CN113025515A - 高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株及其应用，涉及灵菌红素人工培育技术领域，包括如下步骤:取粘质沙雷氏菌Ka3菌株;将菌种接种到LB培养基中恒温活化,按2%的接种量将活化的ka3菌种接种于20ml基础发酵培养基中，于250ml烧瓶中用无菌封口膜封口，在29℃.180 r/min震荡培养72h，形成发酵液;将发酵液离心，用酸性甲醇溶液提取菌体，收集上清液旋蒸浓缩，用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得灵菌红素，检测，证明该样品的纯度大于95%。本方法最高产量达到12.6g/L,与国内现有菌种及培养基得到的在几g/L左右徘徊的低产量方法相比，具有高产量，低成本，纯化工艺简单及纯度高等优点。

Description

高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株及其应用

技术领域

本发明属于灵菌红素人工培育技术领域，具体涉及高产灵菌红素的沙雷氏菌Ka3菌株及其应用。

背景技术

灵菌红素类色素(Prodigiosins,PGs)是一类具有3吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构的红色色素，其中代表性色素有灵菌红素(Prodigiosin,PG)、十一烷基灵菌红素(Undecylprodigiosin,UP)、环烷基灵菌红素(Cycloprodigiosin)、去甲灵菌红素(norprodigiosin)等(BENNETT.2000)。其中灵菌红素是其典型代表，它是一种次生代谢产物，近年来因其表现出的多种潜在有益特性而受到科学家们的关注，如抗真菌、抗菌、抗原生动物、抗疟疾、紫外保护性抗癌以及免疫抑制等。这种次生代谢物主要由沙雷氏菌菌属(Serratia.spp)、海洋细菌(Hahella chejuensis)及放线菌(Streptomyces coelicolor)等产生。研究表明，纯化的灵菌红素及其衍生物是有效的促凋亡因子，可作用于多种癌症细胞系，其中多种细胞靶点对正常细胞系几乎或没有毒性。因此，部分其衍生物已经作为治疗癌症的备选药物而进行临床实验，Obatoclax，作为目前唯一进入临床研究第二阶段的灵菌红素类似物，尽管还表现出与剂量相关的临床治疗效果，及过量浓度使用会引发轻微神经毒素中毒，但仍然在恶性固体肿瘤患者治疗上取得令人称赞的治疗效果。不可否认的是，灵菌红素及其类似物确实表现出众多的生物活性，并在抗癌症和免疫抑制等方面表现出色，然而，目前试剂级的灵菌红素及衍生物价格昂贵，如灵菌红素盐酸盐(＞ 98％purity)售价高达3万余元/mg，这在一定程度上限制了其应用研究。

这部分程度上反映了灵菌红素产量低以及提纯生产不易，例如现有专利文献中，粘质沙雷氏菌RZ 21-C6及其应用，申请公布号105969702A、种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素，申请号：200810072975.X、生产灵菌红素的菌株及其方法，申请公布号CN 102002469A等，其普遍存在工艺复杂，产量低的问题。因此，有必要在前人基础上做进一步研究，为其普遍应用打下一定基础。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术灵菌红素产量低以及提纯生产困难的问题,以一株从土壤里分离得到的产灵菌红素的菌株为基础，并通过优化发酵培养基及培养条件，达到低成本和高产量的要求，并通过加入表面活性剂甘油作为碳源，使细胞内的灵菌红素释放到细胞外来，并为下一步的灵菌红素提取纯化创造条件，为灵菌红素的工业化生产奠定基础，提供一种产灵菌红素的菌种以及高产的方法。本方法最高产量达到12.6g/L,与国内现有的菌种及培养基得到的在几g/L左右徘徊的低产量方法相比，其具有高产量，低成本及易培养等优点。

本发明采用的技术方案如下：

一种高产量灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株，在28℃下培养的菌落呈鲜红色，而在 37℃下培养的菌落呈橘黄色，单菌落呈圆形凸起，边缘光滑，部分呈现左旋树枝状的菌落，且能闻到腥臭气味，所述菌株命名为：Ka3菌株，所述Ka3菌株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.18910,保藏日期2019年11月06日。

作为优选,粘质沙雷氏菌Ka3菌株用于生产提取灵菌红素。

一种高产量灵菌红素的生产方法，包括如下步骤:

取粘质沙雷氏菌Ka3菌株，该菌株已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.18910, 保藏日期2019年11月06日；

将所述粘质沙雷氏菌的菌种接种到LB培养基中恒温活化,所述LB培养基的成分为：酵母浸粉、胰蛋白胨、NaCl，所述LB培养基的pH值为：7.0-7.2；

将所述活化后的粘质沙雷氏菌Ka3菌株接种到优化培养基中，无菌过滤透气封口膜密封后培养，形成发酵液，所述优化培养基的成分为：甘油、蛋白胨、硫酸镁，所述优化培养基的pH值为：6.7；

向所述经过培养的发酵液中加入pH为3的酸性甲醇,进行反复离心，提取上清液，将所述上清液旋蒸蒸发浓缩，用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得到灵菌红素。

作为优选,所述恒温活化的具体条件为：将所述菌种在恒温震荡培养箱中37℃、180 r/min活化24h。

作为优选,所述菌种在优化培养基中密封培养的具体条件为：将所述活化后的菌种按2％的接种量接种于20ml优化培养基中，将所述培养基置于250ml烧瓶中用无菌封口膜封口，在温度为29℃、转速为180r/min的条件下培养72h。

作为优选,所述恒温培养箱中恒温培养温度为29℃。

作为优选,所述优化培养基中各组分的含量为：2％甘油，15g/L蛋白胨，5g/L硫酸镁， pH值为6.7.

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明的方法中，通过优化发酵培养基及培养条件，达到低成本和高产量的要求，并通过加入表面活性剂甘油作为碳源，使细胞内的灵菌红素释放到细胞外来，提高灵菌红素产量，通过简便提取纯化方法得到高纯度的灵菌红素为灵菌红素的进一步临床应用探究打下基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为ka3的菌落形态特征图；

图2是ka3的个体形态特征图；

图3是PRC扩增结果图；

图4为基于16SrDNA基因序列绘制得菌株ka3的系统发育树；

图5为为灵菌红素干燥样品图；

图6为酸性色素溶液紫外吸收图谱图；

图7为薄层层析结果图；

图8为红外光谱分析图；

图9为液质联用检测液相色谱图；

图10为液质联用检测质谱图；

图11为液相色谱图；

图12为灵菌红素纯品标准曲线图；

图13为ka3菌种生长曲线图；

图14为培养基碳源筛选图；

图15为氮源筛选图；

图16为无机盐筛选图；

图17为培养基初始pH影响结果图；

图18为装液量影响结果图；

图19为正交优化结果图；

图20为光照稳定性测试结果图；

图21为本发明灵菌红素对福式志贺菌的抑菌性测试结果图；

图22为本发明灵菌红素对金黄色葡萄球菌的抑菌性测试结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一种高产量灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株，所述菌株命名为：Ka3菌株，所述Ka3 菌株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.18910。

一种高产量灵菌红素的生产方法，包括如下步骤:

分离纯化产色素的粘质沙雷氏菌；

将所述粘质沙雷氏菌的菌种接种到LB培养基中恒温活化,所述LB培养基的成分为：酵母浸粉、胰蛋白胨、NaCl，所述LB培养基的pH值为：7.0-7.2；

将所述活化后的粘质沙雷氏菌菌种接种到优化培养基中密封光照培养，形成发酵液，所述优化培养基的成分为：甘油、蛋白胨、硫酸镁，所述优化培养基的pH值为：6.7；

向所述经过培养的发酵液中加入pH为3的酸性甲醇,进行反复离心，提取上清液，将所述上清液旋蒸蒸发浓缩，用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得到灵菌红素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳实施例提供的一种高产量灵菌红素的方法，包括如下步骤:

分离纯化产色素的粘质沙雷氏菌：从新疆喀呐斯地区分离纯化出一株产红色色素的菌株，利用16SDNA鉴定发现菌株为粘质沙雷氏菌，并命名为Ka3菌株；

将分离出来的ka3菌种接种一环到50ml液体LB培养基活化,所述恒温活化的具体条件为：将所述菌种在恒温培养箱中37℃、150r/min活化24h；所述LB培养基的成分为：酵母浸粉、胰蛋白胨、NaCl，所述LB培养基的pH值为：7.0-7.2；所述LB培养基中各组分的含量为：5g/L酵母浸粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L NaCl；

将所述活化后的粘质沙雷氏菌菌种接种到优化培养基中密封光照培养，形成发酵液，所述优化培养基中各组分的含量为：2％甘油，15g/L蛋白胨，0.5％硫酸镁，所述优化培养基的pH值为：6.7；所述在优化培养基中密封光照培养的具体条件为：将所述活化后的菌种按2％的接种量接种于20ml优化培养基中，将所述培养基置于250ml烧瓶中用无菌封口膜封口，在29℃.160r/min.光照条件下培养72h；

取发酵液离心，收集上清液，加入酸性甲醇浸提菌体后离心，合并上清液，用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得到灵菌红素，收集称重，灵菌红素实际回收率为60％。。

用酸性甲醇溶解干燥色素，于紫外分光光谱计扫描得到最大吸收波长为535nm。红外光谱测定红色色素的分子结构，通过液相-质谱测定质荷比为324.2，结合核磁共振氢谱测定结果，可判断该色素为灵菌红素，结合液相测定结果，判断该方法所得菌红素样品纯度大于95％。

测定酸性甲醇提取溶液波长为535nm的吸光度,并与自制灵菌红素吸光度与浓度标准曲线比对，计算得到浓度。

实验例1

实验材料

酵母浸粉，胰蛋白胨，NaCl，甘油，蛋白胨，硫酸镁，甲醇，盐酸。

实验仪器

PiCo21型台式常温高速离心机(Thermo)；Genius 3型涡旋震荡器(IKA)；ZWYR-D2403 型恒温培养摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；UR118K0004型紫外分光光度计(翱艺仪器上海有限公司)；Frontier傅里叶红外光谱仪(PerkinElmer)；TSQQuanUltra三重四极杆液质联用仪。

1、菌株的分类学特征

1)菌株的群体形态特征

将从喀呐斯地区分离纯化的菌株ka3，用LB固体培养基涂布划线，在28度和37度下培养2天后，将平板取出，观察菌落颜色、形态是否平滑整齐等，并且记录好观察结果。

如图1所示，在28℃下培养的菌落呈鲜红色，而在37℃下培养的菌落呈橘黄色，虽然菌落颜色不相同，但是可以观察到，单菌落呈圆形凸起，边缘光滑，部分呈现左旋树枝状的菌落，且能闻到腥臭气味。

2)菌株的个体形态特征

在载玻片上滴一小滴生理盐水，无菌操作，用接种环刮取菌种少许，与生理盐水混合均匀后，将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢放下，放置在菌液上，同时避免气泡产生，再用滤纸吸去多余水分，将所制得的玻片放在显微镜下观察，先低倍镜，后高倍镜，然后油镜，观察分离菌株的个体形态特征。如图2所示，从图2中可以观察到许多短杆状或者球形的细胞。

2、菌株分子学鉴定

1)基因组DNA提取

将喀纳斯地区分离纯化的ka3菌使用接种环挑取一环接种至5ml LB试管中，在37℃， 150rmp的摇床上培养一天。使用试剂盒提取细菌基因组DNA。

TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit细菌基因组DNA提取试剂盒 (离心柱型)目录号：DP302。

2)PCR扩增

PCR扩增引物序列如下:27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT，取5μL扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上检测，将剩下的PCR产物送往上海杰李生物技术有限公司测序。

经PCR扩增16SrDNA后进行凝胶电泳，在切胶仪下所观察到的结果如图3所示，图3中1为PCR扩增结果，M为2000bp DNA Maker。根据切胶仪观察到图片结果可以看到PCR结果条带明亮，且条带小于2000bp大于1000bp,结果正确可以用来测序。

Ka3菌株的16SrDNA测序结果:

TCGAGCGGTAGCACGGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGG GATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAG ATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGA CACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG CCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAGCTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAG TCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACG CGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTC GGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACA CACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGC AACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTT CGGGAG。

3、系统发育树

将PCR产物送至上海杰李生物技术有限公司测定16srDNA序列，测序结果表明，该序列全长1381bp，在EzBioCloud数据库中比对，保存相似度最高6-10个菌种DNA序列的结果，随后将保存结果用MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbor-Jioning，NJ)绘制系统发育树。结果表明ka3菌株与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的同源性最相近，结合形态学鉴定，判断ka3为粘质沙雷氏菌，并送入中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.18910,如图4所示。

4、Ka3细菌扩增

将分离出来的保存在甘油里的ka3菌种先在LB固体培养基上划线活化，在37℃恒温培养箱培养24h，后取一环到50ml液体LB培养基，在恒温培养箱中37℃，180r/min活化24h。

5、基础发酵培养基培养

基础发酵培养基(牛肉浸粉10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH7.0-7.2，蒸馏水定量至1000ml)按2％的接种量将活化的ka3菌种接种于50ml基础发酵培养基中，于250ml 烧瓶中用无菌封口膜封口，在29℃.180r/min.光照条件下培养72h。

6、灵菌红素提取与纯化

取1ml发酵液于2ml离心管中，12000r/min离心5min，收集上清液，加入1ml酸性甲醇(96ml甲醇：4ml 1NHCl)于离心菌体中，充分震荡混匀，在12000r/min离心15min 离心，收集上清液，反复提取至菌体变白后，合并上清液，旋蒸蒸发至干燥。用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得到灵菌红素，所得样品如图5所示，收集称重，灵菌红素实际回收率为60％。

7、灵菌红素鉴定

将蒸发至干后的红色粉末用适量pH3的酸性甲醇溶解并稀释，于紫外分光光谱计扫描得到最高吸收峰，并记录吸光度，与建立的灵菌红素标准曲线(以浓度为横轴，吸光度为纵轴)对比，计算发酵液灵菌红素产量。通过薄层层析初步判定，红外光谱测定红色色素的分子结构，核磁共振氢谱测定原子数及位置，通过液相-质谱测定质荷比为324.2，结果与灵菌红素标准品一致。同时，综合液相色谱图及液质鉴定结果，可判断灵菌红素的纯度大于95％。

紫外波长扫描结果

将样品分别调至合适浓度后再调至不同pH值(酸性pH2-3)后在300nm-800nm波长扫描后，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标做出曲线图结果见图6，在酸性条件下的色素特征吸收峰在535nm,与文献一致。

薄层层析

用石油醚：乙酸乙酯＝1：1的比例的层析液层析，喷洒稀碘液显色结果如下图7所示：

a)未喷洒稀碘液，b)喷洒稀碘液；根据测量结果得知Rf＝6.6/7.5＝0.88与文献灵菌红素在石油醚：乙酸乙酯＝1：1体系下层析结果一致。且喷洒稀碘液后未见明显杂质色素，说明该提取液较纯可直接进行后续操作。

红外光谱

采用液膜法测定灵菌红素的红外光谱，红外光谱能量为40mW，波数范围为400～4000cm，对样品用红外光谱分析的数据采用Origin分析结果如下图8所示：

根据图片结果显示：其中3445.50cm-1是吡咯环上的“—NH—”伸缩峰，2920.8cm-1是甲基“—CH3—”伸缩峰，2855.15cm-1是亚甲基“—CH2—”的对称伸缩震荡峰，1629.55cm-1 是碳碳双键“—C＝C—”伸缩峰，1600-1400cm-1的吸收峰为吡咯环骨架的伸缩震荡，1250-1000cm-1为“—C—O—C—”的伸缩震荡峰。与文献报道中灵菌红素结构相符。

液质联用色谱

实验条件仪器：三重四极杆液质联用仪；色谱柱：C-18柱；

流动相A：0.1％甲酸——水溶液。流动相B：0.1％甲酸——乙腈溶液。

梯度洗脱：5％流动相B溶液-100％流动相B溶液,20min，维持100％B溶液5min；

流速：1ml/min；进样量：10ul；检测波长：535nm。

在液相色谱图9中，色素出峰时间为12.99min，该峰为我们所需的主要物质峰，峰面积占比大于95％，前面两个峰为试剂峰，峰面积所占比列及小，可忽略不计。

在质谱图10中，主要出现了多个离子碎片峰，主要峰的分子量为[M+H]+324.2丰度最高，表示红色色素主要是分子量为323.2的化合物，与文献的灵菌红素吸收峰相同。

液相色谱

实验条件仪器：Aglient；色谱柱：C-18柱；

流动相A：0.1％三氟乙酸——水溶液。流动相B：0.1％三氟乙酸——乙腈溶液。

梯度洗脱：5％流动相B溶液-100％流动相B溶液,20min，维持100％B溶液5min；

流速：1ml/min；进样量：10ul；柱温：28度；检测波长：535nm。

在液相色谱图11中，由于添加有三氟乙酸而消除了试剂峰，出峰时间为16.6min，该峰占比大于95％，说明灵菌红素纯度大于95％。

灵菌红素标曲建立

准确称量获得的灵菌红素标品0.050g，用酸性甲醇溶解，于50ml定容瓶定容，配置成为1mg/ml的母液，避光条件下在-20℃条件下密封保存。取1ml母液，分别稀释至5、10、、15、20、25、30、50、60、80、100mg/ml，以灵菌红素标准品浓度为横坐标，吸光度A535 测定值为纵坐标，建立灵菌红素标准曲线：y＝0.0107x-0.0069，R2＝0.9992(图12). R2极为接近1，证明该标准曲线比较良好，可用于发酵液色素产量测定。

8、培养基优化

以基础发酵培养基成分为基础，加入相同比列的碳源、氮源及无机盐进行选择优化，在固定培养条件下培养，取1ml发酵液并离心，测定上清液，菌体用酸性甲醇提取，反复提取至菌体基本无色，收集上清液并测定波长535nm的吸光度，并根据需要适当稀释。综合菌体与菌液的吸光度，以吸光度的大小初步判断灵菌红素产量。

生长曲线

用ka3的生长时间为横坐标，波长600nm时的吸光度为纵坐标，作出生长曲线折线图如下图13：结果表明，菌株ka3在接入种子培养基2h后进入对数生长期，并于24h达到平台期.根据ka3的生长特点，选择培养24h的菌液作为发酵优化研究的种子液。

碳源筛选及优化

根据图14的结果，发现加入1％的甘油时发酵液中的灵菌红素含量最高。

氮源筛选及优化

以1％的甘油作为碳源，其他培养条件不变，在培养基中加入各种比列相同的氮源物质，培养测定其对灵菌红素的影响。根据图15上研究结果，发现在以蛋白胨为培养基时灵菌红素产量最高。

无机盐筛选及优化

以1％的甘油作为碳源，1％的蛋白胨为氮源，其他培养条件不变，在培养基中加入各种比列相同的无机盐物质，培养测定其对灵菌红素的影响。

根据图16显示结果，由实验结果可知，在相同条件下，硫酸镁对灵菌红素的产量提高最有帮助。

培养基初始Ph优化

加入优化后培养基成分后，调节培养基pH，分别为4.0、5.0、6.0、6.4、6.7、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，其他发酵条件不变，发酵72h后测定色素产量。

根据图17显示结果，由实验结果可知，在相同条件下，在培养基Ph为6.7时，灵菌红素产量最高(3223mg/l)，对灵菌红素的产量提高最有帮助。

装液量优化

在250ml烧瓶中分别装入20,40,50,60,80,100ml优化培养基，以优化后的条件进行培养，测定色素产量。

跟据图18显示结果，由实验结果可知，在相同条件下，装液量最优为20ml/250ml(9028 mg/l))。

正交实验优化：

以单因素筛选最优培养基成分进行正交实验，选择碳源，氮源，无机盐以及添加物为主要因素，确定最优比列的培养基。

根据图19显示结果，以表1a所示成分含量，根据正交设计实验表L9(34)进行实验，实验结果如表所示，显著性蛋白胨＞甘油＞硫酸镁，根据极差分析结果，在甘油20ml/L、蛋白胨15g/L、5g/L条件下最优，验证实验证明实验结果正确，在最优成分条件下灵菌红素产量达到12.6g/l。

实验例2

灵菌红素的性质探究

测定本发明Ka3菌株提取的灵菌红素的光照稳定性。

将7支10mL离心管加入合适浓度的酸性灵菌红素乙醇溶液，在紫外光和白光(日光灯) 条件下放置，每隔半个小时取出一支，以酸性甲醇溶液做空白对照，在535nm波长下测试吸光度，根据吸光度，做出色素保留折线图，结果如图20所示：

白光对该色素的稳定性影响较小，持续照射3h后，色素的保留率仍保持在80％，而紫外光对该色素的稳定性影响则巨大，持续照射3h后，色素的保留率只有20％。

测定本发明Ka3菌株提取的灵菌红素的抑菌性。

通过牛津杯法测定灵菌红素对接种本实验室菌种福式志贺菌、金黄色葡萄球菌到LB液体培养基中37度150r/min摇床培养24h。

准备24个灭菌培养皿，将灭菌后的硬琼脂(1.5％)薄铺在培养基上，待琼脂凝固后，每个培养皿放置四个灭菌的牛津杯，然后分别加入1mL福式志贺菌、金黄色葡萄球菌到100mL 固体LB培养基中，摇匀后倒平板，待培养基凝固后，取出牛津杯，将四个孔分别加入200 μl甲醇，10ug/ml以及1000ug/ml灵菌红素甲醇溶液。4℃冰箱放置半个小时后，取出放在37度培养箱中培养至菌苔长出。

结果如图21、22所示，根据抑菌实验表明，本发明Ka3菌株提取的灵菌红素对金黄色葡萄球菌以及福式志贺菌有一定抑菌性，但由于灵菌红素本身是脂溶性色素，无法形成完整抑菌圈，不能用该方法进一步测定其抑菌性能。

如上所述即为本发明的实施例。前文所述为本发明的各个优选实施例，各个优选实施例中的优选实施方式如果不是明显自相矛盾或以某一优选实施方式为前提，各个优选实施方式都可以任意叠加组合使用，所述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明人的发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种高产量灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株，其特征在于,在28℃下培养的菌落呈鲜红色，而在37℃下培养的菌落呈橘黄色，单菌落呈圆形凸起，边缘光滑，部分呈现左旋树枝状的菌落，且能闻到腥臭气味，所述菌株命名为：Ka3菌株，所述Ka3菌株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.18910,保藏日期2019年11月06日。

2.根据权利要求1所述的高产量灵菌红素的粘质沙雷氏菌Ka3菌株，其特征在于：所述粘质沙雷氏菌Ka3菌株用于生产提取灵菌红素。

3.一种高产量灵菌红素的生产方法，其特征在于,包括如下步骤:

取粘质沙雷氏菌Ka3菌株，该菌株已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.18910,保藏日期2019年11月06日；

将所述粘质沙雷氏菌Ka3菌株接种到LB培养基中恒温活化,所述LB培养基的成分为：酵母浸粉、胰蛋白胨、NaCl，所述LB培养基的pH值为：7.0-7.2；

将所述活化后的粘质沙雷氏菌Ka3菌株接种到优化培养基中，无菌过滤透气封口膜密封后培养，形成发酵液，所述优化培养基的成分为：甘油、蛋白胨、硫酸镁，所述优化培养基的pH值为：6.7；

向所述经过培养的发酵液中加入pH为3的酸性甲醇,进行反复离心，提取上清液，将所述上清液旋蒸蒸发浓缩，用少量氯仿溶液溶解后过有机相滤头，60℃烘干得到灵菌红素。

4.如权利要求3所述的高产量灵菌红素的生产方法，其特征在于，所述恒温活化的具体条件为：将所述菌种在恒温震荡培养箱中37℃、180r/min活化24h。

5.如权利要求3所述的高产量灵菌红素的生产方法，其特征在于，所述在优化培养基中密封培养的具体条件为：将所述活化后的菌种按2％的接种量接种于20ml优化培养基中，将所述培养基置于250ml烧瓶中用无菌封口膜封口，在温度为29℃、转速为180r/min的条件下培养72h。

6.如权利要求4所述的高产量灵菌红素的生产方法，其特征在于：所述恒温培养箱中恒温培养温度为29℃。

7.如权利要求3所述的高产量灵菌红素的生产方法，其特征在于，所述优化培养基中各组分的含量为：2％甘油，15g/L蛋白胨，5g/L硫酸镁。

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