CN114292758B - 碱蓬来源曲霉菌tr15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体是碱蓬来源曲霉菌TR15及其应用。碱蓬来源曲霉菌TR15(Aspergillus sp.TR15)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211402，保藏日期为：2021年11月11日。菌株TR15经固体发酵及提取分离能够制备得到吡咯烷醇类化合物preussin，产率高达3.1g/10L培养基，显著优于preussin的有机合成制备方法。Preussin还能够显著抑制多耐药灰葡萄孢，对其孢子的IC₅₀值和MIC值仅为5.56mg/L及20mg/L，优于商品化杀菌剂嘧菌酯及啶酰菌胺，可作为防控多耐药灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的新农药成分。

Description

碱蓬来源曲霉菌TR15及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体是碱蓬来源曲霉菌TR15及其 应用。

背景技术

吡咯烷醇类化合物是一类由真菌代谢产生的次级代谢产物，它们 中有一些具有显著的生物学活性，如具有抗原虫和变型虫、抗真菌、 抗病毒、癌细胞死亡增敏剂、免疫抑制活性及抗肿瘤等活性。

吡咯烷醇类化合物preussin对丝状真菌、酵母、耐药细菌、病毒 和多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用，其对多种肿瘤细胞的IC₅₀值为 12-50μM，其广泛的生理活性和其独特的全顺式取代吡咯环结构，使 其从被分离出来就一直吸引着合成化学家的目光。截至2021年，已 有四十多条合成路线被报道。Preussin现有的合成方法大多数存在合 成步骤繁琐、收率偏低，以及不能放大生产(仅限于毫克级别)等问 题，从而引起此类药物的批量化生产受阻。据我们调研，现在国内外大多数合成preussin的整体收率低于20％，一次性产量低于500毫 克；而且化学合成生产过程存在高温、高压、强酸、强碱等较为极端 的化工过程，生产安全性低、环境污染较重。并且目前吡咯烷醇类化 合物preussin多为进口产品，商品价格偏高，因此，开发具有我国自 主知识产权的高产preussin微生物菌株显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供碱蓬来源曲霉菌TR15及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

碱蓬来源曲霉菌TR15，分离于东营市黄河入海口湿地采集的碱蓬根 际土壤；该菌株于2021年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 20211402。

本发明所述的曲霉菌菌株TR15在制备吡咯烷醇类化合物 preussin中的应用。

在上述方案的基础上，所述曲霉菌菌株TR15制备吡咯烷醇类化 合物preussin的方法，该方法包括下列步骤：将曲霉菌菌株TR15接种至固体培养基中，室温静置发酵28-30d，所得发酵培养基经提取 分离得到吡咯烷醇类化合物preussin。

优选地，所述固体培养基为大米70g，玉米粉0.15g，蛋白胨0.45 g，海盐6g，用蒸馏水定容至200mL，pH 8.5-9.0。

优选地，所述吡咯烷醇类化合物preussin的提取分离步骤为：

(1)固体发酵培养基以2倍体积乙酸乙酯浸提2-3次，提取液 减压浓缩，得到粗浸膏；

(2)将上述粗浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯及二氯 甲烷-甲醇为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集二氯 甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分；

(3)将上述二氯甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分进行反相硅胶柱层析， 以甲醇-水为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集20％ 甲醇-水洗脱组分；

(4)将上述20％甲醇-水洗脱组分进行半制备高效液相色谱法纯 化，流动相为甲醇-水＝57-43，检测波长为210nm，流速为2mL/min， 收集保留时间为17.0min的组分，即得吡咯烷醇类化合物preussin。

本发明所具有的优点：

(1)本发明所述碱蓬来源曲霉菌TR15能够采用价格便宜的改良 大米培养基发酵，静置发酵而无需摇床震荡培养；发酵过程中，无需 调试pH值和补料，即可得到大量菌丝体，降低了发酵过程中的能耗； 菌株TR15经固体发酵及提取分离所制备得到的吡咯烷醇类化合物 preussin，其产率高达3.1g/10L培养基，显著优于preussin的有机合 成制备方法。此外，发酵和制备成本低，并且制备过程中所用试剂乙 酸乙酯和甲醇等试剂可循环回收利用，大大降低了有机溶剂对环境的 污染。

(2)Preussin除在抗病毒、抗肿瘤、抑制人致病菌等医用方面 具有广阔应用潜力外，还能够显著抑制多耐药灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，对其孢子的IC₅₀值和MIC值仅为5.56mg/L及20mg/L，优 于商品化杀菌剂嘧菌酯及啶酰菌胺，可作为防控多耐药灰葡萄孢的新 农药成分。

综上所述，碱蓬来源曲霉菌TR15能够通过相对简单且绿色环保 的制备方法高产吡咯烷醇类化合物preussin，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为曲霉菌菌株TR15的PDA平板正反面照片。

图2为preussin的碳谱。

图3为preussin对多耐药灰葡萄孢菌的抑菌活性(刃天青法)。

生物保藏信息

碱蓬来源曲霉菌TR15，命名为Aspergillus sp.TR15，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路299号武汉大学 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211402，保藏日 期为2021年11月11日。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点 将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发 明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本 发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改 或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：曲霉菌(Aspergillus sp.)菌株TR15的分离与鉴定

(1)菌株分离

本发明所述菌株TR15分离自东营市黄河入海口湿地采集的碱蓬 根际土壤，应用稀释平板涂布及平板稀释划线法分离纯化获得，具体 步骤如下：(1)将碱蓬根际土壤置于烘箱，45℃烘干残留水分；(2) 取10g土样至250mL三角烧瓶，加入90mL无菌水，28℃摇床，180 rpm震荡30min，得到土壤悬浮母液，并依次稀释至10^-2、10^-3及10^-4浓度；(3)分别吸取200μL上述稀释液，均匀涂布于含3.0％海盐的 PDA培养基平板，每个梯度设置三个平行；(4)将平板28℃静置培 养，挑取培养基表面不同形态的菌落，并在含3.0％海盐的PDA培养基平板上进行划线分离，定时观察菌落生长情况；(4)继续采用平板 稀释划线法分离纯化菌株，编号保存。

(2)菌株鉴定

将菌株TR15接种至含3.0％海盐的PDA平板表面，28℃培养4d 观察，结果见图1。可见，菌株TR15培养4d，菌丝即可铺满整个平 板，该菌株菌丝为白色，黄色孢子丰富，以子囊孢子和菌丝分裂两种 方式繁殖，产褐色色素，在海盐浓度为3％(w/v)长势仍然旺盛。

所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS1-5.8S-ITS2区)如下：

CCTCCCACCCGTGTATACCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCGC AAGCGGCCGCCGGGGGGGGCGTCAAACCCCCCTCCCTAGGCGAGCGCCCGCC GGAGACACCAACGTGAACACTGTCTGAAGTTTTGTTGTCTGAGTTCGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA GTCTTTGAACGCACATTGCACCCCCTGGTATTCCGGGGGGTATGCCTGTCCGAG CGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCGGG GACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCTGGCCGACGCTGAAAAGC AACCAACTATTTCTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATA

该序列信息与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其 与菌株Aspergillus persii CBS 112795(Accession number：NR 135421.1) 的同源性最高，为99.40％。

综上所述，曲霉菌TR15(Aspergillus sp.TR15)，保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号 为：CCTCC NO:M 20211402，保藏日期为：2021年11月11日。

实施例2：曲霉菌菌株TR15制备吡咯烷醇类化合物preussin的 方法

(1)发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取曲霉菌菌株 TR15适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28℃恒温培养箱中培 养5天。

取斜面培养5天的曲霉菌菌株TR15适量，接种到装有200mL 大米培养基的1000mL锥形瓶中，28℃静置培养30d，获得固体发酵 培养基(10L)。

所述大米培养基组成：大米70g，玉米粉0.15g，蛋白胨0.45g， 海盐6.0g，蒸馏水定容至200mL，pH 8.5-9.0。

(2)发酵培养基的提取

固体发酵培养基用其2倍体积的乙酸乙酯浸提2-3次，浸提液减 压浓缩得乙酸乙酯粗浸膏约53g。

(3)吡咯烷醇类化合物preussin的制备方法

粗浸膏用乙酸乙酯混悬，加硅胶(200-300目)搅拌，减压除去 溶剂后，干法上样，用硅胶柱层析(28×6.5cm)，以石油醚-乙酸乙酯 (20:1,10:1,5:1,1:1,v/v,下同)和二氯甲烷-甲醇(40:1,20:1,10:1,0:1)为 溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率为2mL/min。收集二氯甲烷-甲醇＝40:1 洗脱组分，所得洗脱液经薄层色谱跟踪分析，preussin在254nm和365nm波长下无紫外吸收，碘显黄褐色色斑，1％硫酸乙醇显色为砖 红色斑，洗脱液减压浓缩，称重为7.4g。

二氯甲烷-甲醇＝40:1洗脱组分以甲醇溶解，经反相硅胶柱层析(60 ×3.5cm)，以甲醇-水(10:90，20:80，30:70，50:50，70:30，100:0) 为溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率为2mL/min。收集甲醇-水＝20:80的 洗脱组分，所得洗脱液经薄层色谱跟踪分析，检测方法同上，洗脱液 减压浓缩，称重为5.9克。

甲醇-水＝20:80洗脱组分经制备型高效液相色谱分离(ODS-C₁₈， 10×250mm，柱号：2820195x)，检测波长210nm，洗脱速率为2mL/min， 甲醇-水＝57:43等度洗脱，收集t_R＝17.0min的色谱峰，洗脱液减压浓 缩，得到吡咯烷醇类化合物preussin 3.1g，其总产率为3.1g/10L培 养基。

(4)吡咯烷醇类化合物preussin的结构表征

将制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin进行波谱分析，结果表 明，ESI-MS显示其分子离子峰为318.28[M+H]⁺，由此可以推断其分 子量为317.27，进一步结合NMR波谱分析，确定化合物的分子式为： C₂₁H₃₅NO，结构式如下所示：

制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin的¹H-NMR(500MHz, CDCl₃)和¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)结果如表1所示。

表1.吡咯烷醇类化合物preussin的¹H与¹³C NMR数据(δin ppm,J in Hz)

实施例3：体外抗菌活性测试

将将制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin进行体外抗菌活性 测试。

供试菌株：多耐药灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

实验方法：微量刃天青显色法(Nat.Commun.2020,11(01):1608: 1-19)，具体步骤如下所示：1)将多耐药灰葡萄孢接种于PDA平板，于25℃的人工培养箱中培养至7-10d，用无菌水收集孢子，调整孢子 液浓度为1×10⁵个/mL。在96孔细胞培养板中每孔分别加入45μL液体培养基(35μL的1％葡萄糖无菌水溶液和10μL的PDB溶液)、5μL 的不同浓度的供试化合物和10μL孢子悬浮液，以加入等体积的溶剂 做阴性对照。2)调零孔里加入等量的液体培养基和供试化合物(不 加孢子液)，以茴香霉素、啶酰菌胺和嘧菌酯作为阳性对照。每个浓 度3个复孔，震荡混匀后，封板，25℃的恒温培养箱中培养24h后， 加入刃天青染料(40μmol/L)，避光，25℃恒温继续培养。3)待阴 性对照孔的颜色变为浅粉色，采用酶标仪在波长570nm下测定吸光 值。利用SPSS统计软件，计算抑菌率，求取IC₅₀和MIC值。

试验结果表明，吡咯烷醇类化合物preussin对多耐药灰葡萄孢的 IC₅₀值和MIC值分别为5.56mg/L和20mg/L，抑菌活性显著优于茴香 霉素、啶酰菌胺和嘧菌酯，详见表2和图3。因此，preussin有望开 发为新型抗多耐药灰葡萄孢的杀菌剂。

表2.刃天青法测定化合物对多耐药灰葡萄孢的抑菌活性

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 碱蓬来源曲霉菌TR15及其应用

<130> 2021-12-08

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 544

<212> DNA

<213> 碱蓬来源曲霉菌TR15(Aspergillus sp.TR15的5.8S rRNA基因序列)

<400> 1

cctcccaccc gtgtataccg taccttgttg cttcggcggg cccgccgcgc aagcggccgc 60

cggggggggc gtcaaacccc cctccctagg cgagcgcccg ccggagacac caacgtgaac 120

actgtctgaa gttttgttgt ctgagttcga ttgtatcgca atcagttaaa actttcaaca 180

atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa ttaatgtgaa 240

ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat tgcaccccct ggtattccgg 300

ggggtatgcc tgtccgagcg tcattgctgc cctcaagcac ggcttgtgtg ttgggtcgtc 360

gtccccccgg ggacgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg cgtccggtcc tcgagcgtat 420

ggggctttgt cacccgctct tgtaggcccg gccggcgctg gccgacgctg aaaagcaacc 480

aactatttct ccaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc 540

aata 544

Claims (5)

1.一种碱蓬来源曲霉菌(Aspergillus sp.)TR15，其特征在于：命名为Aspergillussp.TR15，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211402，保藏日期为2021年11月11日。

2.权利要求1所述的曲霉菌菌株TR15在制备吡咯烷醇类化合物preussin中的应用。

3.权利要求1所述的曲霉菌菌株TR15制备吡咯烷醇类化合物preussin的方法，其特征在于：包括下列步骤：将曲霉菌菌株TR15接种至固体培养基中，室温静置发酵28-30d，所得发酵培养基经提取分离得到吡咯烷醇类化合物preussin。

4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述固体培养基为大米70g，玉米粉0.15g，蛋白胨0.45g，海盐6g，用蒸馏水定容至200mL，pH 8.5-9.0。

5.权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述吡咯烷醇类化合物preussin的提取分离步骤为：

(1)固体发酵培养基以2倍体积乙酸乙酯浸提2-3次，提取液减压浓缩，得到粗浸膏；

(2)将上述粗浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯及二氯甲烷-甲醇为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分；

(3)将上述二氯甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分进行反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集20％甲醇-水洗脱组分；

(4)将上述20％甲醇-水洗脱组分进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为甲醇-水＝57-43，检测波长为210nm，流速为2mL/min，收集保留时间为17.0min的组分，即得吡咯烷醇类化合物preussin。

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