CN108299274B - 一种天然吲哚，其制备方法及应用 - Google Patents

一种天然吲哚，其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物领域，具体讲，涉及一种天然吲哚，其制备方法及应用。天然吲哚由新喀里多尼亚菌的发酵液分离得到，新喀里多尼亚菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2017802。本发明的吲哚具有天然吲哚的气味，可作为香料直接使用，还可作为其他吲哚衍生物的原料；且具有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性和α‑葡萄糖苷酶抑制活性，可应用于制备治疗老年痴呆症或糖尿病的药物。本发明的制备方法简单，且收率高，制备得到的天然吲哚的活性高。

Description

一种天然吲哚，其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体讲，涉及一种天然吲哚，其制备方法及应用。
背景技术
吲哚，又称苯并吡咯。外观为白色片状结晶，易溶于热水、醇、醚及苯中。高浓度的吲哚具有令人不适的气味，高度稀释吲哚时却有优雅芳香。在自然界中分布较广，如茉莉、素馨花、柑桔花等都含有微量吲哚。
目前，吲哚的用途越来越广泛，可直接用于制造香料，也可用作染料(适当的氧化吲哚可以制造靛红)和医药(适当的还原吲哚可以制造吲哚啉)的原料。许多吲哚衍生物可以直接用吲哚为原料合成。例如：5-甲氧基吲哚，以及由其制造的5-甲氧基-N-乙酰基色胺(俗称脑白金)。自然界中许多含有吲哚环的生物碱也具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。因此，吲哚的制备越来越引起人们的关注。由于自然界中植物中天然吲哚量极低，从煤焦油中提取的吲哚，其气味与合成品有明显的不同，不适宜用于制造香料和医药，因此，化学合成方法是当前吲哚最为主要的制备方法。目前全球已经工业化的吲哚化学合成方法主要有苯胺与乙二醇法、邻氯甲苯法、邻氨基乙苯法，邻硝基苯等。然而，尽管一百多年来人们不断探索着吲哚及其衍生物的合成工艺，但时至今吲哚的生产仍然存在着反应条件苛刻，产品收率低等缺陷，致使吲哚的价格一直居高不下。例如，邻氯甲苯法有效利用了甲苯氯化的副产物，但该工艺要经过氯化、氰化、氨化、脱氯化氢、脱氢五步等反应，步骤繁杂，产率不高。而邻硝基乙苯法则合理利用了氯霉素生产的副产物邻硝基乙苯，但该反应条件苛刻，温度高达700℃。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆症，是一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并伴有各种精神症状和行为障碍。随着人口老龄化速度的急剧增加，AD病人日益增多，AD已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康的主要疾病之一。虽然AD的病因并不明确，但是研究发现神经传递基质乙酰胆碱水平的降低是AD的一种重要特征性病理表现。针对神经传递基质乙酰胆碱水平的降低，科学家提出了著名的胆碱能假说，即胆碱能系统的改变与AD的认知功能的损害程度密切相关。随后,基于该理论，人们对乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)抑制剂展开了大量研究，并且发现抑制乙酰胆碱酯酶的活性可以明显改善和缓解AD病人的症状。到目前为止，美国FDA批准了5种药物用于治疗阿尔茨海默症，其中四种是乙酰胆碱酯酶抑制剂，分别为：Tacrine(他克林)、Donepezil(多奈哌齐)、Rivastigmine(利斯的明)、Galantamine(加兰他敏)。阿尔茨海默症发病缓慢、持久、呈进行性发展，需长期服药才能见效,上述4种应用于临床的AChE抑制剂大多存在半衰期短、较严重的外周胆碱能系统副作用等缺点，不利于患者长期服用。因此，从天然产物中寻找、开发具有毒副作用小、适宜患者长期服用等优点的乙酰胆碱酯酶抑制剂对于AD的治疗具有极为重要的意义。
α-葡萄糖苷酶是影响饮食中淀粉等主要碳水化合物消化、吸收的关键酶，抑制其活性可以延缓人体对淀粉等物质的降解和葡萄糖的吸收，从而抑制餐后血糖的快速升高。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂常被用于治疗II型糖尿病，可有效降低餐后血糖水平和减少糖尿病并发症的发生。由于化学合成药物毒副作用较大，易对糖尿病病人造成其他伤害，因此人们更多地从天然产物中寻找α-葡萄糖苷酶抑制剂。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
鉴于此，本发明第一方面提供一种天然吲哚，新喀里多尼亚菌的发酵液分离得到，所述新喀里多尼亚菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2017802。
本发明第二方面提供该天然吲哚的制备方法，至少包括如下步骤：
步骤1、提供所述新喀里多尼亚菌的发酵液；
步骤2、将发酵液用有机溶剂进行萃取，得到粗提物；
步骤3、将粗提物用硅胶柱进行层析，以100％的己烷、体积比为6.5～7：3～3.5的己烷-乙酸乙酯、体积比为4.5～5.5：4.5～5.5的己烷-乙酸乙酯、100％的乙酸乙酯、体积比为6.5～7：3～3.5的乙酸乙酯-甲醇、体积比为4.5～5.5：4.5～5.5乙酸乙酯-甲醇、100％的甲醇作为洗脱剂依次洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8；
步骤4、将制备得到的F3用硅胶柱进行层析，以体积比为8:2的己烷-丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到7个组分，依次为F3.1、F3.2、F3.3、F3.4、F3.5、F3.6和F3.7；
步骤5、将制备得到的F3.2用硅胶柱进行层析，以己烷-丙酮的体积比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F3.2.1、F3.2.2、F3.2.3、F3.2.4、F3.2.5、F3.2.6、F3.2.7和F3.2.8；其中的组分F3.2.2即为所述天然吲哚。
本发明第三方面提供该天然吲哚在制备用于治疗老年痴呆症或糖尿病的药物中的应用。
本发明的技术方案至少具有以下的有益效果：
本发明的吲哚具有天然吲哚的气味，可作为香料直接使用，还可作为其他吲哚衍生物的原料；且具有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。
本发明的制备方法简单，仅采用硅胶柱即可完成分离，无需使用其他复杂、价格高昂的设备，且收率高，制备得到的天然吲哚具有很好的生理活性。
菌种保藏信息：
本发明中所使用的新喀里多尼亚菌于2017年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2017802。
附图说明
图1为本发明实施例提供的天然吲哚的H-NMR图谱；
图2为本发明实施例提供的天然吲哚的13C-NMR图谱；
图3为本发明实施例提供的天然吲哚的HMBC图谱；
图4为本发明实施例提供的天然吲哚的HSQC图谱；
图5为本发明实施例提供的天然吲哚的cosy-1图谱；
图6为本发明实施例提供的天然吲哚的cosy-2图谱。
具体实施方式
下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。本发明的目的在于提供一种吲哚的制备方法及该吲哚的药物用途。
首先说明根据本发明实施例第一方面的天然吲哚。
本发明实施例提供一种天然吲哚由新喀里多尼亚菌的发酵液分离得到，新喀里多尼亚菌的保藏编号为CCTCC NO：2017802。本发明实施例创新性的采用新喀里多尼亚菌的发酵液进行天然吲哚的分离，具有原料易得，且收率高的技术优势，从而可大大提高天然吲哚的产量，降低成本，克服了化学合成吲哚的技术缺陷。
其次说明根据本发明实施例第一方面的天然吲哚的制备方法。
本发明实施例天然吲哚的制备方法，至少包括如下步骤：
步骤1、提供所述新喀里多尼亚菌的发酵液；
步骤2、将发酵液用有机溶剂进行萃取，得到粗提物；
步骤3、将粗提物用硅胶柱进行层析，以100％的己烷、体积比为6.5～7：3～3.5的己烷-乙酸乙酯、体积比为4.5～5.5：4.5～5.5的己烷-乙酸乙酯、100％的乙酸乙酯、体积比为6.5～7：3～3.5的乙酸乙酯-甲醇、体积比为4.5～5.5：4.5～5.5乙酸乙酯-甲醇、100％的甲醇作为洗脱剂依次洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8；
步骤4、将制备得到的F3用硅胶柱进行层析，以体积比为7.5～8.5：1.5～2.5的己烷-丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到7个组分，依次为F3.1、F3.2、F3.3、F3.4、F3.5、F3.6和F3.7；
步骤5、将制备得到的F3.2用硅胶柱进行层析，以己烷-丙酮的体积比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:51:1作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F3.2.1、F3.2.2、F3.2.3、F3.2.4、F3.2.5、F3.2.6、F3.2.7和F3.2.8；其中的组分F3.2.2即为所述天然吲哚。
可选的，在步骤1中，发酵液的制备方法为：将新喀里多尼亚菌接种到液体培养基中，28℃～30℃培养10～14天，离心收获上清，即得发酵液。
可选的，所用液体培养基可采用2216E液体培养基。
可选的，在步骤2中，有机溶剂为乙酸乙酯，有机溶剂与发酵液的体积比为0.5～1.5，优选为1：1；萃取的次数为1～3次，优选为2次；萃取的时间为12～36小时，优选24小时。
可选的，在步骤2中，萃取后收集有机相，在40℃～45℃的条件下进行干燥，即得粗提物。在该温度下进行干燥，一方面可提高干燥速度，另一方面也可减少有效成分活性的损失。
可选的，在步骤3中，以100％的己烷、体积比为7:3的己烷-乙酸乙酯、体积比为5:5的己烷-乙酸乙酯、100％的乙酸乙酯、体积比为7:3乙酸乙酯-甲醇、体积比为5:5乙酸乙酯-甲醇、100％的甲醇作为洗脱剂依次洗脱。
可选的，在步骤4中，以体积比为8：2的己烷-丙酮作为洗脱剂进行洗脱。
可选的，在步骤3中所用的硅胶柱为60目，在步骤4中所用的硅胶柱为60目，在步骤5中所用的硅胶柱为60目。
可选的，在步骤3中，通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，F3同时具有乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。进一步的，在同时具有乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的F3、F6、F7、F8组分中，按照乙酰胆碱抑制活性由大到小的顺序排列依次为：F8、F3、F6、F7，其中F3位列第二位；按照α-葡萄糖苷酶抑制活性由大到小的顺序排列依次为：F6、F3、F7、F8，其中F3位列第二位。因此，同时综合乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，F3组分的活性最佳，所以对F3组分进行进一步的分离；
在步骤4中，通过对所收集得到7个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，仅F3.2同时具有乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，所以对F3.2组分进行进一步的分离；
在步骤5中，通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，仅F3.2.2同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，此组分通过核磁共振分析后，判定为吲哚，其结构分析图谱分别如图1至图6所示，吲哚的结构式为：
Figure BDA0001573864990000061
本发明的制备方法简单，仅采用硅胶柱即可完成分离，无需使用其他复杂、价格高昂的设备，且收率高，每1.2g粗提物可获得天然吲哚100.1mg。并且制备得到的天然吲哚具有很好的生理活性，在天然吲哚浓度为25μg/ml条件下，乙酰胆碱酯酶抑制活性为36.9％、α-葡萄糖苷酶抑制活性更可达到91.5％。
最后说明根据本发明实施例第一方面的天然吲哚的在制备用于治疗老年痴呆症或糖尿病的药物中的应用。
由于本发明实施例制备得到的天然吲哚具有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此可以制备用于治疗老年痴呆症或糖尿病的药物。乙酰胆碱是参与学习记忆等生理活动的一种重要神经递质。乙酰胆碱酯酶抑制剂能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，升高脑内乙酰胆碱的水平，从而延缓阿尔次海默症病(老年痴呆症)情的发展。α-葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性抑制小肠内各种α-葡萄糖苷酶，降低餐后血糖水平的升高，从而用于糖尿病的治疗。因此，本发明实施例的天然吲哚可通过对乙酰胆碱酯酶抑制活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性用于老年痴呆症或糖尿病的治疗。
实施例1
1、新喀里多尼亚菌的培养和发酵
从2216E固体平板上用接种环接种新喀里多尼亚菌单菌落CGJ02-2(于2017年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为菌种保藏号：CCTCC M2017802)至三个各含有100ml 2216E液体培养基的250ml三角瓶中，28℃～30℃，160rpm，过夜培养。将活化的菌液，按照1：50的比例进行扩大培养，总体积为8L，28℃～30℃，160rpm培养10～12天。将发酵液用高速离心机，离心8000RPM，离心10分钟，去掉菌体，收获上清。
2、发酵液的浸提
A.将培养液上清浸渍于等体积乙酸乙酯中24小时，期间不断摇动。然后，用分液漏斗将有机相和水相分开。水相再加入等量的乙酸乙酯重新浸渍24小时(每升培养液上清浸渍两次)，用分液漏斗将有机相和水相分开。收集两次萃取获得的有机相，用旋转蒸发仪蒸干。加热温度为40-45℃，旋转速度为80rpm。制冷温度设置为2℃。最后把每升提取物合并蒸干，得到的粗提物重量为1.2g。
B.将1.2g粗提物用(3×50cm)硅胶柱(60目)进行层析，以己烷(100％)、己烷-乙酸乙酯(70:30/v/v)、己烷-乙酸乙酯(50:50v/v)、乙酸乙酯(100％)、乙酸乙酯-甲醇(70:30v/v)、乙酸乙酯-甲醇(50:50v/v)、甲醇(100％)作为洗脱剂依次洗脱，每个流动相的体积为400ml。收集到140个组分，每个组分为20ml，洗脱的同时采用薄层层析色谱(TLC Silicagel60 F254 Merck KgaA，Germany)收集相同的成分，得到8个组分，依次为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8；
C.对组分F1-F8进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，具体实验方法如实施例3和实施例4所描述。发现F3组分(198mg)为棕色，具有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性，同时也具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。具体活性数据如表1所示，其中，活性数据是分别在组分F1-F8浓度为25μg/ml条件下测得。
表1组分F1-F8的活性
Figure BDA0001573864990000081
其中，“—”表示不具有该活性。
D.对C中获得的F3继续用2.0×18cm的硅胶柱(60目)进行层析。流动相为500ml的8：2(V/V)的己烷-丙酮，洗脱的同时采用薄层层析色谱(TLC Silica gel 60 F254 MerckKgaA，Germany)收集相同的成分，得到7个组分，依次为F3.1、F3.2、F3.3、F3.4、F3.5、F3.6和F3.7；
E.对F3.1-F3.7进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，具体实验方法如实施例3和实施例4所描述。其中组分F3.2(128.8mg)，具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性和很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。具体活性数据如表2所示，其中，活性数据是分别在组分F3.1-F3.7浓度为25μg/ml条件下测得。
表2组分F3.1-F3.7的活性
Figure BDA0001573864990000082
Figure BDA0001573864990000091
其中，“—”表示不具有该活性。
F.对E步骤中获得的3.2继续通过2.0×18cm的硅胶柱(60目)进行层析，以己烷-丙酮的体积比分别为9:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱(TLC Silica gel 60F254Merck KgaA，Germany)收集相同的成分，得到8个组分，依次为F3.2.1、F3.2.2、F3.2.3、F3.2.4、F3.2.5、F3.2.6、F3.2.7和F3.2.8。
通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，具体实验方法如实施例3和实施例4所描述。其中，仅F3.2.2(100.1mg)同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。具体的，F3.2.2乙酰胆碱酯酶抑制活性为36.9％、α-葡萄糖苷酶抑制活性91.5％。其中，活性数据是在天然吲哚浓度为25μg/ml条件下测得。
通过核磁共振技术对F.3.2.2进行结构分析，确定它就是吲哚。
实施例2吲哚的结构确定
利用2D-NMR(核磁共振技术)(BRUKER AVANCE 500MHz)，鉴定了实施例1中的F3.2.2的结构。其中，图1为H-NMR图谱，图2为13C-NMR图谱，图3为HMBC图谱，图4为HSQC图谱，图5为cosy-1图谱，图6为cosy-2图谱。
经结构解析，本发明制备得到的吲哚的结构式为：
Figure BDA0001573864990000092
实施例3吲哚的乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测
实验设置样品组(粗提物或各步骤收集到的组分)、样品本底组、空白组、空白本底组。在96孔板中依次加入40μL of 0.02mol/L PBS(pH7.4)、10μL样品、20μL of 10mM ATCI、10μL of 0.22U/mL AChE(enzyme)，37℃孵育20min，加入20μL 4％SDS终止反应，加入100μLof DTNB显色。用全波长酶标仪在405nm波长处测定吸光度，以石杉碱甲作为阳性对照，重复3次取平均值。
Figure BDA0001573864990000101
式中：A样底为样品本底组(用pH7.4的PBS替代酶溶液)的吸光度；A空为空白组(用pH7.4的PBS替代样品)的吸光度；A空底为空白本底组(用pH7.4的PBS替代空白组中的酶溶液)的吸光度。
实施例4吲哚的α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测
反应设置样品组(粗提物或各步骤收集到的组分)、样品空白组、阴性对照组和空白对照组。在96孔板中依次加入90μLPBS缓冲液(pH 6.8)、20μL 0.57U/mLα-葡萄糖苷酶、10μl 3mmol/L谷胱甘肽溶液、20μL样品，37℃恒温反应15min后加入10mmol/L PNPG 40μL，37℃恒温反应15min。于405nm波长处测定吸光度(A样)，每个样品平行测定3次。同时设定相同条件下样品空白组(A样空，α-葡萄糖苷酶用PBS缓冲液代替酶所占体积)，阴性对照组(A阴，反应体系中样品用PBS代替)，空白对照组(A空，样品和酶用PBS替代)以及以阿卡波糖为抑制剂的阳性对照组(A阳)。按照下式计算α-糖苷酶活性抑制率，并求出相应IC50值。
Figure BDA0001573864990000102
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种吲哚的制备方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
步骤1、提供新喀里多尼亚菌的发酵液，其中，所述新喀里多尼亚菌的保藏编号为CCTCCNO：M 2017802；
步骤2、将发酵液用有机溶剂进行萃取，得到粗提物；
步骤3、将粗提物用硅胶柱进行层析，以100%的己烷、体积比为6.5~7：3~3.5的己烷-乙酸乙酯、体积比为4.5~5.5：4.5~5.5的己烷-乙酸乙酯、100%的乙酸乙酯、体积比为6.5~7：3~3.5的乙酸乙酯-甲醇、体积比为4.5~5.5：4.5~5.5乙酸乙酯-甲醇、100%的甲醇作为洗脱剂依次洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8；
步骤4、将制备得到的F3用硅胶柱进行层析，以体积比为7.5~8.5：1.5~2.5的己烷-丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到7个组分，依次为F3.1、F3.2、F3.3、F3.4、F3.5、F3.6和F3.7；
步骤5、将制备得到的F3.2用硅胶柱进行层析，以己烷-丙酮的体积比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱的同时采用薄层层析色谱收集相同的成分，得到8个组分，依次为F3.2.1、F3.2.2、F3.2.3、F3.2.4、F3.2.5、F3.2.6、F3.2.7和F3.2.8；其中的组分F3.2.2即为所述吲哚。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所述发酵液的制备方法为：将所述新喀里多尼亚菌接种到液体培养基中，28℃~30℃培养10~14天，离心收获上清，即得所述发酵液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述有机溶剂与所述发酵液的体积比为1：0.5~1.5；萃取的次数为1~3次，萃取的时间为12~36小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，萃取的时间为24小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，萃取后收集有机相，在40℃~45℃的条件下进行干燥，即得所述粗提物。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3中，以100%的己烷、体积比为7:3的己烷-乙酸乙酯、体积比为5:5的己烷-乙酸乙酯、100%的乙酸乙酯、体积比为7:3乙酸乙酯-甲醇、体积比为5:5乙酸乙酯-甲醇、100%的甲醇作为洗脱剂依次洗脱；
在步骤4中，以体积比为8：2的己烷-丙酮作为洗脱剂进行洗脱。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3中所用的硅胶柱为60目，在步骤4中所用的硅胶柱为60目，在步骤5中所用的硅胶柱为60目。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3中，通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，F3同时具有乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性；
在步骤4中，通过对所收集得到7个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，仅F3.2同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性；
在步骤5中，通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，仅F3.2.2同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤3中，通过对所收集得到8个组分进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析，在同时具有乙酰胆碱抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分中，F3的乙酰胆碱抑制活性按照乙酰胆碱抑制活性由大到小的顺序排列为第二位；F3的α-葡萄糖苷酶抑制活性按照α-葡萄糖苷酶抑制活性由大到小的顺序排列为第二位。
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