CN108949610B - 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用 - Google Patents

一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108949610B
CN108949610B CN201810566251.4A CN201810566251A CN108949610B CN 108949610 B CN108949610 B CN 108949610B CN 201810566251 A CN201810566251 A CN 201810566251A CN 108949610 B CN108949610 B CN 108949610B
Authority
CN
China
Prior art keywords
streptomyces
compound
methanol
angucycline
ratio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810566251.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108949610A (zh
Inventor
李玉梅
李亚美
李强
张华�
鲍洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Jinan
Original Assignee
University of Jinan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Jinan filed Critical University of Jinan
Priority to CN201810566251.4A priority Critical patent/CN108949610B/zh
Publication of CN108949610A publication Critical patent/CN108949610A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108949610B publication Critical patent/CN108949610B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/32—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用。所述链霉菌为Streptomyces dengpaensis XZHG99，于2018年5月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16347。本发明提供的链霉菌能发酵产生较高含量的angucycline类化合物，尤其是能产生新型angucycline类抗肿瘤活性化合物grincamycins L、M和N，它们可作为医用抗肿瘤药物；本发明所提供的制备方法简单、高效、所得化合物纯度高。本发明在制备抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制 备与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用。
背景技术
链霉菌属是放线菌目中最庞大的成员，为革兰氏阳性、好氧、丝状菌，广泛分布于自然环境中，产生多种生物活性的次级代谢产物，如抗生素、维生素、酶制剂、酶抑制剂等。据统计，临床抗生素有60%以上来自链霉菌。近年来研究发现存在于低氧、盐碱、极寒、高温、干旱等特殊生境中的链霉菌具有代谢产物特殊、化学结构新颖、生物活性强等作为药用资源的巨大潜力。
Angucyclines是一类具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、酶抑制、血小板凝集抑制及免疫抑制等多种生物活性的芳香多聚酮类化合物。目前已发现的angucycline类化合物有landomycins, urdamycins, jadomycins, gilvocarcin, ravidomycins, chrysomycins,oviedomycins, gaudimycins, azicemicins, kinamycins, hatomarubigins,saquayamycins 和 BE-7585A等。其独特的化学结构及其广泛的生物活性备受药物研发工作者的青睐。
发明内容
本发明目的在于提供一种链霉菌。
本发明还提供了一种以链霉菌产生的angucycline类化合物。
本发明还提供了一种上述以链霉菌产生的angucycline类化合物的制备与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种链霉菌，该链霉菌为Streptomyces dengpaensis XZHG99，于2018年5月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16347。
本发明还提供了一种上述链霉菌产生的angucycline类化合物，化合物结构式如式（
Figure 619183DEST_PATH_IMAGE001
）所示的grincamycins L（1）、M（2）和N（3）；
Figure 349373DEST_PATH_IMAGE002
（
Figure 191427DEST_PATH_IMAGE001
）。
本发明还提供了一种以链霉菌产生的angucycline类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将链霉菌Streptomyces dengpaensis XZHG99接种于含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基中发酵；将发酵液和菌体固液分离，其中发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，再用40～50 °C水浴旋转蒸发得到发酵液萃取物浸膏；菌体经70%～90%丙酮水溶液浸提三次，将浸提液用40～50 °C水浴旋转蒸发去除丙酮，再用乙酸乙酯萃取得到菌体浸提物浸膏;
（2）将发酵液萃取物浸膏和菌体浸提物浸膏合并，采用正相硅胶柱A分离，按照二氯甲烷：甲醇（v/v）比为100：0 – 0：100梯度洗脱，收集所有不同体积比的二氯甲烷-甲醇（v/v）的洗脱组分，通过薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）分析获得浸膏中所含化合物的色谱馏分;
（3）将上述所得的色谱馏分采用正相硅胶柱B进一步分离，按照二氯甲烷：丙酮（v/ v）比为100：0 – 0：100梯度洗脱，收集所有不同体积比的二氯甲烷-丙酮（v/v）的洗脱组分，通过TLC分析获得含angucycline类化合物的色谱馏分，编号为Fr. 3-1 – Fr. 3-6;
（4）将色谱馏分Fr. 3-4采用Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，按照甲醇：二氯甲烷（v/v）比为1：1等度洗脱，收集甲醇-二氯甲烷洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用乙腈：水（v/v）比为70：30的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为27.3 min的色谱峰即得到grincamycin L（1）;
（5）将色谱馏分Fr. 3-5采用Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，按照甲醇：二氯甲烷（v/v）比为1：1等度洗脱，收集到四个甲醇-二氯甲烷洗脱组分，将其中含量最大的组分再用反相HPLC进行纯化，用甲醇：水（v/v）比为77：23的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为14.6 min的色谱峰即得到grincamycin M（2）;
（6）将色谱馏分Fr. 3-3采用反相中压色谱进行纯化，按照甲醇：水（v/v）比为100：0 – 0：100梯度洗脱，收集甲醇-水洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用甲醇：水：冰醋酸（v/v/v）比为95：5：0.05的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为13.6 min的色谱峰即得到grincamycin N（3）。
进一步的，步骤（1）中，将链霉菌Streptomyces dengpaensis XZHG99经淀粉酪素培养基活化后接种于含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基中发酵培养5～10 d，温度为25～35 °C，转速为120～200 rpm。
本发明所使用的含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基为，可溶性淀粉3～10 g，干酪素0.1～0.5 g，KNO3 0.02～0.08 g，MgSO4·7H2O 0.02～0.08 g，K2HPO4·3H2O 1～5 g，CaCO3 0.01～0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001～0.003 g，人工珊瑚盐20～50 g，用蒸馏水配制1L，pH 7.0～8.0。
本发明还提供了一种上述以链霉菌产生的angucycline类化合物的应用，所述化合物可作为制备医药目的的抗肿瘤药物。
上述化合物可作为抗肺癌、乳腺癌或肝癌的药物。
本发明所述链霉菌，链霉菌的分类学命名为Streptomyces dengpaensis XZHG99，分离于中国西藏仲巴五沙漠，该菌株于2018年5月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16347。保藏单位地址为中国. 北京。
本发明的优点为：
（1）本发明提供了一种分离于中国西藏仲巴五彩沙漠的Streptomyces dengpaensis XZHG99，其能发酵产生较高含量的angucycline类化合物，尤其是能产生新型angucycline类抗肿瘤活性化合物grincamycins L、M和N，它们可作为医用抗肿瘤药物；
（2）本发明所提供的制备方法简单、高效、所得化合物纯度高。本发明在制备抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。
保藏信息
保藏时间：2018年5月26日
保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；
保藏编号：CGMCC NO.16347；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
分类命名：Stretomyces dengpaensis XZHG99
附图说明
图1为本发明实施例提供的Streptomyces dengpaensis XZHG99基于其16S rRNA基因序列构建的进化树。
图2为本发明实施例提供的Streptomyces dengpaensis XZHG99的扫描电镜图。
图3为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的HR-ESI-MS图。
图4为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的1H NMR（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图5为本发明实施例提供的化合物grincamycins L（1）的13C NMR（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图6为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的HSQC（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图7为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的1H-1H COSY（BrukerAV600，CDCl3）光谱图。
图8为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的HMBC（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图9为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的NOESY（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图10为本发明实施例提供的化合物grincamycin L（1）的红外光谱图。
图11为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的HR-ESI-MS图。
图12为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的1H NMR（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图13为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的13C NMR（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图14为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的HSQC（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图15为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的1H-1H COSY（BrukerAV600，CDCl3）光谱图。
图16为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的HMBC（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图17为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的NOESY（Bruker AV600，CDCl3）光谱图。
图18为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2））的红外光谱图。
图19为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的HR-ESI-MS图。
图20为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的1H NMR（Bruker AV600，pyridine-d 5）光谱图。
图21为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的13C NMR（Bruker AV600，pyridine-d 5）光谱图。
图22为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的HSQC（Bruker AV600，pyridine-d 5）光谱图。
图23为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的1H-1H COSY（BrukerAV600，pyridine-d 5）光谱图。
图24为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的HMBC（Bruker AV600，pyridine-d 5）光谱图。
图25为本发明实施例提供的化合物grincamycin M（2）的NOESY（Bruker AV600，pyridine-d 5）光谱图。
图26为本发明实施例提供的化合物grincamycin N（3）的红外光谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。
实施例 1 沙漠放线菌XZHG99的鉴定
放线菌XZHG99，分离于中国西藏仲巴五彩沙漠土壤（N 29°66' E 84°15'），于2018年5月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC NO.16347。
将菌株XZHG99液体培养48 h后，提取基因组DNA，采用通用引物进行16S rRNA基因序列的PCR扩增，PCR产物经电泳检测、纯化后进行测序，得到16S rRNA基因序列，提交GenBank数据库，获得登录号MG272441。上述16S rRNA基因序列比对分析结果显示，菌株XZHG99与Streptomyces albiflavescens n20 T和Streptomyces krungchingensis KC-035 T 的同源性最高分别达98.42%和98.14%。在进化树上XZHG99与上述2种菌株在同一分支上（图1）。DNA-DNA杂交分析显示XZHG99与上述2种菌株的基因组同源性分别为20%和22%。采用扫描电子显微镜形态观察（图2）、细胞成分化学分析、生理生化特征等多相学菌种鉴定方法，将XZHG99鉴定为链霉菌属的一个新成员，命名为Streptomyces dengpaensis XZHG99。
实施例2 菌株XZHG99发酵制备angucycline类化合物
1. 菌种活化：将菌株XZHG99用划线法接种于淀粉酪素平板上，30 °C恒温培养至出现大量孢子，收集孢子、制备孢子悬液，浓度为1010个/ml;
所述的淀粉酪素培养基为：可溶性淀粉5 g，干酪素0.3 g，KNO3 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4·3H2O 2 g，CaCO3 0.02 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，琼脂粉20 g，用蒸馏水配制1 L，pH 7.5；
2. 种子液的制备：将上述孢子悬液按照体积比1：100接种于淀粉酪素液体培养基中，30 °C，140 rpm 恒温摇床震荡培养48 h， 装液量为每500 ml三角瓶装150 ml培养基；
3. 液体发酵：用容量为500 ml的三角瓶，每瓶装含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基150 ml，115 °C 灭菌后，每瓶接种种子液7.5 ml, 30 °C，140 rpm 恒温摇床震荡培养7 d;
4. 粗提物浸膏的制备：将发酵物用布氏漏斗真空抽滤，分别收集发酵液和菌体；发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，再用48 °C水浴旋转蒸发得到发酵液萃取物浸膏；菌体经80%丙酮浸提三次，将浸提液用45 °C水浴旋转蒸发去除丙酮后用乙酸乙酯萃取得到菌体浸提物浸膏;
5.以甲醇：丙酮（v/v）比为8：2作为展开剂，硫酸乙醇为显色剂完成上述粗提物浸膏的TLC分析；用YMC反相C18分析柱（4.6 mm × 150 mm）完成粗提物浸膏的HPLC指纹图谱分析，检测波长为210 nm 和254 nm，梯度洗脱液为甲醇：水溶液，洗脱条件为：0.0 – 35.0min，5% – 100%; 35.1 – 45.0 min，100%; 45.1 – 50.0 min，100% – 5%; 50.1 – 60.0min，5%，流速为1.0 ml/min；发酵液萃取物和菌体浸提物的HPLC指纹图谱类似，因此，合并以上粗提物浸膏；
6. 硅胶柱色谱分离：将合并后的粗提物浸膏，用适量甲醇溶解，按浸膏与硅胶质量比1：1比例拌样；同时准备好100 – 200目的硅胶A层析柱，干法上样后，按照二氯甲烷：甲醇（v/v）比为100：0 – 0：100梯度洗脱，收集不同体积比的二氯甲烷-甲醇的洗脱组分，通过薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）分析获得浸膏中所含化合物的色谱馏分；然后将上述所得的色谱馏分采用正相硅胶柱B进一步分离，按照二氯甲烷：丙酮（v/v）比为100：0-0：100梯度洗脱，收集不同体积比的二氯甲烷-丙酮（v/v）的洗脱组分，通过TLC分析获得含angucycline类化合物的色谱馏分，编号为Fr. 3-1 – Fr. 3-6;
7. 反相中压色谱和HPLC纯化:
（1）将色谱馏分Fr. 3-4采用Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，按照甲醇：二氯甲烷（v/v）比为1：1等度洗脱，收集甲醇-二氯甲烷洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用乙腈：水（v/v）比为70：30的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为27.3 min的色谱峰即得到grincamycin L（1）;
（2）将色谱馏分Fr. 3-5采用Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，按照甲醇：二氯甲烷（v/v）比为1：1等度洗脱，收集到四个甲醇-二氯甲烷洗脱组分，将其中含量最大的组分再用反相HPLC进行纯化，用甲醇：水（v/v）比为77：23的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为14.6 min的色谱峰即得到grincamycin M（2）;
（3）将色谱馏分Fr. 3-3采用反相中压色谱进行纯化，填料为ODS，色谱柱规格20mm×70 mm，按照甲醇：水（v/v）比为100：0 – 0：100梯度洗脱，收集甲醇-水洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用甲醇：水：冰醋酸（v/v/v）比为95：5：0.05的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为13.6 min的色谱峰即得到grincamycin N（3）;
实施例3 angucycline类化合物的结构解析
化合物1为黄色粉末，HR-ESI-MS在m/z 561.1764 [M – H]–处给出分子离子峰（如图3所示），推测化合物的分子式为C31H30O10。对该化合物的紫外、NMR 1H （如图4所示）和13C谱图（如图5所示）分析发现该化合物属于线性四环蒽醌苷类化合物，与化合物grincamycins E 或 G 具有相同的母核结构，不同在于C-9位糖链的结构。通过二维HSQC（如图6所示）、1H-1H COSY（如图7所示）、 HMBC（如图8所示）和NOESY（如图9所示）的谱图分析，最终确定化合物的结构如式（
Figure 399685DEST_PATH_IMAGE001
）中所示。该化合物中C-9位与rhodinose形成了C苷键，这在该类化合物中为首次发现。化合物 L命名为grincamycin L（1），该化合物的1H和13C NMR（CDCl3）归属如表1所示、红外光谱图如图10所示。
化合物2为黄色粉末，HR-ESI-MS在m/z 593.2026 [M + H]+处给出分子离子峰（如图11所示），推测化合物的分子式为C32H32O11。对该化合物的紫外、NMR 1H（如图12所示） 和13C谱图（如图13所示）分析发现该化合物比现有化合物moromycin B多了一个甲氧基，少了一个芳香氢。通过二维HSQC（如图14所示）、1H-1H COSY（如图15所示）、 HMBC（如图16所示）和NOESY（如图17所示）的谱图分析，最终确定化合物的结构如式（
Figure 276374DEST_PATH_IMAGE001
）中所示，确定上述甲氧基位于C-5，由此鉴定化合物2为grincamycin M（2）。该化合物的1H和13C NMR（CDCl3）归属如表1所示、红外光谱图如图18所示。
化合物3为深红色粉末，HR-ESI-MS在m/z 559.1600 ([M – H]–)给出分子离子峰（如图19所示），推测化合物的分子式为C31H28O10。NMR 1H （如图20所示）和13C谱图（如图21所示）分析发现该化合物与galtamycin B具有相同的苷元结构，不同在于C-9位侧链。通过二维HSQC（如图22所示）、1H-1H COSY（如图23所示）、 HMBC（如图24所示）NOESY（如图25所示）的谱图分析，确定C-9位糖链的结构为α-cinerulose B-(1→4,2→3)-β-olivose，因此，最终确定化合物的结构如式（
Figure 708624DEST_PATH_IMAGE001
）中所示。化合物命名为grincamycin N（3），该化合物的1H和13CNMR（CDCl3）归属如表1所示、红外光谱图如图26所示。
表1 化合物1（grincamycin L）、2（grincamycin M）、3（grincamycin N）的1H和13CNMR（CDCl3）归属
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 851023DEST_PATH_IMAGE004
实施例4 化合物的生物活性测定
首先复苏人肺癌细胞株A549和H157、人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231、人肝癌细胞株HepG2备用。采用磺酰罗丹明B（SRB）比色法测定化合物的IC50，以长春瑞斌（Vinorelbine）作为阳性对照，以溶剂处理的肿瘤细胞为空白对照。将传代培养好的细胞用培养基配成细胞悬液，浓度为5×104个/ml，按每孔100 μl传代于96孔培养板（每孔5000个细胞），置于二氧化碳培养箱中37 °C培养24 h。将上述实施例制备所得化合物grincamycins L、M、N和对照化合物Vinorelbine用培养基配制为不同浓度药物，每药设7个剂量组，分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μM，每组设三个平行孔，每孔加含药培养基100 μl。空白对照组加入等体积的溶剂，37 °C培养48 h判断结果。如表2所示，化合物grincamycins L、M、N对不同类型的肿瘤细胞都表现出良好的抑制活性。
表2 三种化合物的IC50
Figure DEST_PATH_IMAGE005

Claims (4)

1.一种链霉菌产生的angucycline类化合物在制备抗肺癌、乳腺癌或肝癌的药物中的应用，其特征在于，所述angucycline类化合物如式（Ⅰ）所示的grincamycins L（1）和N（3）；
Figure 749813DEST_PATH_IMAGE001
；
所述链霉菌为Streptomyces dengpaensis XZHG99，于2018年5月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16347。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述angucycline类化合物的制备方法具体包括以下步骤：
（1）将链霉菌Streptomyces dengpaensis XZHG99接种于含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基中发酵；将发酵液和菌体固液分离，其中发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，再用40～50 ℃水浴旋转蒸发得到发酵液萃取物浸膏；菌体经70%～90%丙酮水溶液浸提三次，将浸提液用40～50 ℃水浴旋转蒸发去除丙酮，再用乙酸乙酯萃取得到菌体浸提物浸膏；
（2）将发酵液萃取物浸膏和菌体浸提物浸膏合并，采用正相硅胶柱A分离，按照二氯甲烷：甲醇v/v比为100：0–0：100梯度洗脱，收集所有不同体积比的二氯甲烷-甲醇v/v的洗脱组分，通过薄层层析TLC和高效液相色谱HPLC分析获得浸膏中所含化合物的色谱馏分；
（3）将上述所得的色谱馏分采用正相硅胶柱B进一步分离，按照二氯甲烷：丙酮v/v比为100：0–0：100梯度洗脱，收集所有不同体积比的二氯甲烷-丙酮v/v的洗脱组分，通过TLC分析获得含angucycline类化合物的色谱馏分，编号为Fr. 3-1–Fr. 3-6；
（4）将色谱馏分Fr. 3-4采用Sephadex LH-20色谱柱进行分离纯化，按照甲醇：二氯甲烷v/v比为1：1等度洗脱，收集甲醇-二氯甲烷洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用乙腈：水v/v比为70：30的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为27.3min的色谱峰即得到grincamycin L（1）；
（5）将色谱馏分Fr. 3-3采用反相中压色谱进行纯化，按照甲醇：水v/v比为100：0–0：100梯度洗脱，收集甲醇-水洗脱液，将收集的组分再用反相HPLC进行纯化，用甲醇：水：冰醋酸v/v/v比为95：5：0.05的流动相等度洗脱，流速为3.0 ml/min，收集保留时间为13.6 min的色谱峰即得到grincamycin N（3）。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，将链霉菌Streptomyces dengpaensis XZHG99经淀粉酪素培养基活化后接种于含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基中发酵培养5～10 d，温度为25～35 ℃，转速为120～200 rpm。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的含人工珊瑚盐的淀粉酪素液体培养基为，可溶性淀粉3～10 g，干酪素0.1～0.5 g，KNO3 0.02～0.08 g，MgSO4·7H2O 0.02～0.08 g，K2HPO4·3H2O 1～5 g，CaCO3 0.01～0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001～0.003 g，人工珊瑚盐20～50 g，用蒸馏水配制1 L，pH 7.0～8.0。
CN201810566251.4A 2018-06-05 2018-06-05 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用 Active CN108949610B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810566251.4A CN108949610B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810566251.4A CN108949610B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108949610A CN108949610A (zh) 2018-12-07
CN108949610B true CN108949610B (zh) 2022-06-03

Family

ID=64493094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810566251.4A Active CN108949610B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108949610B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115287236B (zh) * 2022-08-15 2023-08-11 安徽农业大学 一类昆虫共生放线菌来源的生物碱化合物的制备方法和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436458A (zh) * 2013-04-24 2013-12-11 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436458A (zh) * 2013-04-24 2013-12-11 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种链霉菌和以链霉菌产生的spiroteteronate类化合物及其制备和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antifungal substances from Streptomyces sp. A3265 antagonistic to plant pathogenic fungi;Nguyen Van Minh et al.;《Mycobiology》;20150930;第43卷(第3期);第333-338页 *
CGMCC No.4.7472;CGMCC;《CGMCC》;20180208;第1页 *
GenBank:AVH61776.1;Yumei L et al.;《GenBank》;20180222;第1-2页 *
GenBank:CP026653.1;Yumei L et al.;《GenBank》;20180222;第1-39页 *
GenBank:MG272441.1;Yumei,L.et al.;《GenBank》;20171101;第1-2页 *
宁南霉素产生菌的选育和发酵条件研究;胡厚芝等;《微生物学报》;19931231;第33卷(第6期);第446-453页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108949610A (zh) 2018-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3140228B2 (ja) 新規な大環状ラクトンおよびその生産菌
CN102807955B (zh) 一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株
CN108949610B (zh) 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用
EP0182152A2 (en) Antitumor antibiotics (LL-E33288 Complex)
JPH04352783A (ja) １２員環マクロライド系化合物
CN108374028B (zh) 一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法
CN105002106B (zh) 平板霉素和平板素的高产工程菌株及其发酵和分离纯化工艺
CN108660093B (zh) 一种海洋链霉菌、衣霉素类化合物及其制备方法
CN107674891B (zh) 一种从球毛壳菌中提取嗜氮酮类化合物的方法
CN107382863B (zh) 三烯霉素类化合物、制备方法及治疗前列腺癌的应用
CN115109023A (zh) 大环内酯类化合物fwyz52-a、其发酵菌株、发酵方法及应用
CN111748489B (zh) 海洋灰平链霉菌hn60及其应用
CN102351859B (zh) 抗生素Pseudonocardian A和B及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用
CN112300243B (zh) 一种环肽化合物及其制备方法和应用
CN111808112B (zh) 一种Pratensilin D化合物及其制备和应用
CN114907367A (zh) 大环内酯类化合物fw-z、其发酵菌株、发酵方法及应用
CN107686492A (zh) 一种使用大孔吸附树脂提取纯化发酵液中红景天苷的方法
CN111588717A (zh) 两个四重内酯类抗生素作为抗mrsa药物的应用及其提取分离方法
CN108660169A (zh) 一种发酵制备棘孢菌素类抗生素的方法
CN110343639B (zh) 一株产15(s)-o-乙基雷帕霉素的链霉菌
CN105886421B (zh) 一株拟无枝菌酸菌及利用该菌制备特戊依罗霉素的方法
CN109576318B (zh) 一种从发酵液中提取无活菌素的方法
CN111285828B (zh) 化合物proximicin及其制备方法和应用
CN107964522B (zh) 海洋链霉菌dut11及其抗补体活性应用
CN107312014A (zh) 一种格菲罗霉素类化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant