CN114105913A - 二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法 - Google Patents

二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及二倍半萜化合物、其生物合成基因簇与合成方法，通过基因组挖掘，从一株真菌链格孢Alternaria alternata中获得了sesteralterin二倍半萜生物合成基因簇aas，该基因簇包含一个萜环化酶基因aasA和两个细胞色素P450酶基因aasB与aasC，通过米曲霉异源表达系统对基因簇中各基因进行表达，共获得了9个结构新颖且具有抗菌活性的sesteralterin二倍半萜化合物，首次报道了该类化合物生物合成途径，为实现其绿色高效合成奠定了重要的基础，同时，丰富二倍半萜化合物库，为发现新的抗生素等药用原料提供了先导化合物资源。

Description

二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域领域，具体涉及二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法，从真菌链格孢Alternaria alternata得到的该类化合物基因簇，并利用该基因簇通过异源表达合成该类化合物的方法。
技术背景
萜类化合物是一类碳氢骨架以异戊二烯(C5)为基本结构单元组成的天然产物，在自然界中分布广泛，也是小分子天然产物中最大的一类化合物，目前为止已经发现超过8万种，具有重要的生理活性和药用价值。二倍半萜化合物作为萜类化合物中的一个重要亚类，相比于其它萜类化合物其数量相对稀少，约占萜类总数的不到2％，二倍半萜化合物主要来源于海绵和丝状真菌，少部分来源于植物。截止到目前，人们从真菌中发现的二倍半萜化合物大约有170多个，虽然二倍半萜化合物在数量上相对稀少，但是却具有复杂多样的化学结构和广泛的药理活性，如从Talaromyces wortmanniiATCC 26942中发现的asperterpenoidA具有显著的MptpB抑制活性以；从Bipolaris oryza中分离获得ophiobolinA表现出突出的抗癌作用；从我国台湾的海洋真菌Halorosellinia oceanica的研究中发现其二倍半萜代谢产物halorosellinic acid有一定抗疟活性。由于目前从真菌中发现的二倍半萜化合物还相对稀少，只占二倍半萜总数的不到9％，因此，对于真菌来源的二倍半萜化合物仍有较大的开发空间。
近年来，随着基因测序技术的迅速发展，越来越多的真菌基因组相继被发现。生物信息学分析显示真菌基因组中的基因簇数量远远超过了从中发现的天然产物的数目，这暗示真菌基因组中蕴藏着丰富的天然产物资源，亟待人们发掘利用。
目前，基因挖掘结合异源表达策略已成为发掘新型活性天然产物的一种重要手段，通过强制激活基因簇中的“沉默”基因，进一步获得传统分离手段难以发现的新颖结构的天然产物。因此，利用基因挖掘技术从真菌中获取相应的酶并结合异源表达方法得到结构新颖的化合物，对于从真菌中开发稀有的二倍半萜化合物有重要的意义。
发明内容
针对现有的技术问题，本发明提供了二倍半萜类化合物、其生物合成基因簇，并提供了该类二倍半萜类化合物的生物合成方法以及抗菌活性；
所述二倍半萜类化合物均含有5/8/6/5四环骨架，其结构式如1～9所示：
Figure BDA0003291533400000021
所述的合成上述1～9化合物的基因簇为sesteralterin二倍半萜类基因簇aas，其来源于真菌链格孢Alternaria alternata，该基因簇aas中包含一个萜环化酶基因aasA和两个P450酶基因aasB与aasC，其相应的基因序列如SEQ ID NO.1-3所示；所述合成上述1～9化合物的生物酶为aasA、aasB和aasC基因表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示；所述的真菌链格孢Alternaria alternata菌株保藏于暨南大学-中药及天然药物研究所，保藏编号为JNU18-J13211Y-01；
上述化合物的合成方法如下：
1)基因异源表达载体的构建
首先，利用PCR技术，以Alternaria alternata基因组DNA为模板扩增出目的基因aasA、aasB、aasC；然后，将目的基因分别连接到米曲霉表达质粒pTAex3或pUSA质粒中，构建重组表达质粒pTAex3-aasA、pTAex3-aasB、pUSA-aasC；
最后，以重组质粒pTAex3-aasB为模板，通过相应的引物扩增含有淀粉酶amyB启动子和终止子的DNA表达框，分别将含有aasB的DNA表达框连接到pAdeA质粒中，构建重组表达质粒pAdeA-aasB
所述引物包括Inf-aasA-F/Inf-aasA-R、Inf-aasB-F/Inf-aasB-R、Inf-aasC-F/Inf-aasC-R、Inf-pAdeA-Parm-F/Inf-pAdeA-Tamy-R，所述引物的序列如SEQ ID NO.7-14所示；
2)米曲霉异源表达菌株的构建
采用PEG介导的方法，将表达载体pTAex3-aasA转化至米曲霉A.oryzae NSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasA；将表达载体pTAex3-aasA与pUSA-aasC共同转化至米曲霉A.oryzae NSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasAC；将表达载体pTAex3-aasA与pAdeA-aasB共同转化至米曲霉A.oryzae NSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasAB；将表达载体pAdeA-aasB转化至米曲霉AO-aasAC的原生质体中，得到转化子AO-aasABC；
3)米曲霉异源表达菌株培养与发酵
将转化子AO-aasA、AO-aasAC、AO-aasAB、AO-aasABC的菌丝体分别接种于种子液培养基中进行种子液的培养，进一步将种子液转移到诱导培养基中进行培养，诱导外源基因表达，获得代谢产物；
所述种子液培养基为DPY培养基，其组成包括：2％dextrin，1％polypeptone，0.5％yeast extract，0.05％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4；
所述诱导培养基为CD-starch培养基，其组成包括：0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4·7H2O，1％polypeptone，2％starch，pH为5.5；
收集步骤3)中菌株培养发酵5天后的菌体与菌液，菌体用适量丙酮浸没过夜，超声，减压浓缩得到浸膏提取物，菌液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到浸膏提取物，获得的菌体提取物经硅胶柱层析分离富集目标组分，菌液提取物经中低压ODS柱层析分离富集；然后通过半制备柱YMC-Pack ODS-Acolumn，5μm，10×250mm，进一步纯化，获得单体化合物。
本发明的有益效果如下：
本发明中以米曲霉作为优势表达宿主，采用基因逐步导入的方式，在其体内完整地异源重构了sesteralterin二倍半萜生物合成基因簇，并分离鉴定到9个新的二倍半萜化合物，且具有一定的抗菌活性，可应用在生物医药领域中；另外，本发明为获取该类sesteralterin二倍半萜产物的途径及进一步的深入探究奠定了坚实的基础，为丰富二倍半萜化合物库、以期发现新抗生素等药用原料提供了先导化合物资源。
附图说明
图1是基因簇aas示意图。
图2为本发明米曲霉异源表达所用的质粒pTAex3-aasA、pAdeA-aasB、pUSA-aasC、结构示意图。
图3为本发明AO-aasA、AO-wildtype菌株代谢产物的GC-MS检测图谱。
图4本发明化合物1转变为化合物2的HPLC-ELSD分析图谱。
图5-10本发明化合物1的核磁图谱。
图11-16本发明化合物2的核磁图谱。
图17为本发明AO-aasAC、AO-aasAB、AO-aasA、AO-wild type菌株代谢产物的HPLC检测图谱。
图18-23为本发明化合物3的核磁图谱。
图24-29为本发明化合物4的核磁图谱。
图30-35为本发明化合物5的核磁图谱。
图36-41为本发明化合物6的核磁图谱。
图42为本发明AO-aasABC、AO-aasAC菌株代谢产物的HPLC检测图谱。
图43-48为本发明化合物7的核磁图谱。
图49-54为本发明化合物8的核磁图谱。
图55-60为本发明化合物9的核磁图谱。
图61为本发明的化合物2-9的HRESIMS图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1sesteralterin二倍半萜化合物生物合成基因簇生物信息学分析
基于Local Blast同源搜索，本发明从链格孢真菌Alternaria alternata基因组中找到了sesteralterin二倍半萜化合物生物合成基因簇aas，通过NCBI数据库对该基因簇aas中的基因进行了功能预测，其包含一个萜环化酶基因aasA和两个P450酶基因aasB与aasC如附图1所示。
实施例2基因异源表达载体的构建
pTAex3-aasA质粒构建：以Alternaria alternata基因组为模板，利用引物Inf-aasA-F/Inf-aasA-R对萜环化酶基因aasA进行PCR扩增，将PCR反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，经胶回收试剂盒纯化后回收aasA目的片段，接下来，利用In-fusion试剂盒将aasA片段整合到SmaI酶切后的线性载体pTAex3中，并转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，通过氨苄青霉素筛选出阳性克隆，挑选阳性克隆子进行液体发酵，提取质粒并进行测序验证，得终得到正确的表达载体pTAex3-aasA；
pTAex3-aasB质粒构建：以Alternaria alternata基因组为模板，利用引物Inf-aasB-F/Inf-aasB-R对萜环化酶基因aasB进行PCR扩增，利用上述相同的方法，获得表达载体pTAex3-aasB；
pAdeA-aasB质粒构建：以重组质粒pTAex3-aasB为模板，利用引物Inf-pAdeA-Parm-F/Inf-pAdeA-Parm-R对基因aasB进行PCR扩增，获得含有淀粉酶amyB启动子和终止子的aasB基因表达框，利用上述相同的方法，将aasB基因表达框整合到XbaI切割的pAdeA质粒中，最终获得表达载体pAdeA-aasB；
pUSA-aasC质粒构建：以Alternaria alternata基因组为模板，利用引物Inf-aasC-F/Inf-aasC-R对萜环化酶基因aasC进行PCR扩增，利用上述相同的方法，将aasC片段整合到SmaI酶切后的线性载体pUSA中，最终获得表达载体pUSA-aasC；
所述的引物见表1；
表1：引物列表
Figure BDA0003291533400000051
实施例3米曲霉转染菌株的构建
在米曲霉转染菌株构建中，均是采用PEG介导的原生质体转化的方法将含有不同基因的表达质粒转染至米曲霉中，具体操作方法如下：
1)将含有目的表达质粒的大肠杆菌宿主细胞接种至20-30mL含Amp+抗生素的LB液体培养基中过夜培养，然后提取高浓度(>1g/L)重组质粒，用于接下来的转染实验；
2)从A.oryzae NSAR1平板上挑取适量菌丝于10mL DPY培养基(2％dextrin，1％polypeptone，0.5％yeast extract，0.05％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4，定容至1L)中，28℃，200rpm震荡培养1-2天；
3)将10mL上述培养液加入到100mL DPY培养基中，混匀后于28℃，180rpm震荡培养1天；
4)制备10mL TF solution 1：称取0.79g(NH4)2SO4和0.1g Yatalase裂解酶于15mL的离心管中，加入TF solution 0～10mL，上下颠倒溶解后，用0.22μm微孔滤膜过滤到50mL离心管中；
5)根据菌液浓度，取适量菌液至已灭菌的注射筒中，过滤菌液，压干收集菌体，用已灭菌的长竹签取出菌体，将其放入装有10mL TF solution 1的离心管中，于30℃，70rpm下，在恒温箱中震荡培养3h，破除细胞壁；待上清液明显浑浊且呈淡红色时，将原生质体化的菌液通过注射筒过滤器过滤到50mL离心管中；
6)加入等量的TF solution 2，上下颠倒混匀，4℃，1500rpm离心10min，弃掉上清，向沉淀中加入5mL的TF solution 2，上下颠倒混匀，吸取10μL，用血球计板在显微镜下数原生质体的数目，4℃，1500rpm离心10min，弃掉上清，再加入适量体积的TF solution 2(根据上述计数的原生质体数目，适当稀释或浓缩，使原生质体浓度在1～5×107个/mL)，上下颠倒混匀；
7)取200μL的原生质体溶液至15mL离心管中，加入10μL浓度为1μg/μL的重组质粒，混匀，在冰上静置30min，向混悬液中分三次分别加入250μL，250μL以及850μL的TFsolution 3，每次加入后，都用1mL枪头轻轻混匀，室温下静置20min；
8)静置结束后，向15ml离心管中加入5mL TF solution 2，上下颠倒混匀，4℃，1500rpm离心10min，弃掉上清，加入200μL TF solution 2，轻轻混悬后加入到下层培养基中央，并在四周迅速加入上层培养基，快速摇匀；
9)上述培养基平板吹干后，用parafilm缠好，倒置于28℃培养箱中培养3-7天，挑取转化株，并接种到M稳定培养基上进行稳定传代1-3次，待转化株稳定后，提取转化株基因组，对目的基因进行PCR验证，将PCR结果为阳性的菌株，进行后续的发酵实验。
为了鉴定sesteralterin二倍半萜基因簇中的萜环化酶aasA功能，按照上述的转染方法，本发明将表达质粒pTAex3-aasA转染至米曲霉中，得到含有aasA基因的转染菌株AO-aasA；
为了鉴定二倍半萜基因簇中的两个P450酶aasB和aasC的功能，本发明将表达质粒pAdeA-aasB与pTAex3-aasA一起转染至米曲霉中，得到转染菌株AO-aasAB；将表达质粒pUSA-aasC与pTAex3-aasA一起转染至米曲霉中，得到转染菌株AO-aasAC；将表达质粒pAdeA-aasB转染到AO-aasAC菌株中，得到转染菌株AO-aasABC；
实施例4米曲霉转染菌株AO-aasA培养、发酵以及代谢产物分析
将实施例3得到的AO-aasA米曲霉转染株接种于CD-starch液体培养基(0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4·7H2O，1％polypeptone，2％starch，定容至1L，培养基的pH为5.5)中，28℃，220rpm培养发酵5天，通过布什漏斗分别收集菌体和菌液，菌体使用适量丙酮浸泡12h，超声30min后，减压浓缩，菌液使用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，浓缩样品溶于色谱甲醇中，高速离心，取上清进行GC-MS检测，得到的GC-MS结果见图3；
所述气质分析分析方法如下：
分析仪器：Agilent 7890B GC，配备HP-5MS色谱柱(0.32mm i.d.,0.25μm filmthickness)和5977B单四极杆电子电离质谱仪(70eV)模式。系统采用氦气作为载体，速率为1mL/min。
分析条件：柱箱温度50℃，持续3min，再从20℃/min的速率升至70℃，持续1min，最后从15℃/min的速率升至300℃，持续3min。
由图3的GC-MS结果显示，与空白对照组(米曲霉野生株AO-Wild type)相比，AO-aasA菌株在20.6min处产生了明显的差异峰(化合物1)，且分子离子峰为358。
实施例5米曲霉转染菌株AO-aasA代谢产物分离及结构鉴定
将AO-aasA米曲霉转染菌株发酵3L，在CD-starch培养基(同实施例4)中培养5天后，收集菌体，用丙酮浸泡过夜，超声提取，减压浓缩蒸馏得到2.6g菌体浸膏，通过硅胶柱层析进行分离，流动相依次用环己烷、乙酸乙酯洗脱，经TLC分析发现化合物1在子馏分纯环己烷层，然后通过半制备柱YMC-Pack ODS-A column(5μm,10×250mm)进一步纯化，用100％的乙腈进行等度洗脱，纯化得到该化合物1(tR:16.0min,10mg)；
随后，对上述化合物1进行液质分析发现，化合物1在CDCl3溶液中能够自发地转变为化合物2(见附图4)。高分辨质谱数据显示化合物2(C25H42O2)的分子量比化合物1(C25H42O)的分子量大16Da，这暗示着化合物2是在化合物1的基础上氧化形成的；
所述液质分析方法采用HPLC-DAD-ELSD-MS；
分析仪器：采用DionexUltimate 3000，配备有UltiMate3000 Diode ArrayDetector以及amaZon SL离子阱电喷雾质谱；
色谱柱：液相分析柱YMC C18(5μm,4.6×250mm)，Phenomenex Gemini C18(5μm,4.6×250mm)；
流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)作为流动相，以1mL/min的流速进行梯度洗脱；
梯度洗脱程序：50％-100％乙腈(0-20min)，100％-100％乙腈(20-60min)。
本发明通过NMR确定了化合物2的结构；
将化合物2与化合物1的核磁数据进行比对，本发明发现化合物2少了两个双键碳信号(δC 143.0,133.0)，而多了两个连氧季碳信号(δC 79.1,67.6)，这表明化合物2是由化合物1的C10-C11位的双键发生环氧化形成的；
由于化合物1的部分碳信号缺失，而无法获得其完整核磁信号，因此，根据上述推断并结合化合物1的部分二维核磁数据，并确定了化合物1的平面结构；
化合物1的绝对构型是通过其后续的氧化产物4(通过单晶确定结构)的绝对构型确定的，基于以上结果，本发明阐明了萜环化酶aasA可以催化GFPP形成sesteralterin二倍半萜骨架化合物1。
化合物1，2理化性质如下：
化合物1：白色粉末。
Figure BDA0003291533400000081
(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.48)nm；IR(KBr)νmax 3510,2933,2864,1738,1455,1374,720cm-1；GC-MS(positive)m/z 358.4(calcd.for C25H42O,358.6070)，从而确定化合物分子式为C25H42O，不饱和度为5。核磁数据见表3，附图5-10。
化合物2：白色粉末。
Figure BDA0003291533400000082
(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)205(3.72)nm；IR(KBr)νmax 3674,3281,2952,2930,2867,1738,1458,1374,1014,954,895,727cm-1；HRESIMS(positive)m/z 375.3257[M+H]+(calcd.for C25H43O2,375.3263)，从而确定化合物分子式为C25H42O2，不饱和度为5。HRESIMS见图61。核磁数据见表4，附图11-16。
实施例6米曲霉转染菌株AO-aasAC与AO-aasAB培养、发酵以及代谢产物分析
将本发明将转染菌株AO-aasAC与AO-aasAB分别接种于CD-starch液体培养基(同实施例4)中，28℃，220rpm培养发酵5天，通过布什漏斗收集菌体和菌液，菌体使用适量丙酮浸泡过夜，超声30min后，减压浓缩，菌液使用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，浓缩样品加入色谱甲醇溶解，高速离心，取上清进行HPLC-MS检测，得到的结果见附图17；
对上述样品进行液质分析：
分析方法同实施例5；
由图17结果显示，转染菌株AO-aasAC产生了4个新的色谱峰，分别为化合物3、4、5、6，而转染菌株AO-aasAB未产生新的色谱峰。
实施例7米曲霉转染菌株AO-aasAC代谢产物分离及结构鉴定
化合物3、4、5、6的分离纯化：将AO-aasAC米曲霉转染菌株，发酵12L，在CD-starch培养基(同实施例4)中培养5天后，过滤收集菌液，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩蒸馏得到3.8g提取物，经中低压ODS柱层析，用甲醇-水(5:5,8:2和10:0，v/v)洗脱，得到3个子馏分，经分析发现四个目标化合物在子馏分3(220mg)中。然后通过半制备柱YMC-Pack ODS-Acolumn(5μm,10×250mm)进一步纯化，用86％乙腈-水(含0.1％甲酸)进行等度洗脱，得到化合物5(tR:23.5min,14mg)、化合物6(tR:27.7min,9.8mg)、化合物3(tR:47.4min,9.6mg)和化合物4(tR:50.1min,5mg)。
通过1D和2D核磁，X-ray单晶衍射以及计算碳谱的方法，本发明确定了化合物3、4、5、6的结构。其中，化合物3和4都是在骨架化合物1的基础上，在C9位和C22位发生了氧化并形成五元内酯环的结构，但两者C9位的手性不同，化合物3的C9位为S构型，而化合物4的C9位为R构型，两者互为差向异构体。化合物5是在骨架化合物1的基础上，在C9位与C22位分别氧化形成α-羟基与羧基的结构。化合物6是在五元内酯环的基础上，在C9位继续氧化形成α-羟基的结构。
化合物3、4、5、6理化性质如下：
化合物3：白色针状晶体。m.p.253.0–254.0℃；
Figure BDA0003291533400000091
(c 0.81,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)226(3.78)nm；IR(KBr)νmax 3533,3423,2975,2873,2839,1643,1463,1388,1356,1028,944cm-1；HRESIMS(positive)m/z 387.2881[M+H]+(calcd.for C25H39O3,387.2899)，从而确定化合物分子式为C25H38O3，不饱和度为7。HRESIMS见图61。核磁数据见表5，附图18-23。
化合物4：棕黄色块状晶体。m.p.258.0–259.0℃；
Figure BDA0003291533400000092
(c 0.77,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)220(4.00)nm；IR(KBr)νmax 3530,3420,2958,2876,1651,1460,1385,1206,1078,960cm-1；HRESIMS(positive)m/z 369.2799[M+H-H2O]+(calcd.for C25H37O2,369.2794)，从而确定化合物分子式为C25H38O3，不饱和度为7。核磁数据见表6，附图24-29。
化合物5:白色块状晶体。m.p.283.0–284.0℃；
Figure BDA0003291533400000093
(c 0.49,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)210(3.75)nm；IR(KBr)νmax 3443,2930,2870,1698,1687,1650,1457,1379,1235,1017,954cm-1；HRESIMS(positive)m/z 405.3027[M+H]+(calcd.for C25H41O4,405.3005)，从而确定化合物分子式为C25H40O4，不饱和度为6。HRESIMS见图61。核磁数据见表7，附图30-35。
化合物6：黄色粉末。
Figure BDA0003291533400000094
(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)223(3.63),265(3.67)nm；IR(KBr)νmax 3431,2952,2927,2870,1719,1614,1457,1382,1141,942cm-1；ECDλmax(Δε)(c 1.1×10-4mol/L,MeOH)236(–7.35),278(–4.30)nm；HRESIMS(positive)m/z403.2840[M+H]+(calcd.for C25H39O4,403.2848)，从而确定化合物分子式为C25H38O4，不饱和度为7。HRESIMS见图61。核磁数据见表8，附图36-41。
实施例8米曲霉转染菌株AO-aasABC培养、发酵以及代谢产物分析
本发明将转染菌株AO-aasABC接种于CD-starch液体培养基(同实施例4)中，28℃，220rpm培养发酵5天，通过布什漏斗收集菌体和菌液，菌体使用适量丙酮浸泡过夜，超声30min后，减压浓缩，菌液使用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，浓缩样品溶于色谱甲醇中，高速离心，取上清进行HPLC-MS检测，得到的结果见图42；
对上述样品进行液质分析：
分析方法：HPLC-DAD-ELSD-MS；
分析仪器：采用DionexUltimate 3000，配备有UltiMate3000 Diode ArrayDetector以及amaZon SL离子阱电喷雾质谱；
色谱柱：液相分析柱YMC C18(5μm,4.6×250mm)，Phenomenex Gemini C18(5μm,4.6×250mm)；
流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)作为流动相，以1mL/min的流速进行梯度洗脱；
梯度洗脱程序：50％-100％乙腈(0-20min)，100％-100％乙腈(20-60min)。
由图12结果显示，转染菌株AO-aasABC产生了3个新的色谱峰，分别为化合物7、8、9。
实施例9米曲霉转染菌株AO-aasABC代谢产物分离及结构鉴定
化合物7、8、9的分离纯化：将AO-aasABC米曲霉转染菌株，发酵6L，在CD-starch培养基(同实施例4)中培养5天后，过滤收集菌液，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩蒸馏得到0.55g提取物，经中低压ODS柱层析，用甲醇-水(4:6,6:4,8:2和10:0,v/v)洗脱，得到4个子馏分。经分析发现三个目标化合物在子馏分2(120mg)中。然后通过半制备柱YMC-Pack ODS-A column(5μm,10×250mm)进一步纯化，用55％乙腈-水(含0.1％甲酸)进行等度洗脱，得到化合物7(tR:9.6min,21mg)、化合物8(tR:11.3min,11.4mg)和化合物9(tR:19.8min,6mg)。
通过1D和2D核磁分析，本发明确定了化合物7，8、9的结构。其中，化合物7是在骨架C9位和C22位分别被氧化成α-羟基和羧基的基础上，在C16位继续氧化成β-羟基的结构。化合物8是在骨架C22位甲基单独被氧化成羧基的基础上，在C16位和C17位分别氧化形成羰基和α-羟基的结构。化合物9是在化合物4的基础上，在C16位引入了β-羟基的结构。
化合物7，8、9理化性质如下：
化合物7：白色粉末。
Figure BDA0003291533400000112
(c 0.45,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.74)nm；IR(KBr)νmax 3431,2952,2930,2870,1698,1681,1452,1382,1232,1138,1028,956cm-1；HRESIMS(positive)m/z 841.5804[2M+H]+(calcd.for C50H81O10,841.5830)，从而确定化合物分子式为C25H40O5，不饱和度为6。HRESIMS见图61。核磁数据见表9，图43-48。
化合物8：白色粉末。
Figure BDA0003291533400000113
(c 0.49,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(3.64)；IR(KBr)νmax 3466,2955,2873,1751,1684,1637,1455,1385,1124,1028cm-1；HRESIMS(positive)m/z 401.2689[M+H-H2O]+(calcd.for C25H37O4,401.2692)，从而确定化合物分子式为C25H38O5，不饱和度为7。HRESIMS见图61。核磁数据见表10，图49-54。
化合物9：白色粉末。
Figure BDA0003291533400000114
(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)218(3.90)nm；IR(KBr)νmax 3414,2958,2904,2873,1735,1647,1461,1384,1348,1305,1251,1039,957,793cm-1；HRESIMS(positive)m/z 403.2853[M+H]+(calcd.for C25H39O4,403.2848)，从而确定化合物分子式为C25H38O4，不饱和度为7。HRESIMS见图61。核磁数据见表11，图55-60。
实例10抗菌活性测试
本发明采用二倍稀释法测试了化合物1～9的抗真菌及抗细菌活性；测定方法如下：
1)将两种细菌Staphylococcus aureus 209P和Escherichia coliATCC0111接种至牛肉膏培养基，两种真菌Candida albicans FIM709和Aspergillus.nigerR330接种至沙氏培养基，细菌37℃培养1-2天，真菌32℃培养4-7天；
2)用生理盐水收集平板表面的菌体，用血球计数板计数，使菌液浓度在107-109个/mL范围内，取200μL菌液加入到200mL培养基中，充分摇匀；
3)用DMSO分别溶解阳性药和样品，配制浓度为12.5mg/mL的细菌阳性药妥布霉素(Tobramycin)和真菌阳性药伊曲康唑(Itraconzaole)，配制浓度为50mg/mL的样品溶液；
4)往96孔板第一孔中加入200μL培养基与菌液混匀液，第一孔中加入1μL样品，依次对半稀释，每孔浓度分别为256，128，64，32，16，8，4，2，1μg/mL，其中，第一排为阴性对照(DMSO)，第二排为阳性对照(阳性药)，其余9排为实验组；
5)放入保温箱培养，细菌(37℃)约1天后可观测结果，真菌(32℃)约1-3天后可观测结果，若溶液澄清则表示有抗菌活性；
结果如表2所示：化合物1～9均具有一定的抗真菌活性，可用于生物医药领域。
表2：化合物抗菌活性实验结果
Figure BDA0003291533400000111
Figure BDA0003291533400000121
Figure BDA0003291533400000131
表3化合物1的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000132
*The signals were not observed.
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000141
表4化合物2的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000142
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000151
表5化合物3的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000152
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000161
表6化合物4的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000162
Figure BDA0003291533400000171
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity
Figure BDA0003291533400000172
表7化合物5的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CD3OD)
Figure BDA0003291533400000173
Figure BDA0003291533400000181
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000182
表8化合物6的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000191
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000201
表9化合物7的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CD3OD)
Figure BDA0003291533400000202
a indiscernible signals due to overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000211
表10化合物8的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CD3OD)
Figure BDA0003291533400000212
a The indiscernible signals due to overlap or the complexmultiplicity are reported without designating multiplicity.
Figure BDA0003291533400000221
表11化合物9的核磁数据归属(1H for 600MHz and 13C for 150MHz in CDCl3)
Figure BDA0003291533400000222
a The indiscernible signals from overlap or the complex multiplicityare reported without designating multiplicity。

Claims (10)

1.二倍半萜化合物，其特征在于，所述化合物均含有5/8/6/5四环骨架，其结构式如1～9所示：
Figure FDA0003291533390000011
2.合成权利要求1所述化合物的基因簇，其特征在于，所述基因簇为sesteralterin二倍半萜生物合成基因簇aas，所述基因簇aas含有一个萜环化酶基因aasA和两个细胞色素P450酶基因aasB与aasC其相应的基因序列如SEQ ID NO.1-3所示。
3.一种合成权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基因异源表达载体的构建
首先，利用PCR技术，以Alternariaalternata基因组DNA为模板扩增出目的基因aasA、aasB、aasC；然后，将目的基因分别连接到米曲霉表达质粒pTAex3或pUSA质粒中，构建重组表达质粒pTAex3-aasA、pTAex3-aasB、pUSA-aasC；
最后，以重组质粒pTAex3-aasB为模板，通过相应的引物扩增含有淀粉酶amyB启动子和终止子的DNA表达框，分别将含有aasB的DNA表达框连接到pAdeA质粒中，构建重组表达质粒pAdeA-aasB；
2)米曲霉异源表达菌株的构建
将表达载体pTAex3-aasA转化至米曲霉A.oryzaeNSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasA；将表达载体pTAex3-aasA与pUSA-aasC共同转化至米曲霉A.oryzaeNSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasAC；将表达载体pTAex3-aasA与pAdeA-aasB共同转化至米曲霉A.oryzaeNSAR1的原生质体中，得到转化子AO-aasAB；将表达载体pAdeA-aasB转化至米曲霉AO-aasAC的原生质体中，得到转化子AO-aasABC；
3)米曲霉异源表达菌株培养与发酵
将转化子AO-aasA、AO-aasAC、AO-aasAB、AO-aasABC的菌丝体分别接种于种子液培养基中进行种子液的培养，进一步将种子液转移到诱导培养基中进行培养，诱导外源基因表达，获得代谢产物。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤1)中的引物包括Inf-aasA-F/Inf-aasA-R、Inf-aasB-F/Inf-aasB-R、Inf-aasC-F/Inf-aasC-R、Inf-pAdeA-Parm-F/Inf-pAdeA-Tamy-R。
5.根据权利要求3所述的体系的合成方法，其特征在于，所述步骤2)中表达载体的转化是通过PEG转化至米曲霉原生质体中。
6.根据权利要求3所述的体系的合成方法，其特征在于，所述步骤3)中种子液培养基为DPY培养基，所述DPY培养基组成包括：2％dextrin，1％polypeptone，0.5％yeastextract，0.05％MgSO4·7H2O，0.5％KH2PO4。；所述步骤3)中诱导培养基为CD-starch培养基，所述CD-starch培养基组成包括：0.3％NaNO3，0.2％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.1％KH2PO4，0.002％FeSO4·7H2O，1％polypeptone，2％starch，pH为5.5。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤3)中培养得到的代谢产物分离纯化步骤如下：
收集培养发酵5天后的菌体与菌液，菌体用适量丙酮浸没过夜，超声，减压浓缩得到浸膏提取物，菌液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到浸膏提取物，获得的浸膏提取物经硅胶柱层析分离富集目标组分，菌液提取物经中低压ODS柱层析分离富集；然后通过半制备柱YMC-PackODS-Acolumn，5μm，10×250mm，进一步纯化，获得单体化合物。
8.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.7-14所示。
9.合成权利要求1所述化合物的生物合成酶，其特征在于，所述生物酶为aasA、aasB、aasC基因表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6-10所示。
10.根据权利要求3～8任一所述化合物的合成方法得到的二倍半萜化合物在生物医药中的应用。
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