡萄糖等碳源的补料速度的指标，可以利用培养液的浑浊度、氧消耗速度、二氧化碳产生速度、pH调整用中和剂的消耗量等，通过与使用的酵母相应地选择适当的指标、并对应于其变化而使碳源的补料速度变化，可以谋求酵母培养的最优化，最终菌浓度及谷胱甘肽合成相关酶的活性提高，其结果是可以实现谷胱甘肽的生产性的提高。其中，如上所述，关于碱性氨基酸，优选在培养初期通过分批方式一并添加培养基。

通过在培养基中对本发明的酵母进行培养，可以得到包含主要在菌体内含有高浓度谷胱甘肽的酵母和培养基的培养混合物。本发明的谷胱甘肽的制造方法优选进一步包括从得到的培养混合物中回收谷胱甘肽。

为了从培养混合物中回收谷胱甘肽，例如，可以通过过滤、离心分离操作将培养混合物中的酵母菌体与培养基分离，根据需要将热水提取、碱提取法、酶分解法、自消化法、物理性破碎操作等适当组合，从得到的酵母菌体中提取谷胱甘肽。另外，对于培养后的培养混合物，可以直接实施上述的提取操作，或者也可以进行酶分解法、自消化法、物理性破碎操作，使酵母菌体中的谷胱甘肽溶出至培养基中后，进行上述提取操作而提取谷胱甘肽。从这样得到的谷胱甘肽中通过一般的方法对谷胱甘肽进行纯化，由此可以得到高度地含有谷胱甘肽的组分、或谷胱甘肽粉末。

另外，通过将利用上述步骤得到的谷胱甘肽中包含的氧化型谷胱甘肽还原，可以得到提高了还原型的比例的谷胱甘肽。作为进行还原的方法，没有特别限定，可以优选举出利用谷胱甘肽还原酶进行的还原。

实施例

以下，列举实施例等对本发明更详细地进行说明，但本发明并不受以下实施例等的限定。需要说明的是，在以下的实施例中，“单位干燥菌体重量的还原型谷胱甘肽含量(％(w/w))”有时也称为“GSH含有率(％)”，“单位干燥菌体重量的氧化型谷胱甘肽含量(％(w/w))”有时也称为“GSSG含有率(％)”。如果没有特别说明，则“％”是指“％(w/w)”。

[制造例1]破坏了GLR1基因的酵母(GLR1破坏株)的制备

制备S.cereviciae用vector pD1511(ATUM公司)的gRNA部分的序列为5’-GATTACCTCGTCATCGGGGG-3’(序列号9)的质粒，进一步准备由DNA序列5’-ACACTTCTGGTTTTTCTCATGCGCTTCTCACTCTCAGTATATTTTGCTGCTTTCCTTCATATGTATATATATCTATTTACATATTAGTTTACAGAACTTTAGCAACGAAACTAGACGTCCAATCTGCTGTTGCTATACTGGACTTTTGTACTCTTGTAAACAATCTTATATAGCATCCTGAAATACGTAGTAATTTTGTC-3’(序列号10)及其互补DNA构成的双链DNA片段，使用这两者以S accharomyces cerevisiae 24-51-78(保藏编号：FERM BP-19072)作为宿主进行转化，得到了将编码序列号1所示的氨基酸序列的谷胱甘肽还原酶(GLR1)基因破坏而成的GLR1破坏株。在该GLR1破坏株中，宿主酵母的基因组DNA中编码序列号1所示的氨基酸序列的GLR1基因的编码区域的一部分或全部被破坏。

[制造例2]破坏了GLR1基因且增强了YCF1、GSH1、GSH2的表达的酵母(GLR1破坏+YCF1增强+GSH1增强+GSH2增强株)的制备

以制造例1中制备的GLR1破坏株作为宿主，通过非专利文献(Hara KY,KiriyamaK,Inagaki A,Nakayama H,Kondo A.(2012)Improvement of gl utathione productionby metabolic engineering thesulfate assimilation pathwayof Saccharomycescerevisiae.Appl Microbiol Biotechnol,426(2):129-33.)中记载的方法，增强由序列号3所示的氨基酸序列构成的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)及由序列号5所示的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶(GSH2)的表达，得到了GLR1破坏+GSH1增强+GSH2增强株。上述非专利文献中记载的GSH1及GSH2的表达的增强是通过向宿主酵母的基因组DNA导入各多个拷贝的与强表达启动子可控制地连接的GSH1基因及与强表达启动子可控制地连接的GSH2基因而实现的。进一步以Saccharomyces cerevisiae Y PH499株的基因组DNA作为模板，使用5’-AAAAGGATCCATGGCTGGTA ATCTTGTTTCATGGGCC-3’(序列号11)及5’-AAAACTCGAGTTAATTTTCA TTGACCAAACCAGCCTCC-3’(序列号12)作为引物，进行PCR扩增，用BamHI及XhoI消化扩增产物，得到了编码序列号7所示的氨基酸序列且包含序列号8所示的碱基序列的谷胱甘肽转运酶(YCF1)基因BamHI-XhoI片段。将该片段连接于p427TEF(CosmoBio公司制)的BamHI-XhoI消化位点，得到了YCF1表达质粒p427-YCF1。使用该质粒进一步对上述得到的GLR1破坏+GSH1增强+GSH2增强株进行了转化(GLR1破坏+YCF1增强+GSH1增强+GSH2增强株)。

[实施例1]

作为酵母，将制造例2中记载的GLR1破坏+YCF1增强+GSH1增强+GSH2增强株在YPD培养基(10g/L酵母提取物(Difco laboratories公司制)、20g/L聚胨(和光纯药株式会社制)、20g/L葡萄糖(Nacalai tesque公司制))7ml中于30℃振荡16～24小时，由此进行了种子培养。

接下来，在包含糖蜜赖氨酸培养基50ml(糖蜜4％(以糖蜜中的葡萄糖量计)、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％、赖氨酸0.1％、0.2％或0.4％)的坂口烧瓶中接种，使得种子培养液为3ml，在30℃、搅拌130rpm的条件下进行40小时培养，回收了1ml培养液。另外，同时还用糖蜜培养基50ml(糖蜜4％(以糖蜜中的葡萄糖量计)、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％)作为比较对照进行了培养。

将培养液1ml离心分离而收集到的菌体用无菌水清洗2次，在80℃下热处理5分钟，由此使菌体内的谷胱甘肽溶出。将该溶出液在25℃、20000xg下离心5分钟，用HPLC法分析得到的上清的谷胱甘肽浓度，确定了每1ml培养液的还原型谷胱甘肽(GSH)量及氧化型谷胱甘肽(GSSG)量。同样地用无菌水将培养液1ml清洗2次，在80℃的干燥器内静置过夜，由此得到每1ml培养液的干燥菌体重量。通过用GSH量及GSSG量分别除以干燥菌体重量，计算出GSH含有率(％)及GSSG含有率(％)。将使用了未添加赖氨酸的糖蜜培养基的比较对照试验中的GSH含有率(％)设为100％，求出使用了糖蜜培养基的比较对照试验中的GSSG含有率(％)、以及使用了糖蜜赖氨酸培养基的实施例1的试验中的GSH含有率(％)及GSSG含有率(％)的相对值。将结果示于下表。

表1

根据表可知，通过提高培养基中的赖氨酸浓度，可以显著提高GSH含有率及GSSG含有率。

[实施例2]

接下来，在包含糖蜜精氨酸培养基50ml(糖蜜4％(以糖蜜中的葡萄糖量计)、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％、精氨酸0.1％)的坂口烧瓶中接种，使得种子培养液为3ml，在30℃、搅拌130rpm的条件下进行40小时培养，回收了1ml培养液。另外，同时用糖蜜培养基50ml(糖蜜(以糖蜜中的葡萄糖量计)4％、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％)作为比较对照，进行了培养。

将培养液1ml离心分离而收集到的菌体用无菌水清洗2次，在80℃下热处理5分钟，由此使菌体内的谷胱甘肽溶出。将该溶出液在25℃、20000xg下离心5分钟，用HPLC法分析得到的上清的谷胱甘肽浓度，确定了每1ml培养液的谷胱甘肽量(GSH量和GSSG量的总计)。同样地用无菌水将培养液1ml清洗2次，在80℃的干燥器内静置过夜，由此得到每1ml培养液的干燥菌体重量。通过用谷胱甘肽量除以干燥菌体重量，计算出谷胱甘肽含有率(％)。将使用了未添加精氨酸的糖蜜培养基的比较对照试验中的谷胱甘肽含有率(％)设为100％，求出使用了糖蜜精氨酸培养基的实施例2的试验中的谷胱甘肽含有率(％)的相对值。将结果示于下表。

表2

	培养基	谷胱甘肽含有率相对值
			比较对照	糖蜜培养基	100％
实施例2	糖蜜精氨酸培养基	111％

根据表可知，通过在糖蜜培养基中添加精氨酸，可以显著提高酵母的谷胱甘肽含有率。

[实施例3]

在实施例2中，使用了糖蜜组氨酸培养基50ml(糖蜜4％(以糖蜜中的葡萄糖量计)、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％、组氨酸0.1％)来代替糖蜜精氨酸培养基，除此以外，通过与实施例2相同的条件及步骤，在糖蜜组氨酸培养基及未添加组氨酸的糖蜜培养基中培养制造例2中制备的GLR1破坏+YCF1增强+GSH1增强+GSH2增强株，测定了谷胱甘肽含有率(％)。与实施例2同样，将使用了未添加组氨酸的糖蜜培养基的比较对照试验中的谷胱甘肽含有率(％)设为100％，求出使用了糖蜜组氨酸培养基的实施例3的试验中的谷胱甘肽含有率(％)的相对值。

表3

	培养基	谷胱甘肽含有率相对值
			比较对照	糖蜜培养基	100％
实施例3	糖蜜组氨酸培养基	105％

与精氨酸及赖氨酸同样，通过在添加了组氨酸的糖蜜培养基中进行培养，可以显著提高酵母的谷胱甘肽含有率。

[实施例4]

作为酵母，将Saccharomyces cerevisiae 24-51-78(保藏编号：FERM BP-19072)在YPD培养基(10g/L酵母提取物(Difco laboratories公司制)、20g/L聚胨(和光纯药株式会社制)、20g/L葡萄糖(Nacalai tesque公司制))7ml中于30℃振荡16～24小时，由此进行了种子培养。

接下来，在包含糖蜜赖氨酸培养基50ml(糖蜜4％(以糖蜜中的葡萄糖量计)、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％、赖氨酸0.1％)、糖蜜精氨酸培养基(除了含有精氨酸0.1％来代替赖氨酸0.1％以外，具有与糖蜜赖氨酸培养基相同的组成)、或糖蜜组氨酸培养基(除了含有组氨酸0.1％来代替赖氨酸0.1％以外，具有与糖蜜赖氨酸培养基相同的组成)的坂口烧瓶中接种，使得种子培养液为3ml，在30℃、搅拌130rpm的条件下进行40小时培养，回收了1ml培养液。另外，同时用糖蜜培养基50ml(糖蜜(以糖蜜中的葡萄糖量计)4％、尿素0.3％、硫酸铵0.08％、磷酸2％、铵0.04％)作为比较对照，进行了培养。

按照实施例2中记载的步骤测定了各培养基中的培养物的谷胱甘肽含有率(％)。与实施例2同样，将使用了未添加赖氨酸、精氨酸及组氨酸的糖蜜培养基的比较对照试验中的谷胱甘肽含有率(％)设为100％，求出使用了糖蜜赖氨酸培养基、糖蜜精氨酸培养基或糖蜜组氨酸培养基的实施例4的试验中的谷胱甘肽含有率(％)的相对值。

表4

	培养基	谷胱甘肽含有率相对值
			比较对照	糖蜜培养基	100％
实施例4	糖蜜赖氨酸培养基	106％
			实施例4	糖蜜精氨酸培养基	105％
实施例4	糖蜜组氨酸培养基	105％

在将作为酵母的Saccharomyces cerevisiae 24-51-78(保藏编号：FERM BP-19072)在添加了碱性氨基酸的培养基中进行培养的情况下，也显著提高了酵母的谷胱甘肽含有率。

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用加入本说明书中。

序列表

<110> 株式会社钟化（Kaneka Corporation）

<120> 谷胱甘肽的制造方法

<130> B180414

<150> JP 2018-167655

<151> 2018-09-07

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 483

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

Met Leu Ser Ala Thr Lys Gln Thr Phe Arg Ser Leu Gln Ile Arg Thr

1 5 10 15

Met Ser Thr Asn Thr Lys His Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Val Ala Ser Ala Arg Arg Ala Ala Ser Tyr Gly Ala Lys

35 40 45

Thr Leu Leu Val Glu Ala Lys Ala Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Cys Val Pro Lys Lys Val Met Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Thr

65 70 75 80

Arg Val Ser His Ala Asn Glu Tyr Gly Leu Tyr Gln Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Asp Lys Glu His Leu Thr Phe Asn Trp Pro Glu Phe Lys Gln Lys Arg

100 105 110

Asp Ala Tyr Val His Arg Leu Asn Gly Ile Tyr Gln Lys Asn Leu Glu

115 120 125

Lys Glu Lys Val Asp Val Val Phe Gly Trp Ala Arg Phe Asn Lys Asp

130 135 140

Gly Asn Val Glu Val Gln Lys Arg Asp Asn Thr Thr Glu Val Tyr Ser

145 150 155 160

Ala Asn His Ile Leu Val Ala Thr Gly Gly Lys Ala Ile Phe Pro Glu

165 170 175

Asn Ile Pro Gly Phe Glu Leu Gly Thr Asp Ser Asp Gly Phe Phe Arg

180 185 190

Leu Glu Glu Gln Pro Lys Lys Val Val Val Val Gly Ala Gly Tyr Ile

195 200 205

Gly Ile Glu Leu Ala Gly Val Phe His Gly Leu Gly Ser Glu Thr His

210 215 220

Leu Val Ile Arg Gly Glu Thr Val Leu Arg Lys Phe Asp Glu Cys Ile

225 230 235 240

Gln Asn Thr Ile Thr Asp His Tyr Val Lys Glu Gly Ile Asn Val His

245 250 255

Lys Leu Ser Lys Ile Val Lys Val Glu Lys Asn Val Glu Thr Asp Lys

260 265 270

Leu Lys Ile His Met Asn Asp Ser Lys Ser Ile Asp Asp Val Asp Glu

275 280 285

Leu Ile Trp Thr Ile Gly Arg Lys Ser His Leu Gly Met Gly Ser Glu

290 295 300

Asn Val Gly Ile Lys Leu Asn Ser His Asp Gln Ile Ile Ala Asp Glu

305 310 315 320

Tyr Gln Asn Thr Asn Val Pro Asn Ile Tyr Ser Leu Gly Asp Val Val

325 330 335

Gly Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Ala Ala Gly Arg Lys Leu

340 345 350

Ser Asn Arg Leu Phe Gly Pro Glu Lys Phe Arg Asn Asp Lys Leu Asp

355 360 365

Tyr Glu Asn Val Pro Ser Val Ile Phe Ser His Pro Glu Ala Gly Ser

370 375 380

Ile Gly Ile Ser Glu Lys Glu Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Lys Glu Asn

385 390 395 400

Ile Lys Val Tyr Asn Ser Lys Phe Thr Ala Met Tyr Tyr Ala Met Leu

405 410 415

Ser Glu Lys Ser Pro Thr Arg Tyr Lys Ile Val Cys Ala Gly Pro Asn

420 425 430

Glu Lys Val Val Gly Leu His Ile Val Gly Asp Ser Ser Ala Glu Ile

435 440 445

Leu Gln Gly Phe Gly Val Ala Ile Lys Met Gly Ala Thr Lys Ala Asp

450 455 460

Phe Asp Asn Cys Val Ala Ile His Pro Thr Ser Ala Glu Glu Leu Val

465 470 475 480

Thr Met Arg

<210> 2

<211> 1452

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

atgctttctg caaccaaaca aacatttaga agtctacaga taagaactat gtccacgaac 60

accaagcatt acgattacct cgtcatcggg ggtggctcag ggggtgttgc ttccgcaaga 120

agagctgcat cttatggtgc gaagacatta ctagttgaag ctaaggctct tggtggtacc 180

tgtgttaacg tgggttgtgt tccgaagaaa gtcatgtggt atgcttctga cctcgctact 240

agagtatccc atgcaaatga atatggatta tatcagaatc ttccattaga taaagagcat 300

ttgactttta attggccaga atttaagcag aaaagggatg cttatgtcca taggttgaac 360

ggtatatacc agaagaattt agaaaaagaa aaagtggatg ttgtatttgg atgggctaga 420

ttcaataagg acggtaatgt tgaagttcag aaaagggata atactactga agtttactcc 480

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ttcgaattag gtactgattc tgatgggttc tttagattgg aagaacaacc taagaaagtt 600

gttgttgttg gcgctggtta tattggtatt gagctagcag gtgtgttcca tgggctggga 660

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cagaacacta ttactgacca ttacgtaaag gaaggcatca acgttcataa actatccaaa 780

attgttaagg tggagaaaaa tgtagaaact gacaaactga aaatacatat gaatgactca 840

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atgggttcag aaaatgtagg tataaagctg aactctcatg accaaataat tgctgatgaa 960

tatcagaaca ccaatgttcc aaacatttat tctctaggtg acgttgttgg aaaagttgaa 1020

ttgacacctg tcgctattgc agcgggcaga aagctgtcta atagactgtt tggtccagag 1080

aaattccgta atgacaaact agattacgag aacgtcccca gcgtaatttt ctcacatcct 1140

gaagccggtt ccattggtat ttctgagaag gaagccattg aaaagtacgg taaggagaat 1200

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cccacaagat ataaaattgt ttgtgcggga ccaaatgaaa aggttgtcgg tctgcacatt 1320

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<210> 3

<211> 678

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

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Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn

50 55 60

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Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro

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675

<210> 4

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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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gacaatgacc ctcttttttg gggagacgag cttgagtaca tggttgtaga ttttgatgat 180

aaggagagaa attctatgct cgacgtttgc catgacaaga tactcactga gcttaatatg 240

gaggattcgt ccctttgtga ggctaacgat gtgagttttc accctgagta tggccggtat 300

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aacatgcaaa aaagacgtgc cattgcagaa tataagctat ctgaatatgc gagacaagat 420

agtaaaaata acttgcatgt gggctccagg tctgtccctt tgacgctgac tgtcttcccg 480

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<210> 5

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln

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Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn Gly Leu Ser Met Tyr Pro Pro

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Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile

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Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile

50 55 60

Gln Pro Val Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Arg Ile Thr Gln Asp Met Ala

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Gln Pro Asp Ser Tyr Leu His Lys Thr Thr Glu Ala Leu Ala Leu Ser

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Asp Ser Glu Phe Thr Gly Lys Leu Trp Ser Leu Tyr Leu Ala Thr Leu

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Lys Ser Ala Gln Tyr Lys Lys Gln Asn Phe Arg Leu Gly Ile Phe Arg

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Ser Asp Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Lys Gly Thr Glu Gln Ile Lys Gln

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Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Ala Gly Leu Ser Glu Lys

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Val Asp Arg Leu His Ser Tyr Leu Asn Arg Ala Asn Lys Tyr Asp Pro

165 170 175

Lys Gly Pro Ile Tyr Asn Asp Gln Asn Met Val Ile Ser Asp Ser Gly

180 185 190

Tyr Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Lys Ala Val Glu Ser Tyr Lys Ser

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Gln Gln Ser Ser Ser Thr Thr Ser Asp Pro Ile Val Ala Phe Ile Val

210 215 220

Gln Arg Asn Glu Arg Asn Val Phe Asp Gln Lys Val Leu Glu Leu Asn

225 230 235 240

Leu Leu Glu Lys Phe Gly Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Phe Asp Asp

245 250 255

Val Asn Asp Lys Leu Phe Ile Asp Asp Lys Thr Gly Lys Leu Phe Ile

260 265 270

Arg Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Val Val Tyr Tyr Arg Thr Gly Tyr

275 280 285

Thr Thr Thr Asp Tyr Thr Ser Glu Lys Asp Trp Glu Ala Arg Leu Phe

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Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ile Lys Ala Pro Asp Leu Leu Thr Gln Leu

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Ser Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Leu Leu Thr Asp Glu Gly Val Leu

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Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Glu Lys Lys Ser Ser Leu Leu Lys Thr

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Phe Val Lys Ile Tyr Pro Leu Asp Asp Thr Lys Leu Gly Arg Glu Gly

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Lys Arg Leu Ala Leu Ser Glu Pro Ser Lys Tyr Val Leu Lys Pro Gln

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Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Val Tyr Lys Glu Asn Ile Pro Asn Phe

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Leu Lys Gly Ile Glu Glu Arg His Trp Asp Ala Tyr Ile Leu Met Glu

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Leu Ile Glu Pro Glu Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ile Leu Arg Asp Asn

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Lys Ser Tyr Asn Glu Pro Ile Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Cys

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Val Leu Phe Asn Asp Glu Gln Val Leu Ser Asn Glu Phe Ser Gly Ser

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Leu Leu Arg Ser Lys Phe Asn Thr Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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aattttaggc taggtatatt tagatcagat tatttgattg ataagaaaaa gggtactgaa 420

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tataatgatc aaaatatggt catttctgat tcaggatacc ttttgtctaa ggcattggcc 600

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ttgttcattg atgataaaac gggaaagctt ttcattaggg acacagagca ggaaatagcg 840

gtggtttatt acagaacggg ttacacaacc actgattaca cgtccgaaaa ggactgggag 900

gcaagactat tcctcgaaaa aagtttcgca ataaaggccc cagatttact cactcaatta 960

tctggctcca agaaaattca gcaattgttg acagatgagg gcgtattagg taaatacatc 1020

tccgatgctg agaaaaagag tagtttgtta aaaacttttg tcaaaatata tcccttggat 1080

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<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

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Met Ala Gly Asn Leu Val Ser Trp Ala Cys Lys Leu Cys Arg Ser Pro

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Glu Gly Phe Gly Pro Ile Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Thr Gln Cys Phe

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Gly Ile Arg Asp Leu Val Asn Leu Cys Lys Lys Lys His Ser Gly Ile

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Lys Tyr Arg Arg Asn Trp Ile Ile Val Ser Arg Met Ala Leu Val Leu

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Leu Glu Ile Ala Phe Val Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ile Ser Lys Glu

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Glu Ala Glu Asn Phe Thr Ile Val Ser Gln Tyr Ala Ser Thr Met Leu

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Val Val Ala Asn Thr Val Leu Leu Phe Tyr Trp Leu Phe Glu Thr Phe

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Gly Ile Trp Tyr Ser Gly Gln Thr Gly Phe Ile Leu Thr Leu Phe Gln

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Val Ile Thr Cys Ala Ser Ile Leu Leu Leu Glu Ala Leu Pro Lys Lys

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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 8

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catcaaactt taacaagaag aaaaccaaat ccatacgata gcgcaaacat attttccagg 660

attaccttct cttggatgtc aggtttgatg aaaactggct atgaaaaata cttagtggaa 720

gcagatttat ataaattacc gaggaacttt agtagtgaag aactctctca aaaattggag 780

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gatgctttat taggaagaac attttctcag tttttcgtca atgcagtgaa agtcacattc 3240

actattacgg ttatctgtgc gacgacatgg caatttatct tcattatcat tccactaagt 3300

gtgttttaca tctactacca gcagtattac ctgagaacat caagggagtt gcgtcgttta 3360

gactctatta ctaggtctcc aatctactct catttccaag agactttggg tggccttgca 3420

acggttagag gttattctca acagaaaagg ttttcccaca ttaatcaatg ccgcattgat 3480

aataacatga gtgcgttcta tccctctatc aatgctaacc gttggctagc atataggttg 3540

gaacttattg gttcaattat cattctaggt gctgcaactt tatccgtttt tagactaaaa 3600

caaggcacat taacggcagg tatggtgggt ttatcattaa gctatgcttt acaaatcact 3660

caaacgttaa attggattgt tagaatgact gtggaagttg aaacgaatat tgtttcagtg 3720

gaaagaataa aggaatatgc tgatttgaag agcgaggcac ctttaatagt tgaaggccac 3780

agaccaccca aagaatggcc gagccagggt gatataaagt ttaataatta ttccactcgt 3840

tataggccgg agcttgatct tgttctgaag cacattaata tacacattaa accaaatgaa 3900

aaagttggta tcgtgggtag aacgggtgcg ggaaaatcct cattaacgct agcattattc 3960

aggatgattg aggctagcga gggaaacatc gtaatcgaca acattgccat caacgagatt 4020

gggttatatg atttgagaca taaattgtca atcatacctc aggattctca agtttttgag 4080

ggcactgttc gtgagaacat tgatcccatt aaccaataca ctgatgaagc tatttggagg 4140

gcattggaac tttctcattt gaaagaacac gtgctatcaa tgagcaatga cggattagat 4200

gcccaactaa ccgaaggtgg tggcaactta agtgttggac aaagacaatt attatgtctt 4260

gcaagagcaa tgttggttcc atcaaagatt ttggtgcttg atgaagccac ggccgcagtc 4320

gacgtggaga cagataaagt cgtccaagag acgattcgta ctgctttcaa ggacagaact 4380

atcttgacca tcgcgcatag actgaacacg ataatggaca gtgatagaat catagtgttg 4440

gacaatggta aagtagccga gtttgactct ccgggccagt tattaagtga taacaaatca 4500

ttgttctatt cactgtgcat ggaggctggt ttggtcaatg aaaattaa 4548

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GLR1 gRNA

<400> 9

gattacctcg tcatcggggg 20

<210> 10

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GLR1 rescue DNA

<400> 10

acacttctgg tttttctcat gcgcttctca ctctcagtat attttgctgc tttccttcat 60

atgtatatat atctatttac atattagttt acagaacttt agcaacgaaa ctagacgtcc 120

aatctgctgt tgctatactg gacttttgta ctcttgtaaa caatcttata tagcatcctg 180

aaatacgtag taattttgtc 200

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 11

aaaaggatcc atggctggta atcttgtttc atgggcc 37

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR反向引物

<400> 12

aaaactcgag ttaattttca ttgaccaaac cagcctcc 38

PCT/RO/134表

Claims

1.一种谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：

在碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上的培养基中对酵母进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母含有还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，并且，将还原型谷胱甘肽重量设为100时，氧化型谷胱甘肽重量为20以上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比谷胱甘肽还原酶活性降低了的酵母。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述酵母缺损了编码谷胱甘肽还原酶的基因。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述谷胱甘肽还原酶选自下述(1a)～(1e)：

(1a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(1b)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质；

(1c)由与序列号1所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质；

(1d)由与具有和序列号2互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽还原酶活性的蛋白质；以及

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和/或谷胱甘肽合成酶的活性增强了的酵母。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述酵母是通过包含编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的碱基序列的DNA、和/或包含编码谷胱甘肽合成酶的碱基序列的DNA进行转化而得到的酵母。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶选自下述(2a)～(2e)：

(2a)由序列号3所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(2b)由序列号3所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质；

(2c)由与序列号3所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质；

(2d)由与具有和序列号4互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的蛋白质；以及

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述谷胱甘肽合成酶选自下述(3a)～(3e)：

(3a)由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(3b)由序列号5所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质；

(3c)由与序列号5所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质；

(3d)由与具有和序列号6互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白质；以及

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述酵母为与亲株相比谷胱甘肽转运酶活性增强了的酵母。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述酵母是通过包含编码谷胱甘肽转运酶的碱基序列的DNA进行转化而得到的酵母。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述谷胱甘肽转运酶选自下述(4a)～(4e)：

(4a)由序列号7所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(4b)由序列号7所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质；

(4c)由与序列号7所示的氨基酸序列具有60％以上序列同一性的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质；

(4d)由与具有和序列号8互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列构成、且具有谷胱甘肽转运酶活性的蛋白质；以及

13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述酵母为酵母属、念珠菌属、或毕赤酵母属的酵母。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，所述酵母为碱性氨基酸非营养缺陷型的酵母。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含糖蜜作为碳源。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，在培养开始时，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上。

17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为2g/L以上。

18.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的碱性氨基酸浓度为4g/L以上。

19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，所述碱性氨基酸为赖氨酸。

20.一种促进基于酵母的谷胱甘肽的生产的方法，该方法包括：

在碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上的培养基中对酵母进行培养。

21.一种基于酵母的谷胱甘肽的生产的促进剂，其包含碱性氨基酸。

22.一种酵母用培养基组合物，其中，碱性氨基酸浓度为0.8g/L以上，且包含糖蜜作为碳源。