CN108374028B - 一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法 - Google Patents

一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法，具体包括如下步骤：(1)配制真菌种子液；(2)化学表观遗传修饰剂的配制；(3)将步骤(2)配制的表观遗传修饰剂加入发酵培养基中，使得发酵培养基中表观遗传修饰剂的最终浓度为0.1μM‑50mM，将步骤(1)中配制的真菌种子液接入发酵培养基，于15‑25℃，静置培养25‑35天，得发酵物；(4)将步骤(3)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用乙酸乙酯提取，菌体用甲醇提取，合并提取液、蒸除溶剂得发酵提取物。

Description

一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化 合物产量的方法
技术领域
本发明属于海洋真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种利用化学表观遗传修饰提高海洋真菌中azaphilone类化合物产量的方法。
背景技术
近年来研究发现，真菌编码次级代谢产物的数量远远大于已经分离获得的化合物数量，表明真菌中某些表达次级代谢产物的基因是沉默的。为了发现更多的结构新颖、活性显著的次级代谢产物，必须想办法激活这些沉默基因。表观遗传修饰法在真菌沉默基因的激活和表达上具有重要作用。表观遗传修饰是在DNA序列没有发生变化的情况下改变基因的表达，主要通过组蛋白修饰、DNA的甲基化和非编码RNA调控等方式达到调控基因表达的目的。研究表明，真核生物的组蛋白乙酰化与去乙酰化、DNA的甲基化均可以影响染色质的状态，而染色质状态的改变可促进基因活化，促进基因转录子的启动，提高沉默基因的表达率，从而影响次级代谢产物的生物合成，增加发现新化合物的几率。近年来，化学表观遗传修饰法被广泛应用于真菌的代谢调控，以激活真菌处于沉默状态的基因簇，进而影响其次级代谢，诱导其产生新化合物或者提高已知化合物的产量。
发明内容
本发明海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年7月5日；保藏编号：CGMCC No.12762；分类命名：青霉Penicillium sp.。菌株保藏信息可参见，在先中国发明专利申请(申请号CN201610831163.3)。
本发明海洋真菌Penicillium sp.HK1-6来源于红树根际土壤(参见中国专利申请号：CN201610831163.3)。
发明人在先申请(中国专利申请号：CN201711417393.6)中记载了一种利用海洋真菌Penicillium sp.HK1-6制备penicilones A-D的方法，其中penicilones A-D(即化合物1-4)具有如下结构：
Figure BSA0000159418600000021
详细制备方法，可参见发明人在先申请(CN201711417393.6)或参见本发明具体实施方式中的记载。而且通过前期研究发现，penicilones A-D具有如下理化性质：penicilones A-D经TLC展开并经浓硫酸-香草醛显色后，均显示特征的黄色斑点；经HPLC-UV指纹图谱分析可知penicilones A-D的UV特征吸收峰位于220nm及340nm附近；penicilones A-D的结构类似物分子量应为500左右。
本发明提供一种增加海洋真菌Penicillium sp.HK1-6发酵提取物中化合物penicilones A-D产量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制真菌种子液：将真菌Penicillium sp.HK1-6菌株接入种子培养基，于20-28℃，摇床培养3～5天，得真菌种子液；
(2)化学表观遗传修饰剂的配制：将化学表观遗传修饰剂用蒸馏水配制成一定浓度的溶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；
(3)将步骤(2)配制的表观遗传修饰剂加入发酵培养基中，使得发酵培养基中表观遗传修饰剂的最终浓度为0.1μM-50mM，将步骤(1)中配制的真菌种子液接入发酵培养基，于15-25℃，静置培养25-35天，得发酵物；
(4)将步骤(3)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用乙酸乙酯提取，菌体用甲醇提取，合并提取液、蒸除溶剂得发酵提取物。
本发明所述种子培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的GPY培养基、或液体或固体的PDA培养基。
固体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。
液体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。
固体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。
液体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。
本发明所述的化学表观遗传修饰剂选自组蛋白去乙酰化酶抑制剂或DNA甲基化转移酶抑制剂，其中组蛋白去乙酰化酶抑制剂优选丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、伏立诺他(Vorinostat)、烟酰胺、丙戊酸钠、4-苯基丁酸、4-苯基丁酸钠、曲古抑菌素A(TSA)；DNA甲基化转移酶抑制剂优选5-氮杂胞苷(5-Aza-c)、5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)、RG-108、西奈芬净、地西他滨。
步骤(1)中所述摇床培养的转速为120-180转/分钟。
步骤(2)中所述微孔滤膜优选0.22μm的微孔滤膜。
步骤(3)中表观遗传修饰剂的最终浓度为优选0.5μM、1μM、10μM、5mM。
步骤(4)中乙酸乙酯和甲醇提取次数优选2-4次。
本发明所述的表观遗传修饰剂的最终浓度是指每升发酵培养基中含表观遗传修饰剂的摩尔数。
附图说明
图1是真菌Penicillium sp.HK1-6在丁酸钠(5mM)影响下发酵提取物的HPLC分析图
图2是真菌Penicillium sp.HK1-6在丁酸钠(5mM)影响下发酵提取物的HPLC-UV分析图
图3是真菌Penicillium sp.HK1-6在5-Aza-c(1μM)影响下发酵提取物的HPLC分析图
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)配制真菌种子液：首先将种子培养基倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板，然后将真菌菌株Penicillium sp.(HK1-6)接种于培养基平板中，在20℃下摇床培养5天，得真菌种子液，备用。其中种子培养基的配方为每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15g，海水素30g，琼脂12g；摇床培养转速为120转/分钟；
(2)化学表观遗传修饰剂的配制：将丁酸钠(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)用蒸馏水配制一定浓度的母液，用0.22μm的水相滤膜过滤除菌，备用；
(3)分别将不同体积的步骤(2)配制的丁酸钠母液加入5组发酵培养基中，使得5组发酵培养基中丁酸钠的最终浓度分别达到2.5、5、10、25和50mM，将步骤(1)中配制的真菌种子液分别接入上述含有5种不同浓度的丁酸钠的发酵培养基中，于20℃，静置培养28天，得发酵物；
(4)将步骤(3)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用乙酸乙酯提取2次，菌体用甲醇提取2次，合并提取液、蒸除溶剂得发酵提取物。
取少量步骤(4)得到的发酵提取物以适量的甲醇溶解，高速离心后取上清液进行TLC，HPLC-UV和HPLC-MS分析，经过分析发现，本发明比相同条件下不加表观遗传修饰剂的对照组产生更多的penicilones A-D，即通过在海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的发酵培养基中添加化学表观遗传修饰剂，使penicilones A-D的产量得到了很大的提高。
在丁酸钠添加组中，添加终浓度为5mM时，代谢变化最为显著(图1)；结合azaphilone类化合物的UV吸收特征及该条件下的HPLC-UV指纹图谱(图2)，可知该浓度下penicilones A-D的产量也显著提高(3-5倍)。丁酸钠添加浓度较低(2.5mM)或较高(10mM)时，也有相似的代谢变化，但不如5mM时显著；而浓度过高(25mM，50mM)时，penicilones A-D的产量均降低，推测高浓度丁酸钠可能对真菌生长产生了抑制作用。
实施例2
(1)配制真菌种子液：首先将种子培养基倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板，然后将真菌菌株Penicillium sp.(HK1-6)接种于培养基平板中，在28℃下摇床培养3天，得真菌种子液，备用。其中种子培养基的配方为每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，海水素40g；摇床培养转速为180转/分钟；
(2)化学表观遗传修饰剂的配制：将5-Aza-c(DNA甲基化转移酶抑制剂)用蒸馏水配制一定浓度的母液，用0.22μm的水相滤膜过滤除菌，备用；
(3)分别将不同体积的步骤(2)配制的5-Aza-c母液加入4组发酵培养基中，使得4组发酵培养基中5-Aza-c的最终浓度分别达到0.5，1，10和50μM，将步骤(1)中配制的真菌种子液分别接入上述含有4种不同浓度的5-Aza-c的发酵培养基中，于25℃，静置培养30天，得发酵物；
(4)将步骤(3)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用乙酸乙酯提取3次，菌体用甲醇提取1次，合并提取液、蒸除溶剂得发酵提取物。
取少量步骤(4)得到的发酵提取物以适量的甲醇溶解，高速离心后取上清液进行TLC，HPLC-UV和HPLC-MS分析，经过分析发现，本发明比相同条件下不加表观遗传修饰剂的对照组产生更多的penicilones A-D，即通过在海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的发酵培养基中添加化学表观遗传修饰剂，使penicilones A-D的产量得到了很大的提高。
5-Aza-c的添加对真菌中azaphilone类化合物的代谢也产生了较大的影响，特别是当添加浓度为1μM时(图3)，penicilones A-D的产量显著提高(3-5倍)。5-Aza-c的添加浓度过高时，该真菌产azaphilone类化合物的能力受到抑制。
实施例3
按照实施例1-2中记载的类似的方法，还可采用如下表所示的表观遗传修饰剂的添加方案。
Figure BSA0000159418600000051
实验结果表明，SAHA和5-Aza-dc的添加，均能增加penicilones A-D的产量，尤其是SAHA浓度为0.5和1μM以及5-Aza-dc为1和10μM时，penicilones A-D的产量显著提高，可增加4-6倍。
实施例4
(1)海洋真菌Penicillium sp.HK1-6菌种的培养
真菌Penicillium sp.(HK1-6)的菌种培养所用的培养基为固体PDA培养基(每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15g，海水素30g，琼脂12g)；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株Penicillium sp.(HK1-6)接种于培养基平板中，在25℃下摇床培养5天。
(2)海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的发酵
真菌Penicillium sp.HK1-6的发酵培养所用的发酵培养基为液体PDA培养基，每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，海水素35g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于15-20℃静置培养28天。
(3)发酵物中成分的初步分离
取步骤(2)所得的发酵物30L，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用甲醇浸提3～5次，减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏，先进行减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分Fr.1～Fr.10(即100％石油醚洗脱为组分Fr.1，80％石油醚洗脱为组分Fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为Fr.10)。
(4)Penicilones A-D(即化合物1-4)的分离提取
将步骤(3)得到的组分Fr.4先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂为MeOH∶H2O＝85∶15，最后得到penicilone D即化合物4(135mg)；组分Fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱HPLC制备(所用色谱柱为AgilentC18，9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15)，最后得到peniciloneB即化合物2(702mg)；组分Fr.8先经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂MeOH∶H2O＝75∶25，最后经高效液相色谱HPLC制备(所用色谱柱为Agilent C18，9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15)，分别得到penicilone A即化合物1(1.55g)和penicilone C即化合物3(121mg)。
Penicilone A(1)：HRESIMS m/z 497.2536(calcd for C29H37O7，497.2534)，519.2353(calcd for C29H36O7Na，519.2353)；Penicilone B(2)：HRESIMS m/z 479.2437(calcd for C29H35O6，479.2428)；Penicilone C(3)：HRESIMS m/z 531.2152(calcd forC29H36ClO7，531.2144)，553.1973(calcd for C29H35ClO7Na，553.1964)；Penicilone D(4)：HRESIMS m/z 513.2057(calcd for C29H34ClO6，513.2038)。Penicilones A-D的结构确证数据与中国专利申请号：CN201711417393.6中记载的一致。
实施例5Penicilones A-D的抗菌活性测试
按照文献方法(Pierce C.G.；Uppuluri P.；Teistan A.R.；Wormley Jr.F.L.；Mowat E.；Ramage G.；Lopez-ribot J.L.Nat.Protoc.2008，3，1494-1500)，测试6株革兰氏阳性菌：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌2株：S.aureus ATCC43300和S.aureus ATCC33591，敏感型金黄色葡萄球菌2株：S.aureus ATCC25923和S.aureus ATCC29213，耐万古霉素的粪肠球菌1株：E.faecalis ATCC51299，敏感型屎肠球菌1株：E.faecium ATCC35667；1株革兰氏阴性菌：大肠杆菌E.coli ATCC25922。化合物1-4对大肠杆菌E.coli ATCC25922没有明显抗菌效果，但是对革兰氏阳性菌，尤其是对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌：S.aureusATCC43300和S.aureus ATCC33591以及万古霉素耐药的粪肠球菌：E.faecalis ATCC51299均显示出很强的抗菌活性，其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)均小于或等于12.5μg/mL(表3中仅列出化合物2-4的详细抗菌活性数据)，尤其是化合物2对E.faecalis ATCC51299的MIC比阳性药万古霉素强一倍，显示出了将其开发作为抗耐药菌药物、药物先导化合物以及候选药物的良好前景。
表3本发明的化合物2-4的抗菌活性数据
Figure BSA0000159418600000081
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。本发明中所使用的中英文简称、代号等均可在参考文献或现有技术的技术手册、教科书、工具书中找到。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种增加海洋真菌Penicillium sp.HK1-6发酵提取物中化合物penicilones A–D产量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制真菌种子液：将真菌Penicillium sp.HK1-6菌株接入种子培养基，于20-28℃，摇床培养3～5天，得真菌种子液；
(2)化学表观遗传修饰剂的配制：将化学表观遗传修饰剂用蒸馏水配制成一定浓度的溶液，经微孔滤膜过滤除菌后备用；
(3)将步骤(2)配制的表观遗传修饰剂加入发酵培养基中，使得发酵培养基中表观遗传修饰剂的最终浓度在适宜范围，将步骤(1)中配制的真菌种子液接入发酵培养基，于15-25℃，静置培养25-35天，得发酵物；
(4)将步骤(3)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用乙酸乙酯提取，菌体用甲醇提取，合并提取液、蒸除溶剂得发酵提取物；
所述化合物penicilones A–D具有如下结构：
Figure FDA0002891244790000011
步骤(2)所述的化学表观遗传修饰剂选自丁酸钠、5-氮杂胞苷；
当化学表观遗传修饰剂选自丁酸钠时，步骤(3)中的适宜范围为2.5-10.0mM；当化学表观遗传修饰剂选自5-氮杂胞苷时，步骤(3)中的适宜范围为0.5-1.0μM；
所述真菌Penicillium sp.HK1-6的保藏编号为CGMCC No.12762。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的GPY培养基、或液体或固体的PDA培养基。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于培养基的配方如下：
固体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15-20g，海水素或粗海盐20-40g，琼脂12-20g；液体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15-20g，海水素或粗海盐20-40g；
固体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素或粗海盐20-40g，琼脂12-20g；液体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素或粗海盐20-40g。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述摇床培养的转速为120-180转/分钟。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中所述微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中乙酸乙酯和甲醇提取次数为2-4次。
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