JP3961289B2 - 環状デプシペプチド合成酵素およびその遺伝子並びに環状デプシペプチドの大量生産系 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、環状デプシペプチド合成酵素およびその遺伝子並びに環状デプシペプチドの大量生産系に関し、更に詳細には、駆虫活性を有するＰＦ１０２２物質の合成酵素およびその遺伝子並びにＰＦ１０２２物質の大量生産系に関する。
関連技術の説明
ＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］は、アゴノマイセタレス（Ａｇｏｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する糸状菌、ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）により生産される環状デプシペプチドであり、動物寄生性の線虫類に対して極めて高い駆虫活性を示す（特開平３−３５７９６号、Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．，４５，６９２，（１９９２））。そのため、本物質は動物用の駆虫薬として有用であると共に、さらに高活性な本物質の誘導体を合成するための原料として有用である。
一般に、天然から分離された微生物の生産する二次代謝産物の量は、微量である。そのため、これを産業的に利用するためには、二次代謝産物の生産量を向上させる必要がある。生産量を向上させるためには、培養方法の検討、培地成分の検討、および前駆体の添加といった発酵条件の改良、並びに紫外線照射または突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われる。最近では、これらの方法に加えて遺伝子組換えの手法を利用した生産性の向上も行われるようになってきた。
その方法としては、生合成経路の酵素遺伝子の発現増強、生合成の制御遺伝子の発現増強、不必要な生合成経路の遮断、等が行われている（Ｋｈｅｔａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｈｕ，Ｗ．−Ｓ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．７１７，（１９９９））。また、特殊な例としては、酸素利用能の向上を目的として、細菌のヘモグロビン遺伝子を発現させ、生産性を向上させる方法も知られている（Ｍｉｎａｓ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１４，５６１，（１９９８））。
遺伝子組換えの手法を用いて生産性の向上を図る際に、最も一般的な手法は、生合成経路の酵素遺伝子の発現増強である。この手法を適応するためには、対象とする微生物において形質転換の方法が確立していること、発現増強のために利用可能なプロモーターおよびターミネーターが存在すること、また生合成経路が明らかとなっており、それらの遺伝子が単離されていることが必要である。ＰＦ１０２２物質生産菌においては、形質転換により外来遺伝子を導入することに成功している（ＷＯ９７／００９４４号）が、生合成経路の遺伝子は単離されていない。
ＰＦ１０２２物質は、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン、Ｄ−乳酸、およびＤ−フェニル乳酸がエステル結合およびアミド結合を介して結合した構造からなり、生産菌中では４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、２分子のＤ−フェニル乳酸から、ある種のペプチド合成酵素により合成されると考えられる。ペプチド合成酵素とは、アミノ酸やヒドロキシ酸を基質として、ペプチド、デプシペプチド、リポペプチド、ペプチドラクトン等の微生物の二次代謝産物の生合成を行う酵素であり、既に幾つかのペプチド合成酵素の配列が明らかとなっている（Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７，２６５１，（１９９７））。この酵素による反応は、ｍＲＮＡを鋳型としたリボソームによるタンパク質の合成系とは全く異なっている。ペプチド合成酵素は、各基質に対して１つのドメインを持ち、各基質はこのドメインでＡＴＰにより活性化され、ドメイン中のホスホパントテン酸を介して結合し、これらが各ドメイン間の領域の触媒作用によりアミド結合やエステル結合を形成すると考えられている。
発明の概要
本発明は環状デプシペプチド、特にＰＦ１０２２物質、を合成する酵素（以下「環状デプシペプチド合成酵素」とする）を提供することをその目的とする。
本発明はまた、環状デプシペプチド合成酵素をコードする遣伝子（以下「環状デプシペプチド合成酵素遺伝子」とする）を提供することをその目的とする。
本発明は更にまた、環状デプシペプチド合成酵素を発現させるための組換えベクターおよび形質転換体、並びに環状デプシペプチドの大量生産系およびその製造法の提供をその目的とする。
本発明は、環状デプシペプチド合成酵素の製造法の提供をその目的とする。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素は、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子は、環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子はまた、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明による組換えベクターは、本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を含んでなるものである。
本発明による形質転換体および環状デプシペプチドの大量生産系は、本発明による組換えベクターを含んでなる宿主である。
本発明による環状デプシペプチドの製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から環状デプシペプチドを採取することを含んでなるものである。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素の製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から環状デプシペプチド合成酵素を採取することを含んでなるものである。
本発明によれば、環状デプシペプチド合成酵素をＰＦ１０２２物質生産菌において過剰発現させることができ、またＰＦ１０２２物質を大量に生産させることができる。
発明の具体的説明
微生物の寄託
実施例１ １．に記載されるＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１である。
実施例２ １．（１）に記載されるプラスミドｐＰＦｓｙｎで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、１９９９年９月１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２５３である。
実施例２ １．（１）に記載されるプラスミドｐＰＦｓｙｎＮで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、１９９９年９月１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２５４である。
遺伝子およびタンパク質
本発明によれば環状デプシペプチド合成酵素、好ましくはＰＦ１０２２物質合成酵素、およびその遺伝子が提供される。
本発明による酵素は、４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、および２分子のＤ−フェニル乳酸に作用して、ＰＦ１０２２物質を合成できる。Ｄ−乳酸、Ｌ−ロイシン、およびＤ−フェニル乳酸をあらかじめ修飾しておくことによりＰＦ１０２２物質の誘導体を製造できる。
ＰＦ１０２２物質の誘導体としては、例えば、ＰＦ１０２２物質中の二つのフェニル基のパラ位がアミノ基により置換されたものが挙げられる。この場合、ｐＦ１０２２物質の誘導体の合成基質としては、例えば、Ｄ−フェニル乳酸の代わりにＤ−ｐ−アミノフェニル乳酸を使用できる。
配列（ｂ）において、改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。
配列（ｅ）において、改変の数は、例えば１〜数十個であることができる。
配列（ｂ）および配列（ｅ）において変異が複数個存在する場合、導入された変異の種類は同一でも異なっていてもよい。
配列（ｄ）において、配列番号１のＤＮＡ配列との同一性は、好ましくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも９０％、最も好ましくは少くとも９５％であることができる。
配列（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
配列（ｂ）に関して、「環状デプシペプチド合成酵素活性を有する」か否かは、例えば、環状デプシペプチドの基質を準備し、被験タンパク質を作用させ、環状デプシペプチドの生成を例えばクロマトグラフィーによって確認することにより評価することができる。
配列（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）に関して、「環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする」か否かは、例えば、実施例２に記載のように被験ヌクレオチド配列を宿主にて発現させ、得られたタンパク質を環状デプシペプチドの基質と作用させ、環状デプシペプチドの生成を例えばクロマトグラフィーによって確認することにより評価することができる。
本発明による合成酵素のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、本発明による合成酵素をコードするヌクレオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
本発明による遺伝子は例えば下記のようにして得ることができる。
ＰＦ１０２２物質生産菌からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。ペプチド合成酵素のアミノ酸配列の保存領域、あるいはＰＦ１０２２物質生産菌から精製した環状ペプチド合成酵素の部分アミノ酸配列を元に、適当なプライマーを合成し、それを用いてＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を実施し、環状ペプチド合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。このようにして、環状ペプチド合成酵素遺伝子の全域を単離することができる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、翻訳開始コドンの上流および翻訳終始コドンの下流に、ＰＣＲ等の手法により適当な制限酵素切断部位を導入し、環状ペプチド合成酵素遺伝子のみを含む遺伝子断片を得ることができる。
組換えベクター
本発明によれば環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明による組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明において使用できるベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられ、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
本発明による組換えベクターは、例えば、環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列を作動可能に連結することにより作製できる。
本発明による遺伝子へのプロモーターおよびターミネーターの連結、および発現ユニットのベクターへの挿入は、公知の方法に従って行うことができる。
本発明に用いるプロモーターおよびターミネーターは特に限定されず、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子の制御配列、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子の制御配列、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子の制御配列、ナイトレートレダクターゼ、オロチジン−５’−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素遺伝子の制御配列、およびＡｂｐ１等のＰＦ１０２２物質生産菌中で高発現するＰＦ１０２２物質生産菌由来の遺伝子の制御配列が挙げられる。
本発明による遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させてもよい。
遺伝子マーカーの導入は、例えば、制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結する事により行うことができる。
遺伝子マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
形質転換体および環状デプシペプチドの製造
本発明によれば前記ベクターにより形質転換された宿主が提供される。
本発明において使用できる宿主としては、遺伝子組換えの宿主として使用可能な微生物であれば特に限定されるものではない。使用できる宿主の例としては、任意の細菌類または真菌類の微生物が挙げられ、好ましくは大腸菌、バチルス属細菌、放線菌、酵母、糸状菌、より好ましくは、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ＰＦ１０２２物質生産菌を宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、環状デプシペプチドの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近で生育する。環状デプシペプチド合成酵素および環状デプシペプチドの生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日〜２５日間でその蓄積が最高に達する。
培養中の環状デプシペプチド合成酵素、あるいは環状デプシペプチドの量が最高になった時に培養を停止し、培養物から環状デプシペプチド合成酵素あるいは環状デプシペプチドを単離、精製する。
培養物から環状デプシペプチド合成酵素あるいは環状デプシペプチドを採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、または適宜組み合わせて抽出精製することができる。
環状デプシペプチド合成酵素は、例えば、ブチルアガロース等を使用した疎水性クロマトグラフィーにより効率よく精製できる。
環状デプシペプチドは、例えば、培養物中からはアセトン、メタノール、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル等で抽出できる。環状デプシペプチドをさらに精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社）またはトヨパールＨＷ−４０（東ソー社）等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。以上のような方法により、またはこれらを適宜組み合わせることにより、純粋な環状デプシペプチドが得られる。
本発明によれば、環状デプシペプチドの大量生産系が提供される。環状デプシペプチドの生産系、特にＰＦ１０２２物質の生産系として使用できる宿主としては、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌が好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。形質転換に用いられる組換えベクターとしては、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターが好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）において機能する制御配列を環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターである。環状デプシペプチド、特にＰＦ１０２２物質は、好ましくは、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列が環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結された発現ベクターによって形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌を培養し、培養物から環状デプシペプチドを単離することにより製造できる。
ＰＦ１０２２物質の基質であるＬ−ロイシン、Ｄ−乳酸、またはＤ−フェニル乳酸を合成しない宿主においては、不足する基質または基質の誘導体を添加して培養することにより、ＰＦ１０２２物質またはＰＦ１０２２物質の誘導体を生産させることが可能である。
実 施 例
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ＰＦ１０２２物質生産菌からの環状デプシペプチド合成酵素遺伝子のクローニング
１．ゲノムＤＮＡの単離とゲノムライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡは、ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対してＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株から抽出した。ＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を５０ｍｌの種培地［１％イーストエキス、１％マルトエキス、２％ポリペプトン、２．５％グルコース、０．１％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］で２６℃にて２日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）により、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ Ｉにより部分分解した後、アガロースゲル電気泳動により１５ｋｂ〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これをアルカリフォスファターゼで処理し、ＤＮＡ断片の末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片をファージベクターのＬａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして得られた組換えファージベクターについて、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社）により、添付のプロトコールに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。
２．環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の単離
既知のペプチド合成酵素のマルチプルアライメントを行い、良好に保存された領域として、ＷＴＳＭＹＤＧ（配列番号３）とＶＶＱＹＦＰＴ（配列番号４）を見出した。これらの配列を元に、５′−ＴＧＧＡＣＩＷＳＮＡＴＧＴＡＹＧＡＹＧＧ−３′（配列番号５）および５′−ＧＴＩＧＧＲＡＡＲＴＡＹＴＧＩＡＣＮＡＣ−３′（配列番号６）のプライマーを合成した。これらのプライマーを用い、ＰＦ１０２２物質生産菌から単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、および１０μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃３分間、［９４℃１分間、６５℃（１サイクル毎に０．５℃下げる）１分間、７２℃１分間］×３０回、７２℃３分間。この反応により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅し、このＤＮＡ断片をＯｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１プラスミドベクターに挿入した。
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステムズ社）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、添付のプロトコールに従い行った。その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、ペプチド合成酵素遺伝子と相同性を示し、目的とする環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の一部であることが明らかとなった。
３．環状デプシペプチド合成酵素遺伝子全域のクローニング
ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプローブは、ＰＣＲにより、フルオレセイン標識ｄＵＴＰをＤＮＡ断片に取り込ませることにより調製した。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１００ｎｇの環状デプシペプチド合成酵素遺伝子ＤＮＡ断片が挿入されたｐＣＲ２．１プラスミドベクターを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）および添付のバッファー、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１８ｍＭフルオレセイン標識ｄＵＴＰ（ＦｌｕｏｒｏＧｒｅｅｎ、アマシャム ファルマシア バイオテク社）および１０μＭのプライマー（配列番号５および配列番号６）を用い、以下の条件で反応を行った。９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５５℃１分間、７２℃１分間）×２５回、７２℃３分間。この反応により、約３５０ｂｐのフルオレセイン標識プローブが作製された。
実施例１の１において作製したプラークの形成されたプレート上に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を載せ、プラークを付着させた。このメンブレンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージＤＮＡが吸着したメンブレンを、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔａｂｌｅｔｓ（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用いて調製したバッファーに入れた後、６０℃で１時間インキュベートした。これに、上記のフルオレセインでラベルされたプローブを熱変性して添加し、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、メンブレンを１×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）−０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄し、さらに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄した。フルオレセインが結合したプラークの可視化は、ＤＩＧ洗浄ブロックバッファーセット（ベーリンガー・マンハイム社）、アルカリフォスファターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体（Ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ，Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ベーリンガー・マンハイム社）、発色基質としてニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ベーリンガー・マンハイム社）およびＸ−フォスフェート（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。このようにしてプローブに相同な領域の５′上流域および３′下流域を含む陽性クローンを選抜した。
４．塩基配列の決定
このようにして単離された陽性クローン中のＤＮＡ断片を、ファージベクターの配列である５′−ＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡ−３′（配列番号７）および５′−ＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡ−３′（配列番号８）をプライマーとして用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、陽性クローンＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、および０．２μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃１分間、（９８℃１０秒間、６８℃１５分間）×２５回、７２℃１５分間。得られたＰＣＲ産物を精製した後、ネブライザー処理し、ランダムに０．５ｋｂ〜２．０ｋｂに分解した。この断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社）のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。このようにして得られた１６８個のコロニーをＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｈ４（宝酒造社）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社）を用いて直接ＰＣＲし、これを精製した後、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造社）をプライマーとしてシークエンスを行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、および０．５μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃４分間、（９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間）×３０回、７２℃３分間。また、シークエンスは、ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステムズ社）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、添付のプロトコールに従い行った。
得られた結果から、解析が不十分な領域については、プライマーを解析済みの塩基配列を元に新たに設計してＰＣＲにより増幅し、これを精製した後、ＰＣＲに用いたプライマーを用いてシークエンスを行った。これにより、陽性クローン中のＤＮＡ断片１５６０６ｂｐの塩基配列を決定した。
この配列を解析したところ９６３３ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この配列から予測されるタンパク質は、３２１０アミノ酸残基、３５４ｋＤａであり、ペプチド合成酵素と相同性を示すことが明らかとなった。また、最も高い相同性を示したタンパク質はエニアチン合成酵素（Ｓ３９８４２）であり、その相同性は５６％であった。このように単離した本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示した。
実施例２：環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の過剰発現によるＰＦ１０２２生産性の向上
１．遺伝子発現用の組換えベクターの構築（図１）
（１）環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域のクローニング
実施例１の３で得られた陽性クローンから、挿入されたＤＮＡ断片をＮｏｔＩにより切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社）のＮｏｔＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＦ７を作製した。ｐＰＦ７をＢａｎＩＩＩおよびＳｍａＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動し、約８２５０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋に挿入し、プラスミドｐＰＦ７−１を作製した。
ｐＰＦ７を鋳型とし、Ｎ末端付近からＢａｎＩＩＩ部位までの約４４０ｂｐ（配列番号９および配列番号１０を使用）または約４７０ｂｐ（配列番号１１および配列番号１０を使用）を増幅するためのプライマーとして、５′−ＡＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡ−３′（配列番号９、ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始するように設計）または５′−ＡＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡ−３′（配列番号１１、ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始するように設計）、および５′−ＴＴＴＧＣＴＴＣＧＴＡＣＴＣＧＧＧＴＣＣＴ−３′（配列番号１０）を用い、また、ＳｍａＩ部位からＣ末端までの約９２０ｂｐを増幅するためのプライマーとして、５′−ＧＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＡＡＧ−３′（配列番号１２）および５′−ＡＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴ−３′（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行った。この際、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の５′側および３′側に、ＢａｍＨＩ部位を導入するようにプライマーの設計を行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．５μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９８℃３０秒間、（９８℃１５秒間、６５℃２秒間、７４℃３０秒間）×１０回、７４℃１分間。各プライマーを用いて得られたＰＣＲ反応液をエタノール沈殿し、ＰＣＲ産物を回収した。Ｎ末端領域に関しては、ＢａｍＨＩおよびＢａｎＩＩＩにより、また、Ｃ末端領域に関しては、ＳｍａＩよびＢａｍＨＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。
ｐＰＦ７−１のＳａｍＩ、ＢａｍＨＩ部位に、上記のＣ末端領域ＰＣＲ断片を挿入し、プラスミドｐＰＦ７−２を作製した。このプラスミドをＢａｎＩＩＩおよＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動し、約９１７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。このＤＮＡ断片並びに配列番号９および配列番号１０を用いて作製したＮ末端領域を、同時に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を再構築し、プラスミドｐＰＦｓｙｎ（ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。
一方、ｐＰＦ７−２から切り出した約９１７０ｂｐのＤＮＡ断片並びに配列番号９および配列番号１１を用いて作製したＮ末端領域を、同時に、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を再構築し、プラスミドｐＰＦｓｙｎＮ（ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。このようにして両末端にＢａｍＨＩ部位を持つ環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を作製した。
ｐＰＦｓｙｎまたはｐＰＦｓｙｎＮをＢａｍＨＩで切断した後、環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域をそれぞれゲルから回収した。
（２）Ａｂｐ１遺伝子の発現制御領域を用いた発現ベクターの構築
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡの単離
ＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡの単離は（Ｈ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２７２−２７８，（１９８８））に記載の方法に従った。具体的には、まずＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）を種培地（可溶性澱粉 ２．０％、グルコース １．０％、ポリペプトン ０．５％、小麦胚芽 ０．６％、酵母エキス ０．３％、大豆粕 ０．２％および炭酸カルシウム ０．２％；殺菌前がｐＨ７．０；ＷＯ９７／００９４４号 実施例１参照）で２日間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。次いで、得られた菌体を凍結乾燥後、ＴＥに懸濁し、３％ＳＤＳ溶液中、６０℃、３０分間処理後、ＴＥ飽和フェノール抽出により、菌体残渣を除去した。抽出液はエタノール沈澱化後、リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）およびプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）処理し、さらに１２％ポリエチレングリコール６０００により核酸を沈殿化させた。これをＴＥ飽和フェノール抽出、エタノール沈殿化を行い、同沈殿をＴＥに溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムライブラリーの作製
上記のように調製したＰＦ１０２２物質生産菌由来ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクター、λＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームにＴ４リガーゼ（宝酒造社製ライゲーションキットＶｅｒ．２）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥに溶解した。連結混合物の全量をギガパックＩＩＩプラスパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、ファージプラークを形成させた。この方法により得られた１．３×１０４個（２．６×１０４ＰＦＵ／ｍｌ）のファージライブラリーを用いてＡｂｐ１遺伝子のクローニングを行った。
ＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡからのＡｂｐ１遺伝子クローニング
プローブはＡｂｐ１遺伝子の翻訳領域をＰＣＲ法により増幅し、用いた。前記のようにＰＦ１０２２物質生産菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、８−７３Ｕおよび８−７３Ｒなる合成プライマーを用いて、レッツゴーＰＣＲキット（サワディーテクノロジー社製）に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下に８−７３Ｕおよび８−７３ＲのＤＮＡ配列を示す。
このようにして得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、標識化した。前記のように作成したファージプラークを、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写し、アルカリ変成後、５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットに記載の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、１６時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は前述キットに記載の方法に従った。プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、メディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、１個の陽性クローンを得た。本クローンはサザン解析の結果、少なくとも６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片がゲノムＤＮＡの制限酵素断片長と一致していた。このＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を図２に示す。ＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐＵＣ１１９にサブクローニングし（ｐＲＱＨｉｎ／１１９）、以降の実験に供した。
発現ベクターの構築
ｐＲＱＨｉｎ／１１９を鋳型にＡｂｐ１遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。プロモーターの増幅はＡＢＰ−ＮｅｃｏおよびＡＢＰ−Ｎｂａｍ、一方、ターミネーターの増幅はＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−Ｃｘｂａなるプライマーを用い、ＰＣＲスーパーミックスハイフィデリティ（ライフテックオリエンタル社製）によりＰＣＲ法を行った。反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下にＡＢＰ−Ｎｅｃｏ、ＡＢＰ−Ｎｂａｍ、ＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−ＣｘｂａのＤＮＡ配列を示す。
各ＰＣＲ産物はマイクロスピンＳ−４００カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製し、エタノール沈殿化の後、プロモーターはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ターミネーターはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋に順次連結した。これをＸｂａＩで消化し、ｐＭＫＤ０１（ＷＯ９８／０３６６７号）由来デストマイシン耐性カセットを挿入しｐＡＢＰｄを構築した（図３）。ｐＡＢＰｄはＡｂｐ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを有する。
前記のようにゲルから回収した環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域をｐＡＢＰｄのＢａｍＨＩ部位に挿入し、環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を発現させるための発現ベクターであるｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎ（ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始）およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮ（ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。
２．ＰＦ１０２２物質生産菌への環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の導入と発現
ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）への発現ベクターの導入は、ＷＯ９７／００９４４号に記載された実施例１の方法に従って行い、ハイグロマイシンＢに対する耐性度の高い株を選抜した。これらの株における目的遺伝子の導入の確認は、Ａｂｐ１プロモーターの配列から作製したプライマー、５′−ＴＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＣＴ−３′（配列番号２０）および環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の配列から作製したプライマー、５′−ＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣＴ−３′（配列番号２１）を用いたＰＣＲにより行った。このようにしてハイグロマイシンＢに対する耐性度が高く本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子が導入された遺伝子導入株を選抜した。
５０ｍｌの種培地にて遺伝子導入株および親株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）をそれぞれ別々に２６℃で２日間培養した後、それぞれの培養液１ｍｌを５０ｍｌの別々の生産培地［６％水飴、２．６％澱粉、２％小麦胚芽、１％ファーマメディア、０．２％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％炭酸カルシウム、０．３％塩化ナトリウム（ｐＨ ７．５）］に接種し、２６℃で４日間培養した。培養液を４５００ｒｐｍで５分間遠心することにより集菌し、得られたそれぞれの菌体を０．３Ｍ塩化カリウムで洗浄した。それぞれの菌体を液体窒素により凍結した後、凍結乾燥を行った。
以下に示す抽出操作は、氷上、または４℃の低温室にて実施した。凍結乾燥した菌体１０ｍｇおよび１．０ｍｌのガラスビーズ（径０．５ｍｍ）を入れた２ｍｌのマイクロチューブに、１．０ｍｌの抽出バッファー［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ塩化カリウム、６０％グリセロール、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール、１０μＭロイペプチン、１ｍＭフェニルメタンスルホン酸、６０μｇ／ｍｌキモスタチン］を添加した。このマイクロチューブをＭｉｎｉ−Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ−８（バイオスペック社）にセットし、最高速度で３分間運転することにより抽出を行った。これを１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、１００μｌの上清を１００μｌの１０％トリクロロ酢酸溶液中に入れ、混合した。１５分間放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた沈殿を、１５μｌのアルカリ溶液（２％炭酸ナトリウム、０．４％水酸化ナトリウム）に溶解し、６０μｌのサンプルバッファー［１２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｌブロムフェノールブルー］を添加した。これを沸騰水中で５分間加熱した後、電気泳動システム（テフコ社）により、４％〜２０％のポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動［Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）］を行った。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルは、クイック−ＣＢＢ（和光純薬社）を用い、添付のプロトコールに従い染色した。親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を図４に示した。また、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を図５に示した。
このように、遺伝子導入株の環状デプシペプチド合成酵素の発現量は、親株に比べ顕著に高かった。
３．ＰＦ１０２２物質の抽出と定量
５０ｍｌの種培地にて遺伝子導入株および親株をそれぞれ別々に２６℃で２日間培養した後、それぞれの培養液１ｍｌを５０ｍｌの別々の生産培地に接種し、２６℃で６日間培養した。それぞれの培養液から１０ｍｌ分を採取し３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、別々に集菌した。それぞれの菌体に１０ｍｌのメタノールを加えて激しく振とうし、３０分間静置した。その後、再度振とうし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清中のそれぞれの菌体から抽出したＰＦ１０２２物質を液体クロマトグラフィーにより各々定量した。カラムとしては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ−１８（ｅ）（関東化学社）を用い、カラム温度は４０℃、移動相は８０％アセトニトリル、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとして、２１０ｎｍの吸収によりＰＦ１０２２物質を検出した。この条件におけるＰＦ１０２２物質の保持時間は５分間〜６分間であった。実験は２反復で行い、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したＰＦ１０２２物質の定量結果の平均値を表１に示した。
遺伝子導入株は親株の約２．５倍のＰＦ１０２２物質の生産性を示した。本発明の環状デプシペプチド合成酵素を過剰発現させることにより、ＰＦ１０２２物質の生産性が高まることが明らかとなった。
また、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したＰＦ１０２２物質の定量結果の平均値を表２に示した。
遺伝子導入株は親株の４．３〜６．０倍のＰＦ１０２２物質の生産性を示した。本発明の環状デプシペプチド合成酵素を過剰発現させることにより、ＰＦ１０２２物質の生産性が高まることが明らかとなった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎの作製方法を示す。
図２はＡｂｐ１遺伝子を含む６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を示す。
図３はｐＡＢＰｄの構成および制限酵素地図を示す。
図４は親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を示す。
図５は親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を示す。
発明の分野
本発明は、環状デプシペプチド合成酵素およびその遺伝子並びに環状デプシペプチドの大量生産系に関し、更に詳細には、駆虫活性を有するＰＦ１０２２物質の合成酵素およびその遺伝子並びにＰＦ１０２２物質の大量生産系に関する。
関連技術の説明
ＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］は、アゴノマイセタレス（Ａｇｏｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する糸状菌、ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）により生産される環状デプシペプチドであり、動物寄生性の線虫類に対して極めて高い駆虫活性を示す（特開平３−３５７９６号、Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．，４５，６９２，（１９９２））。そのため、本物質は動物用の駆虫薬として有用であると共に、さらに高活性な本物質の誘導体を合成するための原料として有用である。
一般に、天然から分離された微生物の生産する二次代謝産物の量は、微量である。そのため、これを産業的に利用するためには、二次代謝産物の生産量を向上させる必要がある。生産量を向上させるためには、培養方法の検討、培地成分の検討、および前駆体の添加といった発酵条件の改良、並びに紫外線照射または突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われる。最近では、これらの方法に加えて遺伝子組換えの手法を利用した生産性の向上も行われるようになってきた。
その方法としては、生合成経路の酵素遺伝子の発現増強、生合成の制御遺伝子の発現増強、不必要な生合成経路の遮断、等が行われている（Ｋｈｅｔａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｈｕ，Ｗ．−Ｓ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．７１７，（１９９９））。また、特殊な例としては、酸素利用能の向上を目的として、細菌のヘモグロビン遺伝子を発現させ、生産性を向上させる方法も知られている（Ｍｉｎａｓ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１４，５６１，（１９９８））。
遺伝子組換えの手法を用いて生産性の向上を図る際に、最も一般的な手法は、生合成経路の酵素遺伝子の発現増強である。この手法を適応するためには、対象とする微生物において形質転換の方法が確立していること、発現増強のために利用可能なプロモーターおよびターミネーターが存在すること、また生合成経路が明らかとなっており、それらの遺伝子が単離されていることが必要である。ＰＦ１０２２物質生産菌においては、形質転換により外来遺伝子を導入することに成功している（ＷＯ９７／００９４４号）が、生合成経路の遺伝子は単離されていない。
ＰＦ１０２２物質は、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン、Ｄ−乳酸、およびＤ−フェニル乳酸がエステル結合およびアミド結合を介して結合した構造からなり、生産菌中では４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、２分子のＤ−フェニル乳酸から、ある種のペプチド合成酵素により合成されると考えられる。ペプチド合成酵素とは、アミノ酸やヒドロキシ酸を基質として、ペプチド、デプシペプチド、リポペプチド、ペプチドラクトン等の微生物の二次代謝産物の生合成を行う酵素であり、既に幾つかのペプチド合成酵素の配列が明らかとなっている（Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７，２６５１，（１９９７））。この酵素による反応は、ｍＲＮＡを鋳型としたリボソームによるタンパク質の合成系とは全く異なっている。ペプチド合成酵素は、各基質に対して１つのドメインを持ち、各基質はこのドメインでＡＴＰにより活性化され、ドメイン中のホスホパントテン酸を介して結合し、これらが各ドメイン間の領域の触媒作用によりアミド結合やエステル結合を形成すると考えられている。
発明の概要
本発明は環状デプシペプチド、特にＰＦ１０２２物質、を合成する酵素（以下「環状デプシペプチド合成酵素」とする）を提供することをその目的とする。
本発明はまた、環状デプシペプチド合成酵素をコードする遣伝子（以下「環状デプシペプチド合成酵素遺伝子」とする）を提供することをその目的とする。
本発明は更にまた、環状デプシペプチド合成酵素を発現させるための組換えベクターおよび形質転換体、並びに環状デプシペプチドの大量生産系およびその製造法の提供をその目的とする。
本発明は、環状デプシペプチド合成酵素の製造法の提供をその目的とする。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素は、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子は、環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子はまた、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつ環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
本発明による組換えベクターは、本発明による環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を含んでなるものである。
本発明による形質転換体および環状デプシペプチドの大量生産系は、本発明による組換えベクターを含んでなる宿主である。
本発明による環状デプシペプチドの製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から環状デプシペプチドを採取することを含んでなるものである。
本発明による環状デプシペプチド合成酵素の製造法は、本発明による形質転換体を培養し、培養物から環状デプシペプチド合成酵素を採取することを含んでなるものである。
本発明によれば、環状デプシペプチド合成酵素をＰＦ１０２２物質生産菌において過剰発現させることができ、またＰＦ１０２２物質を大量に生産させることができる。
発明の具体的説明
微生物の寄託
実施例１ １．に記載されるＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１である。
実施例２ １．（１）に記載されるプラスミドｐＰＦｓｙｎで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、１９９９年９月１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２５３である。
実施例２ １．（１）に記載されるプラスミドｐＰＦｓｙｎＮで形質転換された大腸菌（ＤＨ５α）は、１９９９年９月１日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２５４である。
遺伝子およびタンパク質
本発明によれば環状デプシペプチド合成酵素、好ましくはＰＦ１０２２物質合成酵素、およびその遺伝子が提供される。
本発明による酵素は、４分子のＬ−ロイシン、２分子のＤ−乳酸、および２分子のＤ−フェニル乳酸に作用して、ＰＦ１０２２物質を合成できる。Ｄ−乳酸、Ｌ−ロイシン、およびＤ−フェニル乳酸をあらかじめ修飾しておくことによりＰＦ１０２２物質の誘導体を製造できる。
ＰＦ１０２２物質の誘導体としては、例えば、ＰＦ１０２２物質中の二つのフェニル基のパラ位がアミノ基により置換されたものが挙げられる。この場合、ｐＦ１０２２物質の誘導体の合成基質としては、例えば、Ｄ−フェニル乳酸の代わりにＤ−ｐ−アミノフェニル乳酸を使用できる。
配列（ｂ）において、改変の数は、例えば１〜数個、より具体的には１〜６個であることができる。
配列（ｅ）において、改変の数は、例えば１〜数十個であることができる。
配列（ｂ）および配列（ｅ）において変異が複数個存在する場合、導入された変異の種類は同一でも異なっていてもよい。
配列（ｄ）において、配列番号１のＤＮＡ配列との同一性は、好ましくは少くとも８０％、より好ましくは少くとも９０％、最も好ましくは少くとも９５％であることができる。
配列（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
配列（ｂ）に関して、「環状デプシペプチド合成酵素活性を有する」か否かは、例えば、環状デプシペプチドの基質を準備し、被験タンパク質を作用させ、環状デプシペプチドの生成を例えばクロマトグラフィーによって確認することにより評価することができる。
配列（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）に関して、「環状デプシペプチド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする」か否かは、例えば、実施例２に記載のように被験ヌクレオチド配列を宿主にて発現させ、得られたタンパク質を環状デプシペプチドの基質と作用させ、環状デプシペプチドの生成を例えばクロマトグラフィーによって確認することにより評価することができる。
本発明による合成酵素のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、本発明による合成酵素をコードするヌクレオチド配列とは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
本発明による遺伝子は例えば下記のようにして得ることができる。
ＰＦ１０２２物質生産菌からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。ペプチド合成酵素のアミノ酸配列の保存領域、あるいはＰＦ１０２２物質生産菌から精製した環状ペプチド合成酵素の部分アミノ酸配列を元に、適当なプライマーを合成し、それを用いてＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を実施し、環状ペプチド合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。このようにして、環状ペプチド合成酵素遺伝子の全域を単離することができる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、翻訳開始コドンの上流および翻訳終始コドンの下流に、ＰＣＲ等の手法により適当な制限酵素切断部位を導入し、環状ペプチド合成酵素遺伝子のみを含む遺伝子断片を得ることができる。
組換えベクター
本発明によれば環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明による組換えベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明において使用できるベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられ、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
本発明による組換えベクターは、例えば、環状デプシペプチド合成酵素をコードするヌクレオチド配列の上流にプロモーターを、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列を作動可能に連結することにより作製できる。
本発明による遺伝子へのプロモーターおよびターミネーターの連結、および発現ユニットのベクターへの挿入は、公知の方法に従って行うことができる。
本発明に用いるプロモーターおよびターミネーターは特に限定されず、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子の制御配列、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子の制御配列、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アセトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子の制御配列、ナイトレートレダクターゼ、オロチジン−５’−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素遺伝子の制御配列、およびＡｂｐ１等のＰＦ１０２２物質生産菌中で高発現するＰＦ１０２２物質生産菌由来の遺伝子の制御配列が挙げられる。
本発明による遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させてもよい。
遺伝子マーカーの導入は、例えば、制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結する事により行うことができる。
遺伝子マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラホス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
形質転換体および環状デプシペプチドの製造
本発明によれば前記ベクターにより形質転換された宿主が提供される。
本発明において使用できる宿主としては、遺伝子組換えの宿主として使用可能な微生物であれば特に限定されるものではない。使用できる宿主の例としては、任意の細菌類または真菌類の微生物が挙げられ、好ましくは大腸菌、バチルス属細菌、放線菌、酵母、糸状菌、より好ましくは、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ＰＦ１０２２物質生産菌を宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、環状デプシペプチドの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法または深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近で生育する。環状デプシペプチド合成酵素および環状デプシペプチドの生産は、培地および培養条件、または使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日〜２５日間でその蓄積が最高に達する。
培養中の環状デプシペプチド合成酵素、あるいは環状デプシペプチドの量が最高になった時に培養を停止し、培養物から環状デプシペプチド合成酵素あるいは環状デプシペプチドを単離、精製する。
培養物から環状デプシペプチド合成酵素あるいは環状デプシペプチドを採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、または適宜組み合わせて抽出精製することができる。
環状デプシペプチド合成酵素は、例えば、ブチルアガロース等を使用した疎水性クロマトグラフィーにより効率よく精製できる。
環状デプシペプチドは、例えば、培養物中からはアセトン、メタノール、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル等で抽出できる。環状デプシペプチドをさらに精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社）またはトヨパールＨＷ−４０（東ソー社）等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。以上のような方法により、またはこれらを適宜組み合わせることにより、純粋な環状デプシペプチドが得られる。
本発明によれば、環状デプシペプチドの大量生産系が提供される。環状デプシペプチドの生産系、特にＰＦ１０２２物質の生産系として使用できる宿主としては、ＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌が好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）である。形質転換に用いられる組換えベクターとしては、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列（プロモーター、ターミネーター等）を環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターが好ましく、最も好ましくはＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）において機能する制御配列を環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターである。環状デプシペプチド、特にＰＦ１０２２物質は、好ましくは、ＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列が環状デプシペプチド合成酵素遺伝子に作動可能に連結された発現ベクターによって形質転換されたＰＦ１０２２物質生産菌を培養し、培養物から環状デプシペプチドを単離することにより製造できる。
ＰＦ１０２２物質の基質であるＬ−ロイシン、Ｄ−乳酸、またはＤ−フェニル乳酸を合成しない宿主においては、不足する基質または基質の誘導体を添加して培養することにより、ＰＦ１０２２物質またはＰＦ１０２２物質の誘導体を生産させることが可能である。
実 施 例
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ＰＦ１０２２物質生産菌からの環状デプシペプチド合成酵素遺伝子のクローニング
１．ゲノムＤＮＡの単離とゲノムライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡは、ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）に対してＵＶ照射またはＮＴＧ処理により突然変異を誘発し、ＰＦ１０２２の生産性を向上させたＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株から抽出した。ＰＦ１０２２物質生産菌４３２−２６株を５０ｍｌの種培地［１％イーストエキス、１％マルトエキス、２％ポリペプトン、２．５％グルコース、０．１％リン酸水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム（ｐＨ７．０）］で２６℃にて２日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）により、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ Ｉにより部分分解した後、アガロースゲル電気泳動により１５ｋｂ〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これをアルカリフォスファターゼで処理し、ＤＮＡ断片の末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片をファージベクターのＬａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ（ストラタジーン社）に挿入した。このようにして得られた組換えファージベクターについて、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社）により、添付のプロトコールに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）株に感染させ、プレートにて培養しプラークを形成させた。
２．環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の単離
既知のペプチド合成酵素のマルチプルアライメントを行い、良好に保存された領域として、ＷＴＳＭＹＤＧ（配列番号３）とＶＶＱＹＦＰＴ（配列番号４）を見出した。これらの配列を元に、５′−ＴＧＧＡＣＩＷＳＮＡＴＧＴＡＹＧＡＹＧＧ−３′（配列番号５）および５′−ＧＴＩＧＧＲＡＡＲＴＡＹＴＧＩＡＣＮＡＣ−３′（配列番号６）のプライマーを合成した。これらのプライマーを用い、ＰＦ１０２２物質生産菌から単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、および１０μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃３分間、［９４℃１分間、６５℃（１サイクル毎に０．５℃下げる）１分間、７２℃１分間］×３０回、７２℃３分間。この反応により約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅し、このＤＮＡ断片をＯｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１プラスミドベクターに挿入した。
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステムズ社）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、添付のプロトコールに従い行った。その結果、単離したＤＮＡ断片の塩基配列は、ペプチド合成酵素遺伝子と相同性を示し、目的とする環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の一部であることが明らかとなった。
３．環状デプシペプチド合成酵素遺伝子全域のクローニング
ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用したプローブは、ＰＣＲにより、フルオレセイン標識ｄＵＴＰをＤＮＡ断片に取り込ませることにより調製した。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１００ｎｇの環状デプシペプチド合成酵素遺伝子ＤＮＡ断片が挿入されたｐＣＲ２．１プラスミドベクターを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）および添付のバッファー、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１８ｍＭフルオレセイン標識ｄＵＴＰ（ＦｌｕｏｒｏＧｒｅｅｎ、アマシャム ファルマシア バイオテク社）および１０μＭのプライマー（配列番号５および配列番号６）を用い、以下の条件で反応を行った。９４℃２分間、（９４℃３０秒間、５５℃１分間、７２℃１分間）×２５回、７２℃３分間。この反応により、約３５０ｂｐのフルオレセイン標識プローブが作製された。
実施例１の１において作製したプラークの形成されたプレート上に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を載せ、プラークを付着させた。このメンブレンをアルカリ処理し、メンブレン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。ファージＤＮＡが吸着したメンブレンを、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔａｂｌｅｔｓ（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用いて調製したバッファーに入れた後、６０℃で１時間インキュベートした。これに、上記のフルオレセインでラベルされたプローブを熱変性して添加し、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。その後、メンブレンを１×ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）−０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄し、さらに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄した。フルオレセインが結合したプラークの可視化は、ＤＩＧ洗浄ブロックバッファーセット（ベーリンガー・マンハイム社）、アルカリフォスファターゼでラベルされた抗フルオレセイン抗体（Ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ，Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ベーリンガー・マンハイム社）、発色基質としてニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ベーリンガー・マンハイム社）およびＸ−フォスフェート（ベーリンガー・マンハイム社）を用い、添付のプロトコールに従って行った。このようにしてプローブに相同な領域の５′上流域および３′下流域を含む陽性クローンを選抜した。
４．塩基配列の決定
このようにして単離された陽性クローン中のＤＮＡ断片を、ファージベクターの配列である５′−ＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡ−３′（配列番号７）および５′−ＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡ−３′（配列番号８）をプライマーとして用い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、陽性クローンＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、および０．２μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃１分間、（９８℃１０秒間、６８℃１５分間）×２５回、７２℃１５分間。得られたＰＣＲ産物を精製した後、ネブライザー処理し、ランダムに０．５ｋｂ〜２．０ｋｂに分解した。この断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社）のＥｃｏＲＶ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。このようにして得られた１６８個のコロニーをＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｈ４（宝酒造社）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造社）を用いて直接ＰＣＲし、これを精製した後、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（宝酒造社）をプライマーとしてシークエンスを行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１．２５ｕｎｉｔのＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、および０．５μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９４℃４分間、（９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間）×３０回、７２℃３分間。また、シークエンスは、ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステムズ社）とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、添付のプロトコールに従い行った。
得られた結果から、解析が不十分な領域については、プライマーを解析済みの塩基配列を元に新たに設計してＰＣＲにより増幅し、これを精製した後、ＰＣＲに用いたプライマーを用いてシークエンスを行った。これにより、陽性クローン中のＤＮＡ断片１５６０６ｂｐの塩基配列を決定した。
この配列を解析したところ９６３３ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この配列から予測されるタンパク質は、３２１０アミノ酸残基、３５４ｋＤａであり、ペプチド合成酵素と相同性を示すことが明らかとなった。また、最も高い相同性を示したタンパク質はエニアチン合成酵素（Ｓ３９８４２）であり、その相同性は５６％であった。このように単離した本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示した。
実施例２：環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の過剰発現によるＰＦ１０２２生産性の向上
１．遺伝子発現用の組換えベクターの構築（図１）
（１）環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域のクローニング
実施例１の３で得られた陽性クローンから、挿入されたＤＮＡ断片をＮｏｔＩにより切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社）のＮｏｔＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＦ７を作製した。ｐＰＦ７をＢａｎＩＩＩおよびＳｍａＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動し、約８２５０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋に挿入し、プラスミドｐＰＦ７−１を作製した。
ｐＰＦ７を鋳型とし、Ｎ末端付近からＢａｎＩＩＩ部位までの約４４０ｂｐ（配列番号９および配列番号１０を使用）または約４７０ｂｐ（配列番号１１および配列番号１０を使用）を増幅するためのプライマーとして、５′−ＡＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＡ−３′（配列番号９、ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始するように設計）または５′−ＡＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡ−３′（配列番号１１、ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始するように設計）、および５′−ＴＴＴＧＣＴＴＣＧＴＡＣＴＣＧＧＧＴＣＣＴ−３′（配列番号１０）を用い、また、ＳｍａＩ部位からＣ末端までの約９２０ｂｐを増幅するためのプライマーとして、５′−ＧＣＡＴＣＧＣＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＡＡＧ−３′（配列番号１２）および５′−ＡＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴ−３′（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行った。この際、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の５′側および３′側に、ＢａｍＨＩ部位を導入するようにプライマーの設計を行った。ＰＣＲは、５０μｌの反応液中、１５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを鋳型とし、２．５ｕｎｉｔのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社）、添付のバッファーおよびｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ塩化マグネシウム、および０．５μＭのプライマーを用い、以下の条件で反応を行った。９８℃３０秒間、（９８℃１５秒間、６５℃２秒間、７４℃３０秒間）×１０回、７４℃１分間。各プライマーを用いて得られたＰＣＲ反応液をエタノール沈殿し、ＰＣＲ産物を回収した。Ｎ末端領域に関しては、ＢａｍＨＩおよびＢａｎＩＩＩにより、また、Ｃ末端領域に関しては、ＳｍａＩよびＢａｍＨＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。
ｐＰＦ７−１のＳａｍＩ、ＢａｍＨＩ部位に、上記のＣ末端領域ＰＣＲ断片を挿入し、プラスミドｐＰＦ７−２を作製した。このプラスミドをＢａｎＩＩＩおよＢａｍＨＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動し、約９１７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。このＤＮＡ断片並びに配列番号９および配列番号１０を用いて作製したＮ末端領域を、同時に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を再構築し、プラスミドｐＰＦｓｙｎ（ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。
一方、ｐＰＦ７−２から切り出した約９１７０ｂｐのＤＮＡ断片並びに配列番号９および配列番号１１を用いて作製したＮ末端領域を、同時に、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を再構築し、プラスミドｐＰＦｓｙｎＮ（ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。このようにして両末端にＢａｍＨＩ部位を持つ環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を作製した。
ｐＰＦｓｙｎまたはｐＰＦｓｙｎＮをＢａｍＨＩで切断した後、環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域をそれぞれゲルから回収した。
（２）Ａｂｐ１遺伝子の発現制御領域を用いた発現ベクターの構築
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡの単離
ＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡの単離は（Ｈ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２７２−２７８，（１９８８））に記載の方法に従った。具体的には、まずＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）を種培地（可溶性澱粉 ２．０％、グルコース １．０％、ポリペプトン ０．５％、小麦胚芽 ０．６％、酵母エキス ０．３％、大豆粕 ０．２％および炭酸カルシウム ０．２％；殺菌前がｐＨ７．０；ＷＯ９７／００９４４号 実施例１参照）で２日間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。次いで、得られた菌体を凍結乾燥後、ＴＥに懸濁し、３％ＳＤＳ溶液中、６０℃、３０分間処理後、ＴＥ飽和フェノール抽出により、菌体残渣を除去した。抽出液はエタノール沈澱化後、リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）およびプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）処理し、さらに１２％ポリエチレングリコール６０００により核酸を沈殿化させた。これをＴＥ飽和フェノール抽出、エタノール沈殿化を行い、同沈殿をＴＥに溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムライブラリーの作製
上記のように調製したＰＦ１０２２物質生産菌由来ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクター、λＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームにＴ４リガーゼ（宝酒造社製ライゲーションキットＶｅｒ．２）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥに溶解した。連結混合物の全量をギガパックＩＩＩプラスパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、ファージプラークを形成させた。この方法により得られた１．３×１０４個（２．６×１０４ＰＦＵ／ｍｌ）のファージライブラリーを用いてＡｂｐ１遺伝子のクローニングを行った。
ＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡからのＡｂｐ１遺伝子クローニング
プローブはＡｂｐ１遺伝子の翻訳領域をＰＣＲ法により増幅し、用いた。前記のようにＰＦ１０２２物質生産菌から調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、８−７３Ｕおよび８−７３Ｒなる合成プライマーを用いて、レッツゴーＰＣＲキット（サワディーテクノロジー社製）に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下に８−７３Ｕおよび８−７３ＲのＤＮＡ配列を示す。
発現ベクターの構築
ｐＲＱＨｉｎ／１１９を鋳型にＡｂｐ１遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。プロモーターの増幅はＡＢＰ−ＮｅｃｏおよびＡＢＰ−Ｎｂａｍ、一方、ターミネーターの増幅はＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−Ｃｘｂａなるプライマーを用い、ＰＣＲスーパーミックスハイフィデリティ（ライフテックオリエンタル社製）によりＰＣＲ法を行った。反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下にＡＢＰ−Ｎｅｃｏ、ＡＢＰ−Ｎｂａｍ、ＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−ＣｘｂａのＤＮＡ配列を示す。
前記のようにゲルから回収した環状デプシペプチド合成酵素遺伝子領域をｐＡＢＰｄのＢａｍＨＩ部位に挿入し、環状デプシペプチド合成酵素遺伝子を発現させるための発現ベクターであるｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎ（ＯＲＦのＮ末端から１０番目のＭｅｔから翻訳開始）およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮ（ＯＲＦのＮ末端１番目のＭｅｔから翻訳開始）を作製した。
２．ＰＦ１０２２物質生産菌への環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の導入と発現
ＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）への発現ベクターの導入は、ＷＯ９７／００９４４号に記載された実施例１の方法に従って行い、ハイグロマイシンＢに対する耐性度の高い株を選抜した。これらの株における目的遺伝子の導入の確認は、Ａｂｐ１プロモーターの配列から作製したプライマー、５′−ＴＧＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＣＴ−３′（配列番号２０）および環状デプシペプチド合成酵素遺伝子の配列から作製したプライマー、５′−ＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣＴ−３′（配列番号２１）を用いたＰＣＲにより行った。このようにしてハイグロマイシンＢに対する耐性度が高く本発明の環状デプシペプチド合成酵素遺伝子が導入された遺伝子導入株を選抜した。
５０ｍｌの種培地にて遺伝子導入株および親株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７１）をそれぞれ別々に２６℃で２日間培養した後、それぞれの培養液１ｍｌを５０ｍｌの別々の生産培地［６％水飴、２．６％澱粉、２％小麦胚芽、１％ファーマメディア、０．２％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％炭酸カルシウム、０．３％塩化ナトリウム（ｐＨ ７．５）］に接種し、２６℃で４日間培養した。培養液を４５００ｒｐｍで５分間遠心することにより集菌し、得られたそれぞれの菌体を０．３Ｍ塩化カリウムで洗浄した。それぞれの菌体を液体窒素により凍結した後、凍結乾燥を行った。
以下に示す抽出操作は、氷上、または４℃の低温室にて実施した。凍結乾燥した菌体１０ｍｇおよび１．０ｍｌのガラスビーズ（径０．５ｍｍ）を入れた２ｍｌのマイクロチューブに、１．０ｍｌの抽出バッファー［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ塩化カリウム、６０％グリセロール、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール、１０μＭロイペプチン、１ｍＭフェニルメタンスルホン酸、６０μｇ／ｍｌキモスタチン］を添加した。このマイクロチューブをＭｉｎｉ−Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ−８（バイオスペック社）にセットし、最高速度で３分間運転することにより抽出を行った。これを１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、１００μｌの上清を１００μｌの１０％トリクロロ酢酸溶液中に入れ、混合した。１５分間放置した後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた沈殿を、１５μｌのアルカリ溶液（２％炭酸ナトリウム、０．４％水酸化ナトリウム）に溶解し、６０μｌのサンプルバッファー［１２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｌブロムフェノールブルー］を添加した。これを沸騰水中で５分間加熱した後、電気泳動システム（テフコ社）により、４％〜２０％のポリアクリルアミドゲルを使用して電気泳動［Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）］を行った。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルは、クイック−ＣＢＢ（和光純薬社）を用い、添付のプロトコールに従い染色した。親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を図４に示した。また、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を図５に示した。
このように、遺伝子導入株の環状デプシペプチド合成酵素の発現量は、親株に比べ顕著に高かった。
３．ＰＦ１０２２物質の抽出と定量
５０ｍｌの種培地にて遺伝子導入株および親株をそれぞれ別々に２６℃で２日間培養した後、それぞれの培養液１ｍｌを５０ｍｌの別々の生産培地に接種し、２６℃で６日間培養した。それぞれの培養液から１０ｍｌ分を採取し３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、別々に集菌した。それぞれの菌体に１０ｍｌのメタノールを加えて激しく振とうし、３０分間静置した。その後、再度振とうし、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清中のそれぞれの菌体から抽出したＰＦ１０２２物質を液体クロマトグラフィーにより各々定量した。カラムとしては、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ−１８（ｅ）（関東化学社）を用い、カラム温度は４０℃、移動相は８０％アセトニトリル、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎとして、２１０ｎｍの吸収によりＰＦ１０２２物質を検出した。この条件におけるＰＦ１０２２物質の保持時間は５分間〜６分間であった。実験は２反復で行い、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したＰＦ１０２２物質の定量結果の平均値を表１に示した。
また、親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したＰＦ１０２２物質の定量結果の平均値を表２に示した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎの作製方法を示す。
図２はＡｂｐ１遺伝子を含む６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を示す。
図３はｐＡＢＰｄの構成および制限酵素地図を示す。
図４は親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を示す。
図５は親株およびｐＡＢＰ／ＰＦｓｙｎＮを導入した遺伝子導入株から抽出したタンパク質の電気泳動の結果を示す。
Claims (12)
- 下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、および
（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＰＦ１０２２物質［シクロ（Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−ラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル−Ｄ−３−フェニルラクチル−Ｌ−Ｎ−メチルロイシル）］合成酵素活性を有する配列番号２のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。 - 請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号１のＤＮＡ配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
- 下記からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列、
（ｅ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつＰＦ１０２２物質合成酵素活性を有するタンパク質をコードする配列番号１のＤＮＡ配列の改変ＤＮＡ配列、および
（ｆ）ストリンジェントな条件［０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件］下で配列番号１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かつＰＦ１０２２物質合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。 - 請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えベクター。
- 請求項５に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
- ＰＦ１０２２物質合成酵素を発現している、請求項６に記載の宿主。
- ＰＦ１０２２物質を生産する、アゴノマイセタレス（ Agonomycetales ）に属する糸状菌である、請求項６または７に記載の宿主。
- 請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主を培養し、培養物から環状デプシペプチドを採取することを含んでなる、環状デプシペプチドの製造法。
- 環状デプシペプチドがＰＦ１０２２物質およびＰＦ１０２２物質中の二つのフェニル基のパラ位がアミノ基により置換されたＰＦ１０２２物質の誘導体である、請求項９に記載の製造法。
- 請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主を培養し、培養物から環状デプシペプチド合成酵素を採取することを含んでなる、環状デプシペプチド合成酵素の製造法。
- 環状デプシペプチドがＰＦ１０２２物質およびＰＦ１０２２物質中の二つのフェニル基のパラ位がアミノ基により置換されたＰＦ１０２２物質の誘導体である、請求項１１に記載の製造法。
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