CN112107602B - 一对含双氮生物碱对映体及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体地说是一对深海沉积物真菌来源的含双氮生物碱对映体的制备方法及其应用。其具体结构式如（I）所示，制备方法为将深海沉积物来源的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13‑37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经过分离纯化，即为式（I）所示的一对含双氮生物碱对映体（R）和（S）。本发明获得的一对含双氮生物碱对映体对肿瘤细胞具有抑制作用，同时该化合物还具有抑菌的活性。

Description

一对含双氮生物碱对映体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是一对深海沉积物真菌来源的含双氮生物碱对映体的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤一直对人类的健康具有严重的威胁，虽然临床被批准了很多药物用于肿瘤细胞治疗，但相当一部分药物具有严重的副作用。因此，越来越多科学家把目光投入到具有独特环境的海洋中，特别是低温低氧黑暗的深海，以期望发现具有良好的抑制肿瘤细胞效果且副作用较少的化合物。其中，生物碱类化合物作为一种具有极高生物活性的天然产物,在抑制肿瘤细胞增殖和抑菌方面的潜力也逐渐显现出来。
深海沉积物来源真菌次级代谢产物具有针对性强、活性显著且结构新颖的优点，能够为科学家在制备抑菌剂及新药结构修饰和合成方面提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一对含双氮生物碱对映体及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一株草酸青霉菌的应用，所述菌株在作为抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
一株草酸青霉菌的应用，所述菌株在制备含双氮生物碱对映体中的应用。
一种含双氮生物碱对映体，含双氮生物碱对映体为R或S，结构式如式（I）所示，即手性位点为12.
Figure 419094DEST_PATH_IMAGE001
（I）。
一种含双氮生物碱对映体的制备方法，将深海沉积物来源的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式（I）所示的含双氮生物碱对映体；所述的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.19913；
Figure 702308DEST_PATH_IMAGE002
（I）。
具体制备步骤：
1）将草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37接种于真菌培养基中，发酵10-60天，之后经有机溶剂提取并浓缩，得到其粗提物；
2）取步骤1）中获取的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3）收集步骤2）中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、高效液相色谱反相柱和高效液相色谱手性柱，即得如式（I）所示对一对含双氮生物碱对映体。
步骤1）中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基；
有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种；其中几种物质以任意比例混合。
步骤２）中洗脱液为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
步骤３）所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:3的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；高效液相色谱反相柱流动相为体积比为10-0:3的水-甲醇或水-乙腈，洗脱流速为1-3毫升/分钟，截留10-60分钟组分；
高效液相色谱手性柱流动相为体积比10-0:3的正己烷-乙醇或正己烷-异丙醇，洗脱流速为1-2毫升/分钟，截留5-13.5分钟组分即得目标产物1（R）；截留14-30分钟组分即得目标产物2（S）。
一种含双氮生物碱对映体的应用，所述的一对含双氮生物碱对映体在制备抑制肿瘤细胞增殖方面药物中的应用。
所述一对含双氮生物碱对映体用于制备抑菌剂中的应用。
本发明具有以下优点：本发明的一对含双氮生物碱对映体是通过分离于深海沉积物来源的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37，经发酵提取、分离纯化获得一对含双氮生物碱对映体，对映体具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，同时还具有抑菌的活性。
具体实施方式：
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37的获取：
1、菌株的分离：
将深海沉积物样品用无菌海水进行梯度稀释，分离稀释度采用10-4-10-6，再各取0.2、0.4、0.6、0.8毫升分别涂布于PDA培养基、PSA培养基、YM培养基和查氏培养基。于28摄氏度培养5-30天，进行真菌菌落观察。根据平板上菌落形态特征等不同，进行平板划线纯化培养。
2、菌株的鉴定 :
2.1、形态学及生理生化特征鉴定：
该菌株生物学特性，在PDA培养基上，28摄氏度恒温培养时，菌落呈墨绿色绒状，具有较为浓密孢子块，生长较快，初步鉴定为青霉。
2.2、分子鉴定：
提取并克隆该菌种核糖体rDNA基因转录间隔序列进行基因测序，得到基因序列如下：
CCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC，经过检索对比，将菌株13-37确定为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。
实施例2
深海沉积物来源的一对含双氮生物碱对映体的结构如式（I）所示，
Figure 259191DEST_PATH_IMAGE003
（I） 。
该对含双氮生物碱对映体具有以下理化特性：
目标产物1（R）:无色油状；比旋光度[α]28 D =168.6 (c 0.04, MeOH)
目标产物2（S）:无色油状；比旋光度[α]28 D =-175.7 (c 0.05, MeOH)
该对含双氮生物碱对映体的NMR数据如下：
核磁共振氢谱（DMSO-d 6，500 MHz）δ H 8.01 s, 8.12 dd (7.9,1.2), 7.55 dd(7.9,7.1), 7.83 ddd (8.1,7.1,1.2), 7.62 d (8.1), 5.41 dd (11.1,4.9), 3.41 dd(14.3,4.9), 3.32 dd (14.3,11.1), 6.87 d (8.4), 6.54 d (8.4), 6.54 d (8.4),6.87 d (8.4), 3.69 s；核磁共振碳谱（DMSO-d 6，125 MHz）δ C 147.2 CH, 159.9 C, 121.1C, 126.1 CH, 127.4 CH, 134.8 CH, 127.2 CH, 147.4 C, 169.3 C, 60.4 CH, 33.3CH2, 126.1 C, 129.8 CH, 115.3 CH, 156.2 C, 115.3 CH, 129.8 CH, 52.6 CH3。
实施例3
如式（I）所示的含双氮生物碱对映体的制备方法：
取平板上生长良好的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37，接种于大米固体培养基中，每1升三角瓶中放50克大米固体培养基，50毫升蒸馏水，50毫升海水，共200瓶,室温静止发酵30天，而后用体积比为1：:1的二氯甲烷-甲醇萃取三次，减压浓缩后得粗提物536克。
所述大米固体培养基组成为每升含大米500克，葡萄糖20克，蛋白胨6克，酵母膏5克，味精3克和NaBr 1克。
草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19913,分类命名为Penicillium oxalicum，株号为13-37。
将粗提物经100-200目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙酸乙酯和20:1、10:1、5:1、2:1到0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，得到12段洗脱液，收集各段洗脱液，再用薄层层析（TLC）检测各段组分(体积比50-1:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸和碘显色)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分（1-8）。
将Rf值为0.6-0.7（体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色）的组分7，即以体积比20:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱、SephadexLH-20凝胶柱、高效液相色谱反相柱和高效液相色谱手性柱。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积比2:3的水-甲醇，TLC检测（体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开，有碘显色，茴香醛-硫酸不显色），收集茴香醛-硫酸不显色但具有碘显色的组分；收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇，TLC检测（体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸不显色，碘显色），收集收集茴香醛-硫酸不显色但具有碘显色的组分；收集组分再经高效液相反相柱制备，流动相为体积比7:3的水-乙腈，流速为1.8毫升/分钟，收集保留时间为25-30分钟的样品，即得到式（I）所示一对化合物（3.8毫克）。再经高效液相手性柱，流动相为体积比7:3的正己烷-乙醇，流速为1毫升/分钟，收集11.5-13.5分钟的样品即得目标产物1（R），收集14-16分钟的样品即得目标产物2(S)。经薄层层析检测（体积比10:1二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸不显色，碘显色），碘显色均呈单个。通过解析其波谱数据，其结构鉴定为一对含双氮生物碱对映体对映异构体，结构式如（I）所示，
Figure 198329DEST_PATH_IMAGE004
（I）。
实施例4
与实施例3不同之处在于
取平板上生长良好的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37菌种，切成小块并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共200瓶，室温静止发酵30天，而后用二氯甲烷提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物180克。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基组成为每升含200克马铃薯块茎的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，海水500毫升。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(体积比50-0:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色)， 根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分（1-8）。
将Rf值为0.6-0.7（体积比5:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色）的组分4，即以体积比10:1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和制备薄层层析分离。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的水-乙醇，TLC检测（体积比5:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸不显色，碘显色），收集茴香醛-硫酸不显色但碘显色的组分；收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，TLC检测（体积比5:1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸不显色，碘显色），收集收集茴香醛-硫酸不显色但碘显色的组分；收集组分经高效液相反相柱，体积比为2:3的水-甲醇为流动相，流速为1.8毫升/分钟，收集保留时间为20-25分钟的组分，得式（I）所示对一对含双氮生物碱对映体；再经高效液相手性柱，流动相为体积比7:3的正己烷-乙醇，流速为1毫升/分钟，收集11.5-13.5分钟的样品即得目标产物1（R），收集14-16分钟的样品即得目标产物2(S)。
实施例5
肿瘤细胞毒活性实验：
具体为: 活化供试细胞后，将细胞稀释至一定的浓度（约5×104个/毫升），取96孔板，配置样品组、对照组和空白组各设5个平行，样品组和对照组每孔加100微升含有肺癌细胞的培养基，空白组加100微升不含肺癌细胞的培养基，将培养板在培养箱预培养24小时（37摄氏度，5% CO2条件下）。将样品上述实施例获得的一对含双氮生物碱对映体化合物或经分离获得目标产物1（R）或经分离获得目标产物2（S）分别溶于二甲基亚砜（DMSO）中，分别配成1摩尔/升的溶液，再用细胞的完全培养基溶液依次对化合物进行稀释，最终分别得到10组浓度依次降低的组分（100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25、0.1微摩尔/升）。样品组分别加10微升浓度不同的一对含双氮生物碱对映体化合物或目标产物1（R）或目标产物2（S）化合物溶液，对照组和空白组加10微升二甲基亚砜（DMSO）。供试细胞为肿瘤细胞A549。将加了样品的96孔板在培养箱培养24小时，取出并向每孔加入10微升CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内培养1小时。用酶标仪测定在450纳米处的吸光度。计算抑制率，并取细胞抑制率在0-100之间至少5个浓度梯度，计算IC50值。
实验结果：上述获得的一对含双氮生物碱对映体混合物对肺肿瘤细胞A549的半数抑制浓度为2.5微摩尔/升。上述获得的含双氮生物碱1（R）和2(S)对肺肿瘤细胞A549的半数抑制浓度分别为2.5微摩尔/升和1.4微摩尔/升。说明它们对肿瘤细胞A549具有抑制作用。
实施例6
抑菌活性实验
具体为: 上述实施例获得一对含双氮生物碱化合物或经分离获得目标产物1（R）或经分离获得目标产物2（S）作为样品，将各样品溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，分别配置成浓度为4毫克/毫升的溶液。活化供试菌株，将菌液稀释至1.0×106CFU/毫升，分别用无菌棉签将菌悬液均匀涂于培养基上。取5微升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上（20微克/滤纸片），并用加有相同体积DMSO的滤纸片做阴性对照，用氯霉素作为阳性对照，每组设置三个平行。其中，实验所用的细菌培养基为LB培养基或2216E细菌培养基，供试细菌为柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌。最后将加有样品的平板培养基置于37℃培养箱，培养24小时，观察实验结果，测量抑菌圈的大小。
实验结果：上述获得的一对含双氮生物碱对映体化合物对柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌的抑菌圈直径分别为7.5毫米、7.6毫米、13.0毫米、7.2毫米和11.2毫米，具有抑制柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌的活性；上述获得的上述获得的含双氮生物碱1（R）对柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌的抑菌圈直径分别为7.6毫米、7.6毫米、13.0毫米、7.3毫米和11.3毫米；上述获得的上述获得的含双氮生物碱2（S）对柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌的抑菌圈直径分别为7.3毫米、7.6毫米、13.0毫米、7.0毫米和11.0毫米，他们两者均具有抑制柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌和副溶血弧菌的活性。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 一对含双氮生物碱对映体及其制备和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 515
<212> DNA
<213> 人工设计(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaacctccc acccgtgttt atcgtacctt gttgcttcgg cgggcccgcc tcacggccgc 60
cggggggcat ccgcccccgg gcccgcgccc gccgaagaca cacaaacgaa ctcttgtctg 120
aagattgcag tctgagtact tgactaaatc agttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 180
ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 240
tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt attccggggg gcatgcctgt 300
ccgagcgtca ttgctgccct caagcacggc ttgtgtgttg ggctctcgcc ccccgcttcc 360
ggggggcggg cccgaaaggc agcggcggca ccgcgtccgg tcctcgagcg tatggggctt 420
cgtcacccgc tctgtaggcc cggccggcgc ccgccggcga acaccatcaa tcttaaccag 480
gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaac 515

Claims (9)

1.一株草酸青霉菌的应用，其特征在于：所述草酸青霉菌在制备含双氮生物碱对映体中的应用；
所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.19913，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述含双氮生物碱对映体为R或S，结构式如式（I）所示
Figure 640009DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种含双氮生物碱对映体，其特征在于：含双氮生物碱对映体为R或S，结构式如式（I）所示
Figure 307751DEST_PATH_IMAGE002
。
3.一种权利要求2所述的含双氮生物碱对映体的制备方法，其特征在于：将深海沉积物来源的真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式（I）所示的含双氮生物碱对映体；所述的草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37于2020年6月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.19913；
Figure 570105DEST_PATH_IMAGE003
。
4.按权利要求3所述的含双氮生物碱对映体的制备方法，其特征在于具体制备步骤：
1）将草酸青霉（Penicillium oxalicum）13-37接种于真菌培养基中，发酵10-60天，之后经有机溶剂提取并浓缩，得到其粗提物；
2）取步骤1）中获取的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3）收集步骤2）中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、高效液相色谱反相柱和高效液相色谱手性柱，即得如式（I）所示的含双氮生物碱对映体。
5.按权利要求4所述的含双氮生物碱对映体的制备方法，其特征在于：步骤1）中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基；
有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。
6.按权利要求5所述的含双氮生物碱对映体的制备方法，其特征在于：步骤２）中洗脱液为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
7.按权利要求5所述的含双氮生物碱对映体的制备方法，其特征在于：步骤３）所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:3的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；高效液相色谱反相柱流动相为体积比为10-0:3的水-甲醇或水-乙腈；高效液相色谱手性柱流动相为体积比10-0:3的正己烷-乙醇或正己烷-异丙醇。
8.一种权利要求3所述的含双氮生物碱对映体的应用，其特征在于：所述式（I）所示的含双氮生物碱对映在制备抑制肿瘤细胞增殖方面药物中的应用；
所述肿瘤细胞为肿瘤细胞A549。
9.按权利要求3所述的含双氮生物碱对映体的应用，其特征在于：所述式（I）所示的含双氮生物碱对映在制备抑菌剂中的应用；
所述菌为柠檬假单胞菌、金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、灿烂弧菌或副溶血弧菌。
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