CN113046332B

CN113046332B - 一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法

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Publication number: CN113046332B
Application number: CN202110334394.4A
Authority: CN
Inventors: 蒋岚; 刘雪婷; 张立新; 张雪; 朱国良; 王芷馨; 张敬宇; 兰珂盈; 张维燕; 吕康杰; 邢翠平; 杨欢婷; 黎晓莹
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113046332A

Abstract

本发明公开了一种二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes合成基因fosA、二倍半萜骨架化合物合成酶及其应用，属于基因工程领域。该二倍半萜骨架化合物合成基因来源于尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum FO14005)，其基因、cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，其编码的FoFS蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，该蛋白能催化DMAPP与IPP反应生成fusaoxyspenes。本发明发现的fosA基因催化产生新的五环二倍半萜骨架化合物，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

Description

一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从尖孢镰刀菌14005(Fusariumoxysporum 14005)中克隆得到的五环二倍半萜骨架化合物Fusaoxyspenes合成基因fosA及其应用。

背景技术

萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，是小分子天然产物中最大的一类化合物，到目前为止已发现超过8万种。其中最引起我们关注的是二倍半萜，该类化合物数量较少，占萜类总数不足2％，绝大多数来源于海绵，在植物、真菌、地衣及昆虫分泌物中也有报道。二倍半萜类化合物大多具有广泛的生理活性，如消炎、抗菌、抗结核、抗癌和细胞毒活性等，在药物开发中具有良好前景。其生物合成过程与其他萜类化合物相一致：以二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)为起始单元，在异戊烯基转移酶(Prenyltransferase，PT)作用下与异戊烯基二磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)首尾连接形成不同碳骨架数目的线性多聚异戊烯焦磷酸前体如香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphat，FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP)和香叶基法尼基焦磷酸(Geranylfranesyl pyrophosphat，GFPP)等，然后萜类环化酶(Terpene cyclase，TC)对这些焦磷酸前体进行环化或重排形成萜类骨架环化产物，然后进一步被各种后修饰酶催化反应生成各种萜类化合物。

从1965年至今发现约80种丝状真菌来源的二倍半萜化合物，这些化合物大多具有广泛的生理活性，在药物开发中具有良好前景。如：分离自Arthrinium sp.FA1744(ATCC74132)的双环二倍半萜terpestacin，具有显著的抑制血管聚合的活性，ID50为0.46μg/mL，明显优于阳性对照药硫酸葡聚糖(ID₅₀为12μg/mL)，研究表明terpestacin的作用靶点是位于线粒体复合物III上的UQCRB，通过抑制低氧引起的活性氧产量和细胞氧传感而发挥作用。Brady等以体外抗MRSA和VREF为导向，从一株内生真菌中分离鉴定一个新骨架二萜化合物guanacastepene。该化合物对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的大肠杆菌有显著的抗菌活性，有望开发成新型抗生素。真菌二萜中最著名的PAF拮抗剂是来自一株海洋真菌(Phoma sp.)的phomactin类成分(phomactinsA～J)，研究证明phomactin D活性最好，抑制PAF受体结合的IC₅₀为0.12μM，抑制血小板激活的IC₅₀为0.80μΜ¹¹。Chinworrungsee在对采自我国台湾的海洋真菌Halorosellinia oceanica的研究中发现其二倍半萜代谢产物halorosellinic acid有一定抗疟活性。Han J.J.等以体外抗炎活性为导向，从Cyathusafricanus的固体发酵粗提物中获得一系列新颖结构的鸟巢烷型二萜，其中化合物cyathinF和cyathin H具有优于阳性对照药氢化可的松的抗炎活性，IC₅₀分别为2.57和1.45μM。研究者从真菌Cyathus striatus中分离得到一类新的鸟巢烷木糖苷化合物striatoidA-F，在终浓度为10-40μM时，这些化合物具有一定的神经突起生长作用。

然而，由于资源及技术限制，萜类化合物产量低、获取成本高昂的缺点，人们直接从自然界中获取新颖骨架的萜类化合物来服务生产生活越来越困难。同时，传统的化学合成的方式获取新的萜类化合物存在反应步骤多、催化选择性差、条件不够温和以及污染环境等缺点，更关键的是其获得全新结构骨架的能力有限。近些年来，随着基因组测序技术及生物信息学的快速发展，人们发现微生物也具备可观的萜类化合物生产潜力。因此，通过针对单个微生物的全基因组分析，采用生物化学、分子生物学与天然产物化学相结合的策略，寻找具有全新催化机制的双功能萜类合酶；并通过构建可高效重构真菌来源萜类物质生物合成途径的异源表达系统，可获得大量新骨架二倍半萜/二萜化合物。为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

发明内容

本发明是为解决上述不足进行的，提供了一种二倍半萜化合物的合成酶及合成基因，并基于该合成酶或合成基因提供了一种二倍半萜化合物的生物合成方法。

本发明的思路如下：在挖掘尖孢镰刀菌14005代谢产物二倍半萜类化合物的生物合成过程中，通过对基因基因功能分析，得知fosA基因与萜类合成相关，说明fosA基因参与了二倍半萜类化合物的生物合成。进一步通过异源表达fosA基因获取FoFS蛋白进行体外酶促反应，验证了fosA基因是一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes的合成基因。

本发明的首要目的在于提供一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因及其编码的二倍半萜化合物合成酶；第二目的在于提供所述基因或酶的应用，即在二倍半萜类化合物生物合成中的应用；第三目的在于提供根据上述方法制备得到的五环二倍半萜类化合物。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因(fosA基因)，为从尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum 14005)基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 14005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21067。

优选的，fosA基因含有3个内含子，其cDNA大小为2181bp，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供了一种二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成酶，即为fosA基因编码的蛋白，命名为FoFS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，FoFS蛋白能催化DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)、与IPP反应合成fusaoxyspenes。

所述合成酶含有两个保守结构域：萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DYVNE和NDYFSYERE；E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIQD和DDYMN。

本发明所述的FoFS蛋白可通过大肠杆菌原核表达系统对fosA基因进行异源表达得到，同时可通过镍离子金属螯合亲合层析得到纯化的FoFS蛋白。

本发明的第三方面，提供了一种二倍半萜化合物合成酶重组表达载体，该重组表达载体为运载有上述二倍半萜化合物合成酶，或运载有上述基因的真核或原核表达载体。

本发明的第四方面，提供了一种二倍半萜化合物合成酶重组表达宿主细胞，含有上述的重组表达载体。

本发明的第五方面，提供了fosA基因以及其编码的FoFS蛋白的应用：FoFS蛋白可以合成二倍半萜化合物fusaoxyspenes，fosA基因可用于通过异源表达的方式合成二倍半萜化合物fusaoxyspenes或合成萜类化合物。

1)采用fosA基因异源表达二倍半萜类骨架化合物的方法，包括如下步骤：

A、FosA基因异源表达载体的构建

通过PCR技术，以尖孢镰刀菌14005基因组为模板扩增得到含有fosA的基因序列，扩增所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示：

fosA-F：cgGAATTCGAGCTCGATGGATCAACTAAGCTATCAGTCGA(SEQ ID NO.4)；fosA-R：actacaGATCCCCGGCTAGAGGTTCAACGACGCCA(SEQ ID NO.5)；

将扩增得到的片段通过同源重组与pUARA2载体连接，构建pUARA2-fosA表达质粒，并将该连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，筛选阳性转化子，培养后提取质粒PCR验证，获取pUARA2-fosA质粒，

B、原生质体转化

培养米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1并收集原生质体，与pUARA2-fosA质粒混匀，培养后将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为fosA异源表达菌株AO-fosA，

C、异源表达菌株AO-fosA培养及产物分离

接种异源表达菌株AO-fosA于pUARA2质粒筛选液体培养基，30℃培养3d；而后8000rpm离心10min收集发酵菌体，加入等体积80％丙酮后超声破碎20min后，8000rpm离心10min，取上清；用2倍体积的乙酸乙酯萃取上清液一次，用旋转蒸发仪旋干后得到粗提物，

对得到的发酵粗提物首先采用正向硅胶柱层析方法进行分离纯化，TLC快速检测各流份，合并斑点相同流份，减压浓缩旋蒸至干并转至已称重样品瓶中，称量样品并记录重量。

2)采用二倍半萜化合物合成酶合成二倍半萜类骨架化合物的方法，包括如下步骤：

以二甲基烯丙基焦磷酸为底物，添加IPP，在如下反应体系内进行：DMAPP，IPP，pH7.4、20mM Tris-HCl，2mM二硫苏糖醇、5mM MgCl₂和100mM FoFS蛋白，30℃反应过夜；反应结束后，用等体积正己烷萃取3次，用氮吹仪将有机溶剂吹干，50μL正己烷溶解后进行GC-MS检测，在保留时间为14.8min时检测得到二倍半萜化合物。

根据上述制备方法1)或制备方法2)制备得到的五环二倍半萜类骨架化合物，具体为含5-6-7-3-5五环二倍半萜骨架化合物，其分子式为C₂₅H₄₀，结构式如下A或B所示：

本发明的有益效果如下：

本发明发现了合成二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes的fosA基因，其编码的FoFS蛋白能够辅助fusaoxyspenes类化合物母核合成。本发明为二倍半萜化合物的生物合成提供了新的资源，为该类化合物种类的提供一种选择。

FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，该蛋白能催化DMAPP与IPP反应生成fusaoxyspenes。因此，本发明发现的fosA基因催化产生新的二倍半萜骨架化合物，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

附图说明

图1为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹H-NMR谱图。

图2为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的¹H-NMR谱图。

图3为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹³C-NMR谱图。

图4为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的¹³C-NMR谱图。

图5为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中¹³C-DEPT 135谱。

图6为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中¹³C-DEPT 135谱。

图7为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹H-¹H COSY谱。

图8为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的¹H-¹H COSY谱。

图9为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的HSQC谱图。

图10为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的HSQC谱图。

图11为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的HMBC谱图。

图12为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的HMBC谱图。

图13为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的H2BC谱图。

图14为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的NOESY谱图。

图15为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的NOESY谱图。

图16为尖孢镰刀菌14005中fosA基因编码的蛋白与已报道的蛋白的氨基酸序列比对结果图。

图17为fosA基因异源表达蛋白的表达结果图。1：含有pSJ8-fosA载体的BL21(DE3)在IPTG诱导前的全细胞蛋白图；2：含有pSJ8-fosA载体的BL21(DE3)在IPTG诱导后的全细胞蛋白图；M：蛋白marker。

图18为fosA基因异源表达蛋白的纯化结果图。1-6：含有pSJ8-fosA载体的BL21(DE3)在IPTG诱导后，500mM咪唑洗脱6个柱体积的蛋白图；M：蛋白marker。

图19为FoFS蛋白体外反应产物的GC-MS图。A：质荷比为340下提取的体外反应产物GC色谱图(以DMAPP和IPP为底物的反应产物GC色谱图)；B：体外反应产物质谱图。

菌种保藏信息：尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum 14005)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月31号，保藏编号为CGMCC No.21067。

具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所提供的二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因，是从尖孢镰刀菌14005(F.oxysporum 14005)中克隆得到，命名为fosA基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。FosA基因含有3个内含子，其cDNA大小为2181bp，序列如SEQ ID NO.2所示。FosA基因编码的蛋白，命名为FoFS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

FoFS蛋白属于嵌合型萜类合成酶，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。FoFS蛋白含有两个保守结构域，其中萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DYVNE和NDYFSYERE，E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIQD和DDYMN(图17)。

实施例1：二倍半萜化合物fusaoxyspenes合成基因的异源表达及二倍半萜骨架化合物的结构鉴定

利用异源表达的方法，将尖孢镰刀菌14005菌体中的fosA基因通过构建表达质粒转入宿主米曲霉中，检测异源表达菌株产物生产情况。本实施例所用到培养基配方如表1所示。

表1实施例所用到培养基配方

1.FosA基因异源表达载体的构建

(1)通过PCR技术，以尖孢镰刀菌14005基因组为模板扩增得到含有fosA的基因序列。扩增所用到的引物序列如下：

fosA-F：cgGAATTCGAGCTCGATGGATCAACTAAGCTATCAGTCGA；

fosA-R：actacaGATCCCCGGCTAGAGGTTCAACGACGCCA。

(2)将扩增得到的片段通过同源重组与pUARA2载体连接，构建pUARA2-fosA表达质粒，该载体fosA两侧与pUARA2载体具有一致的同源序列。

(3)连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pUARA2-fosA质粒。

2.原生质体的转化

(1)将米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1涂于PDA平板，30℃培养7d。

(2)收集孢子于10mL 0.1％Tween-80(一般需要收集1个平板的抱子)，用血球计数板计数。接种约10⁷个孢子于50mL DPY中，30℃、220rpm培养2-3d。

(3)称量100mg Yatalase，加入solution 0溶解，20ml用0.22μm滤膜过滤灭菌，加入到50ml离心管中。

(4)收集菌体。将培养好的100ml菌丝体倒入到P250玻璃过滤器中，去除培养基，用灭菌水清洗(或0.8M NaCl)3～5次，用灭菌药勺将水分挤干去除，然后将压干的菌体加入到Yatalase溶液中。30℃，200rpm震荡培养1-2小时，至球状菌丝体消失上清明显秽浊状为止。

(5)用Miracloth滤布过滤消化好的菌液，收集原生质体，转到新50ml离心管中，4℃，800g，5min离心。

(6)去除上清液，加入20ml，0.8M NaCl再悬浮清洗，4℃，800g，5min离心(清洗两次)。去除上清液，加10ml，0.8M NaCl。用细菌计数器在显微镜下数原生质体的数目。原生质体数目＝总计数/80x400ml x10⁴x稀释倍数。

(7)将原生质体浓度调成2×10⁸cell/ml。(sol 2/sol 3＝4/1)，依据菌体生长情况可收获0.5ml-2ml原生质体不等。

(8)取200μl的原生质体溶液移至新的50ml的离心管中，加入10μg表达质粒pUARA2-fosA，轻轻地混匀。在冰上静置20min。期间将灭菌好的Top agar，在50℃水浴中保温。

(9)往(8)的混悬液中加入1ml的sol 3，用枪头轻轻的混匀。在室温下静置20min。加入10ml的sol 2，轻轻混匀。

(10)4℃、800g、10min离心，除去上清，加入1mL的sol 2，用移液枪轻轻地混悬，加入200μL到pUARA2质粒筛选固体培养基的中央(×3板)；在培养皿的周围迅速加入5ml 50℃保温的top agar，快速混匀。平板表面充分干燥后，用parafilm缠好，盖朝下，进行30℃培养3-7天。

(11)每平板挑2-3个克隆，共8个。将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为fosA异源表达菌株AO-fosA。

3、异源表达菌株AO-fosA表达产物的检测

(1)接种异源表达菌株AO-fosA于pUARA2质粒筛选液体培养基，30℃培养3d。

(2)8000rpm离心10min收发酵菌体，加入100ml等体积80％丙酮后超声破碎20min后，8000rpm离心10min,取上清。

(3)用2倍体积的乙酸乙酯萃取1次，用旋转蒸发仪旋干后用15mL甲醇(色谱级)溶解。

(4)取1mL甲醇溶液，经0.22μm滤膜过滤后置于色谱瓶中，即为GC-MS和LC-MS样品。

(5)将样品进行GC-MS检测：采用Agilent-HP-5MS色谱柱，起始温度60℃，以15℃/min的速度升至310℃，再以5℃/min的速度升至310℃，保持13min。GC-MS方法参数如下：Sample模块：进样前后洗针次数5次，样品洗针次数2次，粘度补偿时间0.2s，进样模式为normal。GC模块：柱温50℃，进样温度270℃，进样模式为不分流(splitness)，载气为氦气，流速控制模式为线性，总流速10mL/min，柱温控制程序如表3.5。MS模块：MS离子源温度230℃，界面温度270℃，溶剂切除时间2.5min采集时间3min-60min，采集模式为全扫描，eventtime设置为0.3s，扫描速度为2000，扫描核质比为40-600Da。

(6)将样品进行LC-MS检测：采用Cholester色谱柱，流动相A相-0.1％甲酸水，B相-乙腈，流速为1mL/min，30min内流动相乙腈的比例由5％上升到100％，然后维持6min，之后10s内流动相乙腈的比例降至5％，然后维持4min 50s。

4、异源表达重组菌株AO-fosA二倍半萜骨架产物分离纯化及鉴定

AO-fosA共发酵10L，得到约2g粗提物。对得到的发酵粗提物首先采用正向硅胶柱层析方法进行分离纯化。采用干法上柱，石油醚等度洗脱，每10mL流出液收集一管，共收集得到18个流份，TLC快速检测各流份，合并斑点相同流份，减压浓缩旋蒸至干并转至已称重样品瓶中，称量样品并记录重量。HPLC分析各流份组分，精确定位目标流份。优化制备条件，选用Cholester半制备色谱柱制备目标化合物，流动相：A相-0.1％甲酸水；B相-乙腈，流速为4mL/min，95％乙腈甲酸等度，初始进样10μL，在保证峰型不变的基础上，逐渐加大进样量至80μL，目标二倍半萜化合物峰会在20min左右出现，在峰出现的时候将流出溶液接到锥形瓶中即可。对制备到的化合物TLC及HPLC进行纯度检验。

分离的二倍半萜骨架化合物的NMR测试采用Bruker 600MHz(¹H 600MHz；¹³C150MHz)。二倍半萜骨架化合物的溶剂为Benzene-d₆，NMR谱仪器分辨率为600MHz，先进行¹HNMR和¹³C NMR的测定，将其与数据库中的数据做对比，若为新结构，则再补全HSQC，COSY，HMBC谱图解谱确定具体结构。

5、鉴定二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes。

将上述得到的二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes进行鉴定：

(1)外观：为透明油脂状。

(2)溶解性：易溶于甲醇，难溶于水。

(3)核磁共振谱：图1为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹H-NMR谱图。图2为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的¹H-NMR谱图。图3为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹³C-NMR谱图。图4为本发明化合物fusaoxyspeneB溶于Benzene-d₆中的¹³C-NMR谱图。图5为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中¹³C-DEPT 135谱。图6为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中¹³C-DEPT 135谱。对本发明化合物fusaoxyspene A和B的核磁共振谱进行了研究并对¹H和¹³C信号进行了归属，见表2和表3。图7为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的¹H-¹H COSY谱。图8为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的¹H-¹H COSY谱。图9为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的HSQC谱图。图10为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的HSQC谱图。图11为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的HMBC谱图。图12为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的HMBC谱图。图13为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的H2BC谱图。图14为本发明化合物fusaoxyspeneB溶于Benzene-d₆中的H2BC谱图。图15为本发明化合物fusaoxyspene A溶于Benzene-d₆中的NOESY谱图。图16为本发明化合物fusaoxyspene B溶于Benzene-d₆中的NOESY谱图。并最终确定结构如下：

表2化合物fusaoxyspeneA的1D和2D谱各峰归属

表3化合物fusaoxyspene B的1D和2D谱各峰归属

为进一步验证fosA基因催化功能，进行大肠杆菌异源表达蛋白，体外验证该基因功能。

实施例2二倍半萜类骨架化合物合成酶的表达和纯化

1、异源表达重组菌株AO-fosA菌株的cDNA的获取

(1)将异源表达重组菌株AO-fosA菌液涂布于pUARA2质粒筛选固体培养基上，30℃培养7d左右。

(2)取30-100mg丝状真菌至无RNase的2mL微量离心管中，加入两匙直径1mm的氯化钴磁珠、4个钢珠，再加入400μLBuffer R-Ⅰ。放入提前预冷至-8℃的细胞破碎仪内，设置程序破碎菌体，65Hz，破碎180sec。

(3)将上清液转移至无RNase的1.5mL微量离心管中，加入150μL Buffer R-Ⅱ，涡旋15-30sec，在室温下，12000×g离心5min(使DNA和蛋白质沉淀)。

(4)将上清液转移至新的1.5mL微量离心管中，加入250μL异丙醇，涡旋混合均匀。(注意：应小心地取出上清液，不要搅动沉淀，沉淀可能会导致Spin/vac柱堵塞，使RNA被DNA和蛋白质污染)

(5)将Spin/vac柱放入2mL微量离心管中，将上述混合液转移至Spin/vac柱中，在室温/4℃下，6000×g离心1min。

(6)从2mL微量离心管中弃去滤液，将Spin/vac柱放置回相同的2mL微量离心管中。在Spin/vac柱加入500μL Buffer W1A，12000×g离心1min。(注意：请确保已将乙醇加入Buffer W1A中，并在瓶上注明，以备将来参考。)

(7)从2mL微量离心管中弃去滤液，将Spin/vac柱放置回相同的2mL微量离心管中。加入700μL Buffer W2，12000×g离心1min，从2mL微量离心管中弃去滤液，再用700μLBuffer W2重复此步骤。(注意：请确保已将乙醇加入到Buffer W2中，并在瓶上注明，以备将来参考。)

(8)从2mL微量离心管中弃去滤液，将Spin/vac柱放置回相同的2mL微量离心管中。12000×g离心1min，出去残留洗涤液。

(9)将Spin/vac柱转移至干净的1.5mL微量离心管中。为了获取total RNA，向Spin/vac柱膜中心加入70-100μL TE Buffer，室温静置1-2min，12000×g离心1min。

(10)RNA提取后，直接进行反转录反应。使用TAKARA试剂盒PrimeScript TM RTregent kit with gDNA Eraser。

A.去除基因组DNA反应：

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。42℃热激5min后，立即置于4℃。

B.反转录反应：

反应液配制在冰上进行，为了保反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。程序设定：37℃15min；85℃5sec；后置于4℃。所得产物即为cDNA。

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2.含fosA基因大肠杆菌表达载体的构建

用HindIII和NotI双酶切pSJ8载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用OMEGA胶回收试剂盒回收pSJ8载体的大片段。利用使用Ezmax重组酶将带有相应overlap的fosA基因片段以及对应双酶切制备的表达载体pSJ8载体进行质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH10b感受态细胞，经克隆子快速检验和质粒酶切验证鉴定后，获得大肠杆菌重组表达载体pSJ8-fosA。将构建好的pSJ8-fosA载体经热激转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)，进一步验证fosA基因的功能。

3、FosA基因的表达

将重组质粒pSJ8-fosA及pSJ8质粒通过热激转化法分别转入表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，用德国OMEGA公司的质粒小量提取试剂盒对转化子进行质粒抽提，经限制性内切酶HindIII和NotI酶切验证鉴定，成功获得分别含重组质粒pSJ8-fosA及pSJ8质粒的大肠杆菌表达菌株。

分别挑取含重组质粒pSJ8-fosA及pSJ8质粒的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的5mL LB培养基，于37℃、220r/min过夜培养。按1％的接种量将新鲜菌液接种至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的5mL LB培养基中，继续培养2-3h至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM,于37℃下诱导培养约3-5h(诱导前分别取出1mL菌液作为对照)。分别取出诱导前和诱导后的菌液200μL，加入5x SDS-PAGE样品缓冲液煮沸30min，室温12000g离心10min，各取10μL上清液进行SDS-PAGE检测，结果(图10)表明目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。

4、FoFS蛋白的纯化

取5mL过夜培养的含重组质粒pSJ8-fosA的大肠杆菌BL21(DE3)菌液按1％的接种量接种至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的500mL LB培养基中，于37℃条件下220r/min培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，于37℃下诱导培养3-5h，然后室温5000r/min离心5min收集诱导表达后的大肠杆菌菌体，用无菌ddH₂O悬浮菌体，室温5000r/min离心5min后去除上清(重复两次，彻底清洗细胞)。之后用HEPES缓冲液悬浮菌体，室温5000r/min离心后去除上清。将10mL HEPES缓冲液加入菌体细胞中，充分混匀后将细胞悬液置冰水浴中超声(参数：超声2s，间歇5s，功率300W)处理30min。然后4℃，13000rpm离心60min，取上清液用0.45μm滤膜过滤后进行蛋白纯化。纯化方法如下：

(1)取适量镍柱基质上柱，使基质里的无水乙醇在重力作用下充分流出。

(2)用20mL无菌ddH₂O冲洗柱子。

(3)用20mLHEPES缓冲液平衡柱子。

(4)将含有目标蛋白的上清液加入柱子中，收集流穿液，进行SDS-PAGE检测。

(5)分别以含50mM、100mM和500mM咪唑的洗脱液(用HEPES缓冲液稀释的咪唑溶液)进行洗脱，收集流出液，进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测结果显示用含500mM咪唑的洗脱液进行洗脱时，获得较纯的蛋白(图11)。用10kDa的超滤浓缩管浓缩该较纯的蛋白溶液至2.5mL后，用GE Healthcare的PD10脱盐柱对浓缩后的蛋白溶液进行脱盐处理，具体操作如下：

(1)用10mL平衡缓冲液平衡柱子，弃废液，重复4次。

(2)加入2.5mL蛋白液至完全浸入柱子，弃废液。

(3)加入3.5mL洗脱液并收集流出液(该流出液即为完成脱盐处理的蛋白溶液)，-80℃保藏备用。

实施例3二倍半萜类骨架化合物合成酶的功能分析

为了确定FoFS蛋白的功能，以美国Sigma-Aldrich公司的DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)为底物，添加IPP(异戊烯焦磷酸)来设计体外反应。反应体系(200μL)：50μL DMAPP，50μL IPP，20mM Tris-HCl(pH 7.4)、2mM DTT(二硫苏糖醇)、5mM MgCl₂和100mM FoFS蛋白，30℃反应过夜。反应结束后，用等体积正己烷萃取3次，用氮吹仪将有机溶剂吹干，50μL正己烷溶解后进行GC-MS(气相色谱-质谱)检测。采用Agilent-HP-5MS色谱柱，起始温度60℃恒温2min，以15℃/min的速度升至310℃，再以5℃/min的速度升至310℃，保持13min。

以DMAPP为底物，添加IPP，在保留时间为14.8min时检测到了分子量为340的物质，该物质通过质谱图分析为二倍半萜化合物fusaoxyspenes(m/z＝105、119、133、145、159、173、187、207、221、253、284、325、340等)(图12)。

以上结果表明FoFS蛋白能用DMAPP为底物，添加IPP时合成二倍半萜化合物fusaoxyspenes。由此可知FoFS蛋白同时具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，能够以DMAPP和IPP为底物从头合成fusaoxyspenes。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法

<130> 权利要求书、说明书

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2485

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence ）

<400> 1

atggatcaac taagctatca gtcgagactc attccgccag aggaggcaca gcagacaggc 60

tgcttcacat ctttgcccat ccgcatccat ccacgcaacg acatcgcaga cgcggcgacc 120

gcaaagttca ttgcagactg ggccaagcac gttggtgacg gaagagagaa gagaactcac 180

ttctgtcctt cccgtgtggg aaattggaat tcattacttt atcccgaggg cctccctgag 240

aggcttggaa gtgtttcgta tctactagac cttggtctaa tccacgacgg caagttcact 300

ctctggaatc acgcgtggtg tttggaaata tttatatata tcgctgactg gtctgtttaa 360

atagacgtga atgaggaact cagtgtccaa gatgccatgg cggcacatga acgtctcagg 420

cctgccttgg accctcaaga taaccgcaaa tgggacccag aatcaccaca gatgaagttc 480

aaaatgctct tatccgagtg tgttattgag tgtatcaaaa ctgatcgcga gcttggcaca 540

gccatgctca agtctttccg tgttctctgg ctggacattg ccgagaatgc caccagcgat 600

gcaccacaga cgatggacga ttattgggat gtacgaatga caaatggggg tatgaggtag 660

gtacaaattc aggtctctct atgaattcaa caggaagact gactgataca ccatggtagt 720

gttttttggc caatggttct ttacgccaca aacctgcgcc tctcggagga acagcatacg 780

ctggttcaac ccatcattgc cgccgccgaa gaagcccttt gttgggcaaa tgactacttc 840

agctatgaac gtgaagtctg ggaacttgag accggaaagg cgaagcgcat cgtcaacatt 900

gtcgagatgg tgtcacgtac taagggtctt tcaagtgcgg aagctaaagc agaagtgaag 960

agaatgatcc tgggagcaga ggctaagtat tgtcgtcttc gcgacgacct tctcagttcg 1020

aatccagaaa tgtctatgga tttgaagcgt tggatagaat acattggcct ctcaatctct 1080

ggtaatcact attggctctc ggcgtgttcg aggcaaaata cgtggaagac caattgctca 1140

atcgatggca aaatcaatgg cctaacgaat ggctcagtaa atgacaccaa caatcgttct 1200

gtcgacggtg tagtcaatgg cactgttgat actggaattg aggaaccaag tactggcaac 1260

aaagacacgt cgttgaaagc gctcaagctt cttttcaact ccactcctaa tgagtcgcat 1320

cctgtttgtc ggtatcccaa cgataaactc agcgactatg ctatggttgc gcctatgacg 1380

cacatctcta gcctgccttc caagggcacg aggagcgagc tcatttcggc cctcaacgtt 1440

tggttgaagg tgcctccagt agtcctgggt catatcagct cggccatcga catgttgcac 1500

aacgcgtcgt tgatcctaga cgacattcag gacaactcgc ctctacggcg tggagttcct 1560

gccgctcacg tagtcttcgg gacggcacaa tcaatcaaca gcgcgacttt catgtttgtc 1620

aaagctacag aagccgttcg ctcaactctc agcccggcgg cgctagaagc gctgcttcgc 1680

ggtctccaga cacttttcat gggccagagc tgggacttgt actggaagca caatttacaa 1740

tgcccagcag agggcgacta cataagaatg gtggaccaca aaacaggggg catgttcgtc 1800

atgctggtgc aactgatggc tgccgagagc ccgtactatg gcgcttcggt catcgaggac 1860

ctggagaggc tgatgcggct actagggcga ttctaccaga tccgcgacga ctacatgaac 1920

ttcagtgcct attcagcaca aaagggcttt gccgaggatc tagatgaggg aaaattctcc 1980

tttcccgtgg tgtgtggctt tgagagggat cccgagttgc gcggccagat cctggctatc 2040

ttcagacaac gcccaactag cggggctgga gaagccacac agctgtctag aaaggtcaag 2100

gagcatctca taagatgcat cgcggcctcc ggtggttttg acgaaactct gaagtgccta 2160

aggagcttgg agaacgagct agacacagag attgccgaac ttgaaaagaa attgggacag 2220

gttaatcctc tcttgagact gtgtttggct actctgagta tggaagggtg cgaaaagatt 2280

tgttggtgaa agagggcaag gtaaacttga gtgtatcttt tgagtgtatc tttctctcaa 2340

caccgtataa tttgcttacc tggtctcaat ggaaatcatc tttggtttta ttcaaacttt 2400

tcttaagatt gatctcgcgc ttgacatctc gattgctaac tataatttac cagcaggcaa 2460

ggatgtggcg tcgttgaacc tctag 2485

<210> 2

<211> 2181

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence ）

<400> 2

atggatcaac taagctatca gtcgagactc attccgccag aggaggcaca gcagacaggc 60

tgcttcacat ctttgcccat ccgcatccat ccacgcaacg acatcgcaga cgcggcgacc 120

gcaaagttca ttgcagactg ggccaagcac gttggtgacg gaagagagaa gagaactcac 180

ttctgtcctt cccgtgtggg aaattggaat tcattacttt atcccgaggg cctccctgag 240

aggcttggaa gtgtttcgta tctactagac cttggtctaa tccacgacgg caagttcact 300

ctctggaatc acgcgtggta cgtgaatgag gaactcagtg tccaagatgc catggcggca 360

catgaacgtc tcaggcctgc cttggaccct caagataacc gcaaatggga cccagaatca 420

ccacagatga agttcaaaat gctcttatcc gagtgtgtta ttgagtgtat caaaactgat 480

cgcgagcttg gcacagccat gctcaagtct ttccgtgttc tctggctgga cattgccgag 540

aatgccacca gcgatgcacc acagacgatg gacgattatt gggatgtacg aatgacaaat 600

gggggtatga gtgttttttg gccaatggtt ctttacgcca caaacctgcg cctctcggag 660

gaacagcata cgctggttca acccatcatt gccgccgccg aagaagccct ttgttgggca 720

aatgactact tcagctatga acgtgaagtc tgggaacttg agaccggaaa ggcgaagcgc 780

atcgtcaaca ttgtcgagat ggtgtcacgt actaagggtc tttcaagtgc ggaagctaaa 840

gcagaagtga agagaatgat cctgggagca gaggctaagt attgtcgtct tcgcgacgac 900

cttctcagtt cgaatccaga aatgtctatg gatttgaagc gttggataga atacattggc 960

ctctcaatct ctggtaatca ctattggctc tcggcgtgtt cgaggcaaaa tacgtggaag 1020

accaattgct caatcgatgg caaaatcaat ggcctaacga atggctcagt aaatgacacc 1080

aacaatcgtt ctgtcgacgg tgtagtcaat ggcactgttg atactggaat tgaggaacca 1140

agtactggca acaaagacac gtcgttgaaa gcgctcaagc ttcttttcaa ctccactcct 1200

aatgagtcgc atcctgtttg tcggtatccc aacgataaac tcagcgacta tgctatggtt 1260

gcgcctatga cgcacatctc tagcctgcct tccaagggca cgaggagcga gctcatttcg 1320

gccctcaacg tttggttgaa ggtgcctcca gtagtcctgg gtcatatcag ctcggccatc 1380

gacatgttgc acaacgcgtc gttgatccta gacgacattc aggacaactc gcctctacgg 1440

cgtggagttc ctgccgctca cgtagtcttc gggacggcac aatcaatcaa cagcgcgact 1500

ttcatgtttg tcaaagctac agaagccgtt cgctcaactc tcagcccggc ggcgctagaa 1560

gcgctgcttc gcggtctcca gacacttttc atgggccaga gctgggactt gtactggaag 1620

cacaatttac aatgcccagc agagggcgac tacataagaa tggtggacca caaaacaggg 1680

ggcatgttcg tcatgctggt gcaactgatg gctgccgaga gcccgtacta tggcgcttcg 1740

gtcatcgagg acctggagag gctgatgcgg ctactagggc gattctacca gatccgcgac 1800

gactacatga acttcagtgc ctattcagca caaaagggct ttgccgagga tctagatgag 1860

ggaaaattct cctttcccgt ggtgtgtggc tttgagaggg atcccgagtt gcgcggccag 1920

atcctggcta tcttcagaca acgcccaact agcggggctg gagaagccac acagctgtct 1980

agaaaggtca aggagcatct cataagatgc atcgcggcct ccggtggttt tgacgaaact 2040

ctgaagtgcc taaggagctt ggagaacgag ctagacacag agattgccga acttgaaaag 2100

aaattgggac aggttaatcc tctcttgaga ctgtgtttgg ctactctgac aggcaaggat 2160

gtggcgtcgt tgaacctcta g 2181

<210> 3

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence ）

<400> 3

Met Asp Gln Leu Ser Tyr Gln Ser Arg Leu Ile Pro Pro Glu Glu Ala

1 5 10 15

Gln Gln Thr Gly Cys Phe Thr Ser Leu Pro Ile Arg Ile His Pro Arg

20 25 30

Asn Asp Ile Ala Asp Ala Ala Thr Ala Lys Phe Ile Ala Asp Trp Ala

35 40 45

Lys His Val Gly Asp Gly Arg Glu Lys Arg Thr His Phe Cys Pro Ser

50 55 60

Arg Val Gly Asn Trp Asn Ser Leu Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Arg Leu Gly Ser Val Ser Tyr Leu Leu Asp Leu Gly Leu Ile His Asp

85 90 95

Gly Lys Phe Thr Leu Trp Asn His Ala Trp Tyr Val Asn Glu Glu Leu

100 105 110

Ser Val Gln Asp Ala Met Ala Ala His Glu Arg Leu Arg Pro Ala Leu

115 120 125

Asp Pro Gln Asp Asn Arg Lys Trp Asp Pro Glu Ser Pro Gln Met Lys

130 135 140

Phe Lys Met Leu Leu Ser Glu Cys Val Ile Glu Cys Ile Lys Thr Asp

145 150 155 160

Arg Glu Leu Gly Thr Ala Met Leu Lys Ser Phe Arg Val Leu Trp Leu

165 170 175

Asp Ile Ala Glu Asn Ala Thr Ser Asp Ala Pro Gln Thr Met Asp Asp

180 185 190

Tyr Trp Asp Val Arg Met Thr Asn Gly Gly Met Ser Val Phe Trp Pro

195 200 205

Met Val Leu Tyr Ala Thr Asn Leu Arg Leu Ser Glu Glu Gln His Thr

210 215 220

Leu Val Gln Pro Ile Ile Ala Ala Ala Glu Glu Ala Leu Cys Trp Ala

225 230 235 240

Asn Asp Tyr Phe Ser Tyr Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Glu Thr Gly

245 250 255

Lys Ala Lys Arg Ile Val Asn Ile Val Glu Met Val Ser Arg Thr Lys

260 265 270

Gly Leu Ser Ser Ala Glu Ala Lys Ala Glu Val Lys Arg Met Ile Leu

275 280 285

Gly Ala Glu Ala Lys Tyr Cys Arg Leu Arg Asp Asp Leu Leu Ser Ser

290 295 300

Asn Pro Glu Met Ser Met Asp Leu Lys Arg Trp Ile Glu Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Leu Ser Ile Ser Gly Asn His Tyr Trp Leu Ser Ala Cys Ser Arg Gln

325 330 335

Asn Thr Trp Lys Thr Asn Cys Ser Ile Asp Gly Lys Ile Asn Gly Leu

340 345 350

Thr Asn Gly Ser Val Asn Asp Thr Asn Asn Arg Ser Val Asp Gly Val

355 360 365

Val Asn Gly Thr Val Asp Thr Gly Ile Glu Glu Pro Ser Thr Gly Asn

370 375 380

Lys Asp Thr Ser Leu Lys Ala Leu Lys Leu Leu Phe Asn Ser Thr Pro

385 390 395 400

Asn Glu Ser His Pro Val Cys Arg Tyr Pro Asn Asp Lys Leu Ser Asp

405 410 415

Tyr Ala Met Val Ala Pro Met Thr His Ile Ser Ser Leu Pro Ser Lys

420 425 430

Gly Thr Arg Ser Glu Leu Ile Ser Ala Leu Asn Val Trp Leu Lys Val

435 440 445

Pro Pro Val Val Leu Gly His Ile Ser Ser Ala Ile Asp Met Leu His

450 455 460

Asn Ala Ser Leu Ile Leu Asp Asp Ile Gln Asp Asn Ser Pro Leu Arg

465 470 475 480

Arg Gly Val Pro Ala Ala His Val Val Phe Gly Thr Ala Gln Ser Ile

485 490 495

Asn Ser Ala Thr Phe Met Phe Val Lys Ala Thr Glu Ala Val Arg Ser

500 505 510

Thr Leu Ser Pro Ala Ala Leu Glu Ala Leu Leu Arg Gly Leu Gln Thr

515 520 525

Leu Phe Met Gly Gln Ser Trp Asp Leu Tyr Trp Lys His Asn Leu Gln

530 535 540

Cys Pro Ala Glu Gly Asp Tyr Ile Arg Met Val Asp His Lys Thr Gly

545 550 555 560

Gly Met Phe Val Met Leu Val Gln Leu Met Ala Ala Glu Ser Pro Tyr

565 570 575

Tyr Gly Ala Ser Val Ile Glu Asp Leu Glu Arg Leu Met Arg Leu Leu

580 585 590

Gly Arg Phe Tyr Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Met Asn Phe Ser Ala Tyr

595 600 605

Ser Ala Gln Lys Gly Phe Ala Glu Asp Leu Asp Glu Gly Lys Phe Ser

610 615 620

Phe Pro Val Val Cys Gly Phe Glu Arg Asp Pro Glu Leu Arg Gly Gln

625 630 635 640

Ile Leu Ala Ile Phe Arg Gln Arg Pro Thr Ser Gly Ala Gly Glu Ala

645 650 655

Thr Gln Leu Ser Arg Lys Val Lys Glu His Leu Ile Arg Cys Ile Ala

660 665 670

Ala Ser Gly Gly Phe Asp Glu Thr Leu Lys Cys Leu Arg Ser Leu Glu

675 680 685

Asn Glu Leu Asp Thr Glu Ile Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Gly Gln

690 695 700

Val Asn Pro Leu Leu Arg Leu Cys Leu Ala Thr Leu Thr Gly Lys Asp

705 710 715 720

Val Ala Ser Leu Asn Leu

725

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence ）

<400> 4

cggaattcga gctcgatgga tcaactaagc tatcagtcga 40

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence ）

<400> 5

actacagatc cccggctaga ggttcaacga cgcca 35

Claims

1.一种二倍半萜骨架化合物的合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。

2.根据权利要求1所述的合成酶，其特征在于，所述合成酶含有两个保守结构域：萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DYVNE和NDYFSYERE；E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIQD和DDYMN。

3.编码权利要求1所述的二倍半萜骨架化合物合成酶的基因，其特征在于：为从尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)14005基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 14005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21067。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因含有3个内含子，其cDNA大小为2181bp，序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种二倍半萜化合物合成酶重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为运载有权利要求1或2所述的合成酶，或运载有权利要求3或4所述基因的真核或原核表达载体。

6.一种二倍半萜化合物合成酶重组表达宿主细胞，其特征在于：含有权利要求5所述的重组表达载体。

7.如权利要求1或2所述合成酶在制备二倍半萜骨架化合物中的应用；

其中所述二倍半萜骨架化合物为下列化合物之一：

8.如权利要求3或4所述基因在制备二倍半萜骨架化合物中的应用；

其中所述二倍半萜骨架化合物为下列化合物之一：