CN109280041A - 一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法 - Google Patents

一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA、烟酰胺、二胜肽，发酵培养，分别萃取发酵液、菌丝体，发酵浓缩物经柱色谱、高效液相色谱分离纯化，得到分离提取的新化合物。有益效果为：本发明在培养基中添加烟酰胺、二胜肽，与表观遗传修饰调控剂TSA产生协同增益作用，对A.terreus OUCMDZ‑2739进行表观修饰，有效激活该菌株沉默基因的表达，并分离得到新次级代谢产物；本发明制得的新化和物，具有较好的抗肿瘤效果。

Description

一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法。
背景技术
众所周知，微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等活性物质的重要来源。微生物由于可以大规模发酵培养，无原料限制，不会破坏环境等优点已成为天然产物研究领域的热点。近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于高压、高盐、低温、寡营养的独特生存环境，导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，更易产生一些结构特异的新次级代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等。海洋来源微生物具有巨大的开发利用前景。
曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
现有技术如授权公告号为CN 104031845 B的中国发明专利，公开了一种制备速度快，产物纯度高的海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其发酵过程为1)将海洋青霉菌接种在PDA上在25℃培养箱中培养2d后，挑取单菌落再接种到PDA培养基上于25℃培养2d后备用；2)将活化菌种接种于PDB中，在25℃、150rpm的条件下培养1d得到种子液；3)取种子液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养基中，于25℃，150rpm的条件下培养12d；4)将发酵液过滤取上清液乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶得到进样液；5)采用高速逆流色谱法对进样液进行分离纯化得到产品。但该海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺没有经过表观遗传修饰，所得次级代谢产物不是新次级代谢产物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由表观遗传修饰调控剂TSA修饰的，次级代谢产物多，发酵物萃取率高的从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
本发明用菌种由青岛石老人海水浴场的浒苔样品的共附生真菌，通过化学和生物学方法共同筛选所得。
一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养3-5天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA、烟酰胺、二胜肽，搅拌均匀，静置，发酵培养30天；烟酰胺、二胜肽添加到真菌培养基中，可改善发酵培养基的组分，改变培养基内营养环境，提高培养基营养，促进菌丝体细胞的有丝分裂速度，实现菌丝体次级代谢产物中单体化合物发酵水平的快速提高，同时，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA协同作用，促进TSA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，对菌丝体细胞进行表观遗传修饰调控，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物中新化合物的产量。
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物；
作为优选，菌株发酵步骤中，表观遗传修饰调控剂TSA的终浓度为5-25μM。
作为优选，菌株发酵步骤中，烟酰胺的添加量为0.05-0.1％，二胜肽添加量为0.05-0.15％。
作为优选，次级代谢产物萃取步骤中，2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物的结构式为：
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明由表观遗传修饰调控剂TSA修饰，有效激活A.terreus沉默基因的表达，从而显著改变微生物的代谢产物类型，从而分离得到A.terreus次级代谢产物；本发明在培养基中添加烟酰胺、二胜肽，与表观遗传修饰调控剂TSA产生协同增益作用，促进A.terreus产生多样化的次级代谢产物；本发明在菌丝体萃取过程中，加入2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，协同超声波的机械作用、空化作用，破坏细胞壁，加速胞内物质释放，提高发酵物萃取率；本发明从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物具有抗肿瘤效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养4天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA，其终浓度为15μM，0.05％烟酰胺、0.1％二胜肽，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60L；烟酰胺、二胜肽添加到真菌培养基中，可改善发酵培养基的组分，改变培养基内营养环境，提高培养基营养，促进菌丝体细胞的有丝分裂速度，实现菌丝体次级代谢产物中单体化合物发酵水平的快速提高，同时，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA协同作用，促进TSA与菌丝体细胞通路的活性位点结合，对菌丝体细胞进行表观遗传修饰调控，促进真菌次级代谢产物的产生和生长，增加菌丝体次级代谢产物中新化合物的产量；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；2-甲基丙氨酸与柠檬酸钙共同作用，极大地渗透菌丝体细胞壁，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力破坏菌丝体细胞壁结构，改变细胞壁通透性，使其分子结构断裂，出现破洞，然后协同超声波的机械效应、空化效应和热效应，促进菌丝体细胞内物质的释放、扩散和溶解，提高菌丝体萃取物的萃取率；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物的结构式为：
新化合物，棕色固体，高分辨质谱HRESI-MS在m/z385.1651处给出[M+H]+准分子离子峰，提示分子量为384，结合1H和13C NMR谱图信息确定分子式为C22H24O6，不饱和度为11。紫外光谱在206，281nm处有最大吸收。因此确定从A.terreus次级代谢产物中分离提取的化合物为新化合物。新化合物的1H和13C NMR谱图信息见表1。
表1.新化合物的1H和13C NMR谱图信息
Positions δ<sub>H</sub>(J/Hz) δ<sub>C</sub>
1 174.2,s
2 3.11(td,J＝10.9,3.5Hz,1H) 51.7,d
3 3.48(d,J＝11.2Hz,1H) 53.8,d
4 174.1,s
5 2.74(dd,J＝8.5,3.6Hz,1H),2.70(overlap,1H) 37.0,t
1’ 127.6,s
2’ 7.07(d,J＝8.4Hz,1H) 129.7,d
3’ 6.65(d,J＝8.4Hz,1H) 115.5,d
4’ 157.1,s
5’ 6.65(d,J＝8.4Hz,1H) 115.5,d
6’ 7.07(d,J＝8.4Hz,1H) 129.7,d
1” 130.0,s
2” 6.83(s,1H) 129.9,d
3” 120.8,s
4” 152.5,s
5” 6.57(d,J＝8.2Hz,1H) 116.9,d
6” 6.81(d,J＝8.3Hz,1H) 127.8,d
1”’ 2.64(overlap,2H) 22.3,t
2”’ 1.71(t,J＝6.6Hz,2H) 32.5,t
3”’ 74.3,s
4”’ 1.22(s,3H) 27.1,q
5”' 1.22(s,3H) 27.0,q
实施例2：
一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养3天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA，其终浓度为10μM，008％烟酰胺、0.1％二胜肽，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60L；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、2％2-甲基丙氨酸、1％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物的结构式为：
实施例3：
一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：
孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管(含20％甘油、3.3％海水素新鲜配制的PDA液体冻存液)置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养5天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；
菌株发酵：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA，其终浓度为10μM，0.1％烟酰胺、0.15％二胜肽，搅拌均匀，静置，发酵培养30天，一共发酵60L；
次级代谢产物萃取：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液加入等体积的乙酸乙酯搅拌萃取3次，将乙酸乙酯减压浓缩，得发酵液萃取物；菌丝体加入80％的丙酮-水、3％2-甲基丙氨酸、15％柠檬酸钙，浸泡，用功率800W的超声组织破碎仪，以超声3s，间隔3s的方法，将菌丝体超声破碎45次，然后萃取30min，用布氏漏斗过滤得到清液，减压浓缩，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵菌丝体萃取物；合并发酵液萃取物与发酵菌丝体萃取物，得最终发酵萃取物；
分离纯化：将最终发酵萃取物用硅胶柱色谱进行洗脱，洗脱剂选择石油醚-二氯甲烷-甲醇；再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇；再用用RP-18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱剂为甲醇-水；再用高效液相色谱法分离，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物。
从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物的结构式为：
对比例1：
菌株发酵制备步骤中未添加烟酰胺、二胜肽，其余部分和实施例2完全一致。
对比例2：
菌株发酵制备步骤中未添加表观遗传修饰调控剂TSA，其余部分和实施例2完全一致。
对比例3：
次级代谢产物萃取步骤中未添加2-甲基丙氨酸、柠檬酸钙，其余和实施例2完全一致。
实施例4：
将实施例2设为试验组，对比例1、对比例2和对比例3分别设为对照组1、对照组2和对照组3，对比制得的最终发酵萃取物和新化合物的重量，结果见表2。
表2最终发酵萃取物和新化合物的重量
由表1可知，试验组和对照组3的最终发酵萃取物重量高于对照组1、对照组2，说明烟酰胺、二胜肽、表观遗传修饰调控剂TSA的加入能够提高A.terreus OUCMDZ-2739的发酵程度，使其产生更多的次级代谢产物；试验组的新化合物的重量高于对照组1、对照组2、对照组3，说明2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙的加入能够提高菌丝体的萃取率，对照组2的新化和物的重量为0，说明表观遗传修饰调控剂TSA的调控使A.terreus OUCMDZ-2739产生新次级代谢产物，提示表观遗传修饰调控剂组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA有效激活了该菌株体内不同合成途径基因水平的表达，进而代谢产生不同于不添加抑制剂条件下的化合物类型。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，其特征在于：所述菌株发酵步骤为：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA、烟酰胺、二胜肽，搅拌均匀，静置，发酵培养30天。
2.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述表观遗传修饰调控剂TSA的终浓度为5-25μM。
3.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述烟酰胺的添加量为培养基重量的0.05-0.1％，二胜肽添加量为培养基重量的0.05-0.15％。
4.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述孢子制备步骤为：将菌株A.terreus OUCMDZ-2739取出复苏10min，用接种环蘸取，在PDA斜面固体培养基中均匀划线，28℃培养至成熟，得丰满孢子，备用。
5.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述次级代谢产物萃取步骤为：发酵完成后，用绢布将菌丝体和发酵液分离；发酵液用乙酸乙酯萃取；菌丝体加入80％的丙酮-水、2-甲基丙氨酸和柠檬酸钙，浸泡，超声组织破碎仪将菌丝体破碎，萃取，过滤，上清液用乙酸乙酯萃取；合并萃取液，减压浓缩，得最终发酵萃取物。
6.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述2-甲基丙氨酸的添加量为培养基质量的1-3％，柠檬酸钙的添加量为培养基质量的0.5-1.5％。
7.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：所述分离纯化步骤为：将最终发酵萃取物依次用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱、RP-18反相硅胶柱色谱、高效液相色谱进行分离纯化，所用洗脱剂依次为石油醚-二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇、甲醇-水、甲醇-水，得到从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物。
8.根据权利要求1所述的一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，其特征在于：从A.terreus次级代谢产物中分离提取的新化合物的结构式为：
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孙坤来: "表观遗传修饰增加两株浒苔真菌的化学多样性研究", 《中国海洋大学博士学位论文》 *

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CN110013477A (zh) * 2019-04-09 2019-07-16 嘉兴市爵拓科技有限公司 一种浒苔来源真菌的次级代谢物的新用途

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