CN109020943B - 一种抗结核聚酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域:
本发明涉及用真菌Penicillium citrinum HDN51010(保藏编号:CGMCC 15889保藏日期:2018年6月20日)生产抗结核杆菌聚酮类化合物的方法;本发明还涉及该类化合物在预防和治疗结核杆菌感染中的用途。
背景技术:
本发明人从一株南极海绵共附生真菌Penicillium citrinum HDN51010液体发酵产物中分离出一个抗结核聚酮类化合物。研究发现所示聚酮类化合物具有显著的抗结核活性,表明上述聚酮类化合物具有进一步开发成抗结核药物的潜力。
发明内容:
本发明旨在提供一种具有抗结核活性的化合物。其结构式是
本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物,然后对发酵粗提物采用Sephadex LH20凝胶柱层析、中压MPLC和半制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用Penicillium citrinum HDN51010制备本发明式Ⅰ化合物的实例。
具体实施方式:
在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)是:
实施例1化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养:按培养微生物的常规方法,取Penicillium citrinumHDN51010适量,接种到PDA固体斜面培养基上,在28℃培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的Penicillium citrinum HDN51010适量,接种到装有150mL培养基[培养基组成(克/升):麦芽糖20.0,葡萄糖10.0,甘露醇20.0,味精10.0,酵母膏3.0,玉米浆1.0,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.3,pH调节至6.5]的500mL锥型瓶中,在28℃条件下静置培养9天,获得发酵产物。
2浸膏的获得
发酵液用纱布将上清液和菌丝体分离。将菌丝体破碎后用甲醇处理三次,减压浓缩至无甲醇,所得水相用等量乙酸乙酯萃取三次。发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯相,减压浓缩,得粗浸膏,共30克。
3化合物的分离精制
浸膏(30g)用甲醇溶解后,以甲醇-二氯甲烷为流动相进行正相硅胶柱层析,分为5个流份。组分2先甲醇为流动相进行LH20柱层析,分为6个组分。组分2-4以甲醇-水为流动相进行C-18ODS中压柱层析,梯度洗脱后再经反相半制备高效液相色谱(甲醇:水=50:50)得化合物Ⅰ(5mg)。
化合物Ⅰ为红色固体,分子式C12H12O6,HR-ESI-MS m/z:253.0707[M+H]+,计算值253.0707);IR(KBr)νmax 3399,2928,1699,1594,1407,1262,1194,1126,1051,825cm-1。1Hand 13C NMR见表1。
表1化合物Ⅰ的1H和13C NMR数据(500和125MHz,in DMSO-d6)a
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)、m(多重峰)表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2化合物的抗结核作用活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品,用DMSO配置成1mg/mL的母液,然后采用二倍稀释法稀释成0.5mg/mL,0.25mg/mL,0.125mg/mL,0.0625mg/mL的待测溶液,阳性药利福平(RIF)配置成1mg/mL,供测活性。
抗结核活性采用无抗性标记的自主发光结核分枝杆菌H37Ra进行体外活性研究
无抗性标记的自主发光结核分枝杆菌H37Ra(UAlRa)的培养及待测菌液的制备
从-80℃冰箱取出冻存的无抗性筛选标记的稳定的自主发光结核分枝杆菌H37Ra(UAlRa),接入5mL 7H9液体培养基(含有0.1%的吐温80)中培养,加入玻璃珠打散。当菌液的OD600达到0.6-0.8时,将菌液稀释到10-6,取0.5mL铺在7H11固体培养基,37℃培养28天。从平板上挑取单菌落使用酶标仪检测RLU(RLU:荧光值的相对单位),将确认发光的单菌落接入50mL 7H9液体培养基中,加入玻璃珠打散。当1mL菌液的RLU达到2百万时,用7H9液体培养基稀释菌液,使稀释后的菌液0.2mL时RLU在3000-5000的范围,将其作为检测用菌液。
加药与菌液
取4μL待测溶液加入96孔板中,每个浓度设置三个平行实验组,同时以DMSO为阴性对照,利福平(RIF,1μg/mL)为阳性对照,然后加入196μL的待测菌液(化合物的终浓度为20μg/mL,10μg/mL,5μg/mL,2.5μg/mL,1.25μg/mL)。
检测及数据分析
37℃恒温培养箱中培养,分别于24小时和72小时用envision的发光值,根据发光值判断样品的最小抑菌浓度(MIC)。(最小抑菌浓度:抑制90%细菌生长的浓度为最小抑菌浓度,本研究以DMSO阴性对照组发光值RLU为参照,能使发光值RLU下降90%的浓度为最小抑菌浓度。)
2实验结果
在抗结核活性测试中,不同浓度的化合物I对自主发光结核分枝杆菌H37Ra的发光值结果见表2。
表2不同浓度的化合物I对结核分枝杆菌H37Ra的发光值
3结论
化合物Ⅰ具有较好的抑制结核分枝杆菌的作用,可作为抗结核杆菌药物用于结核杆菌感染治疗。
Claims (4)
2. 权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:保藏号为CGMCC No.15889的真菌Penicillium citrinum HDN51010,先在PDA固体斜面培养基上于28℃培养箱中培养4天,再次接种于液体发酵培养基中对该真菌在28℃摇床条件发酵培养9天,发酵液过滤得到菌丝体破碎后用甲醇浸提三次,减压浓缩除去甲醇后用乙酸乙酯萃取三次,发酵上清液用等量乙酸乙酯萃取三次,合并所有乙酸乙酯相,减压浓缩得到粗浸膏。
3.权利要求2所述的制备方法,其中将所述粗浸膏通过正相硅胶柱层析进行初分离,以二氯甲烷-甲醇为流动相;以Sephadex LH20凝胶柱层析再分离,以甲醇为流动相;再经C-18ODS中压柱层析,以甲醇/水为流动相进行梯度洗脱;最后经反相半制备高效液相色谱分离纯化得权利要求1所述化合物,流动相为甲醇:水=50:50。
4.权利要求1所述化合物在制备抗结核药物中的用途。
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