CN109182409A - 一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，通过孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和柱色谱、高效液相色谱分离纯化步骤获得次级代谢产物及单体化合物。采用的菌株为A.terreus OUCMDZ‑2739，发酵过程中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA作为表观遗传修饰调控剂。有益效果为：本发明在培养基中添加烟酰胺、二胜肽，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA产生协同增益作用，有效激活了该菌株体内不同合成途径基因水平的表达，成功对A.terreus进行表观修饰，进而代谢产生不同于不添加抑制剂条件下的化合物类型，并分离得到次级代谢产物中的目标单体化合物。

Description

一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法。
背景技术
近年来从陆地微生物中获得单体化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于高压、高盐、低温、寡营养的独特生存环境，导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，更易产生一些结构特异的新次级代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等。海洋来源微生物具有巨大的开发利用前景。
曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递调控机制在在天然产物次生代谢产物的合成中扮演重要角色。微生物具有很多次生代谢产物生物合成的编码基因，然而大多数编码基因处于沉默状态。使用化学表观遗传修饰法，激活沉默基因表达，显示出了从真菌和其它生物体内获得新的次生代谢产物令人难以置信的机会。使用小分子抑制剂靶向调控表观遗传特性的优点是技术手段成本低、相对容易应用于高通量筛选。这种方法可以有效的应用于已经研究过的真菌和以前从未研究过的对其基因组成分一无所知的新的真菌中。
现有技术如授权公告号为CN 104031845 B的中国发明专利，公开了一种制备速度快，产物纯度高的海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其发酵过程为1) 将海洋青霉菌接种在PDA上在25℃培养箱中培养2d后，挑取单菌落再接种到PDA培养基上于25℃培养2d后备用；2)将活化菌种接种于PDB中，在25℃、150rpm的条件下培养1d得到种子液；3)取种子液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养基中，于 25℃，150rpm的条件下培养12d；4)将发酵液过滤取上清液乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶得到进样液；5)采用高速逆流色谱法对进样液进行分离纯化得到产品。但该海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺没有经过表观遗传修饰，所得次级代谢产物为常规途径下基因水平表达的次级代谢产物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA进行表观修饰的提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，该方法产生的次级代谢产物多，发酵物萃取率高。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，此方法是在A.terreus 的发酵初始或发酵过程中，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA；HPLC-UV指纹图谱显示，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA后的次级代谢产物，出现了一系列中等极性的小峰，推测组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA，有效激活了A.terreus体内不同合成途径基因水平的表达，进而代谢产生不同于不添加抑制剂条件下的化合物类型，即对A.terreus 成功进行表观修饰，提高了次级代谢产物中单体化合物的产量。
作为优选，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的添加方式为：采取微孔滤膜过滤，在液态培养基灭菌冷却后添加；组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA具有热不稳定性，在培养基灭菌冷却后添加，避免TSA因高温灭菌而失效。
进一步优选，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA在培养基内的终浓度为5-25μM。
作为优选，发酵过程中还添加了烟酰胺、二胜肽，添加量分别为0.05-0.1％、0.05-0.15％；烟酰胺、二胜肽添加到真菌培养基中，可改善发酵培养基的组分，改变培养基内营养环境，提高培养基营养，促进菌丝体细胞的有丝分裂速度，实现菌丝体次级代谢产物中单体化合物发酵水平的快速提高，同时，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 协同作用，促进TSA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，对菌丝体细胞进行表观遗传修饰调控，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物中单体化合物的产量。
进一步优选，所用发酵培养条件为真菌培养基、静置发酵、培养30天。
作为优选，所用菌株为A.terreus OUCMDZ-2739，单体化合物的结构式为：
作为优选，A.terreus次级代谢产物通过萃取获得，萃取步骤为：用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液用乙酸乙酯萃取；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，将菌丝体超声破碎、过滤，滤液用乙酸乙酯萃取；合并萃取液，减压浓缩，得发酵萃取物。
进一步优选，所用2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率。
作为优选，A.terreus次级代谢产物中的单体化合物通过硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱、RP-18反相硅胶柱色谱、高效液相色谱进行分离纯化，所用洗脱剂依次为石油醚-二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇、甲醇-水、甲醇-水。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明由表观遗传修饰调控剂TSA修饰，有效激活A.terreus沉默基因的表达，从而显著改变微生物的代谢产物类型，从而分离得到A.terreus次级代谢产物；本发明在培养基中添加烟酰胺、二胜肽，与表观遗传修饰调控剂TSA产生协同增益作用，改变培养基内营养情况，促进A.terreus产生更多的次级代谢产物；本发明在菌丝体萃取过程中，加入2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，协同超声波的机械作用、空化作用，破坏细胞壁，加速胞内物质释放，提高发酵物萃取率。
附图说明
图1为本发明实施例6中TSA的终浓度为10μM时，A.terreus OUCMDZ-2739次级代谢产物的HPLC-UV指纹图谱；
图2为本发明实施例6中TSA的终浓度为1μM时，A.terreus OUCMDZ-2739次级代谢产物的HPLC-UV指纹图谱；
图3为本发明实施例6中TSA的终浓度为50μM时，A.terreus OUCMDZ-2739次级代谢产物的HPLC-UV指纹图谱；
图4为本发明实施例6中TSA的终浓度为100μM时，A.terreus OUCMDZ-2739次级代谢产物的HPLC-UV指纹图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：真菌培养基灭菌冷却，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA采用微孔滤膜过滤，加入真菌培养基中，其终浓度为15μM，然后加入0.05％烟酰胺、0.1％二胜肽，搅拌均匀，静置300mL，发酵培养30天；烟酰胺、二胜肽添加到真菌培养基中，可改善发酵培养基的组分，改变培养基内营养环境，提高培养基营养，促进菌丝体细胞的有丝分裂速度，实现菌丝体次级代谢产物中单体化合物发酵水平的快速提高，同时，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA协同作用，促进TSA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，对菌丝体细胞进行表观遗传修饰调控，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物中单体化合物的产量；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18 反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物的结构式为：
单体化合物，棕色固体，高分辨质谱HRESI-MS在m/z385.1651处给出[M+H]+准分子离子峰，提示分子量为384，结合1H和13C NMR谱图信息确定分子式为C22H24O6，不饱和度为11。紫外光谱在206，281nm处有最大吸收。因此确定从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物的结构式。单体化合物的1H和13C NMR谱图信息见表 1。
表1.单体化合物的1H和13C NMR谱图信息
实施例2：
一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养3天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：真菌培养基灭菌冷却，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA采用微孔滤膜过滤，加入真菌培养基中，其终浓度为10μM，然后加入0.08％烟酰胺、0.1％二胜肽，搅拌均匀，静置300mL，发酵培养30天；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18 反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物的结构式为：
实施例3：
一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养5天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：真菌培养基灭菌冷却，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA采用微孔滤膜过滤，加入真菌培养基中，其终浓度为10μM，0.1％烟酰胺、0.15％二胜肽，搅拌均匀，静置300mL，发酵培养30天；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、3％2-甲基丙氨酸、15％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18 反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的单体化合物的结构式为：
对比例1：
菌株发酵制备步骤中未添加烟酰胺、二胜肽，其余部分和实施例2完全一致。
对比例2：
菌株发酵制备步骤中未添加表观遗传修饰调控剂TSA，其余部分和实施例2完全一致。
对比例3：
次级代谢产物萃取步骤中未添加2-甲基丙氨酸、柠檬酸钙，其余和实施例2完全一致。
实施例4：
将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2和对比例3分别设为对照组1、对照组2和对照组3，对比制得的最终发酵萃取物和单体化合物的重量，结果见表2。
表2最终发酵萃取物和单体化合物的重量
组别 最终发酵萃取物(g) 单体化合物(mg)
试验组 181 11
对照组1 131 8.2
对照组2 105 0
对照组3 181 96
由表2可知，试验组和对照组3的最终发酵萃取物重量高于对照组1、对照组2，说明烟酰胺、二胜肽、表观遗传修饰调控剂TSA的加入能够提高A.terreus OUCMDZ-2739的发酵程度，使其产生更多的次级代谢产物；试验组的单体化合物的重量高于对照组1、对照组2、对照组3，说明2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙的加入能够提高菌丝体的萃取率，对照组2的新化和物的重量为0，说明表观遗传修饰调控剂TSA的调控使A.terreus OUCMDZ-2739产生新次级代谢产物，提示表观遗传修饰调控剂组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA有效激活了该菌株体内不同合成途径基因水平的表达，进而代谢产生不同于不添加抑制剂条件下的化合物类型。
实施例5：
培养基与发酵条件的选择
实施例2的菌株发酵方式设为试验组，
对照组1：菌株发酵制备步骤中，采用摇床发酵150mL，培养7天，其余部分与试验组完全一致；
对照组2：菌株发酵制备步骤中，采用寡营养培养基，其余部分与试验组完全一致；
对照组3：菌株发酵制备步骤中，采用寡营养培养基，摇床发酵150mL，培养7天，其余部分与试验组完全一致；
对比制得的最终发酵萃取物和单体化合物的重量，结果见表3。
表3最终发酵萃取物和单体化合物的重量
组别 最终发酵萃取物(g) 单体化合物(mg)
试验组 181 11
对照组1 120 3.3
对照组2 微量 0
对照组3 微量 96
由表3可知，对照组2和对照组3，都只产生微量的最终发酵萃取物，没有产生单体化合物，说明寡营养培养基条件下，A.terreus OUCMDZ-2739菌株生长缓慢，基本无次级代谢产物生成；对照组1的最终发酵萃取物和单体化合物的重量高于对照组2、对照组3，真菌培养基能促进A.terreus OUCMDZ-2739菌株产生更多的次级代谢产物；试验组的最终发酵萃取物和单体化合物的重量均高于对照组1、对照组2、对照组3，说明静置发酵培养比摇床培养条件更能提高A.terreus OUCMDZ-2739的发酵程度，使其产生更多的次级代谢产物和单体化合物。
实施例6：
组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的添加量对次级代谢产物的影响
将实施例2设为试验组，对照组1、对照组2、对照组3中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的终浓度依次为1μM、50μM、100μM，其余部分与试验组完全一致，对比制得的最终发酵萃取物和单体化合物的重量，结果见表4和附图1、附图2、附图3、附图4。
表4最终发酵萃取物和单体化合物的重量
组别 最终发酵萃取物(g) 单体化合物(mg)
试验组 181 11
对照组1 156 1.2
对照组2 167 2.1
对照组3 125 微量
由表4可知，试验组的最终发酵萃取物和单体化合物的重量均高于对照组1、对照组2、对照组3，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的终浓度为10μM时，对次级代谢产物多样性的产生影响最为明显，单体化合物的产生量最多；试验组的单体化合物的重量大大高于对照组1和对照组2，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的终浓度为1μM 和50μM时，对单体化合物的产生量有促进，但促进作用不如终浓度10μM大；对照组 3的单体化合物重量为微量，说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的终浓度过大时，对单体化合物的产生基本无促进作用。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述方法是在A.terreus的发酵初始或发酵过程中，加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA。
2.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的添加方式为：采取微孔滤膜过滤，在液态培养基灭菌冷却后添加。
3.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA在培养基内的终浓度为5-25μM。
4.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述发酵过程中还添加了烟酰胺、二胜肽，添加量分别为培养基重量的0.05-0.1％、0.05-0.15％。
5.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述发酵培养条件为真菌培养基、静置发酵、培养30天。
6.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述菌株为A.terreus OUCMDZ-2739，单体化合物的结构式为：
7.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述次级代谢产物通过萃取获得，萃取步骤为：用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液用乙酸乙酯萃取；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，将菌丝体超声破碎、过滤，滤液用乙酸乙酯萃取；合并萃取液，减压浓缩，得发酵萃取物。
8.根据权利要求7所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％。
9.根据权利要求1所述的一种提高A.terreus次级代谢产物中单体化合物产量的方法，其特征在于：所述A.terreus次级代谢产物中单体化合物通过硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱、RP-18反相硅胶柱色谱、高效液相色谱进行分离纯化，所用洗脱剂依次为石油醚-二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇、甲醇-水、甲醇-水。
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