CN109401985A - 一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明通过Tlrgt2基因上下游同源臂序列、潮霉素抗性基因hph序列构建Tlrgt2敲除载体，采用基因敲除的方法制备得到ΔTlrgt2木霉工程菌株，敲除Tlrgt2基因，可以有效地提高菌株的peptaibols抗菌肽生产能力。本发明构建的ΔTlrgt2木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高木霉peptaibols抗菌肽的产量，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍，因此本发明有助于木霉peptaibols抗菌肽在医药和农业上的应用。

Description

一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建 方法与应用

技术领域

本发明涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

木霉(Trichoderma spp.)是一类重要的真菌资源，广泛存在于土壤、腐木、根际及叶际环境。木霉不仅是工业上重要的酶制剂生产菌株，在农业生产中也是重要的生防因子和植物促生因子。木霉的生防作用机制主要包括以下几个方面：(1)重寄生作用：木霉能够识别寄主真菌，不仅附着缠绕在寄主菌丝上，还产生多种胞外酶溶解寄主细胞壁，穿透菌丝吸收营养；(2)抗生作用：木霉能够产生多种次级代谢产物抑制植物病原微生物的生长，包括peptaibols，tricholin，6-penthyl-α-pyrone，viridin等；(3)竞争作用：木霉一般生长繁殖较快，适应性强，能够更高效的利用空间内的营养成分；(4)诱导抗性的作用：木霉能够诱导植物抗性的产生，激发植物的防御机制，从而抑制植物病害的发生。目前，木霉被用于防治由立枯丝核菌、腐霉菌、镰刀菌等引起的棉花、人参、三七等幼苗立枯病以及茉莉、花生和辣椒的白绢病、番茄的猝倒病等。木霉还可以有效降低灰霉引起的藤蔓和采后果实的腐烂病。木霉不仅能够拮抗病原微生物保护植物免受病害侵扰，还能产生多种次级代谢产物促进植物的生长发育。

木霉产生的peptaibols类次级代谢产物是由非核糖体肽合成酶控制合成的特殊的肽类抗生素，其含有高比例的非蛋白质氨基酸残基，尤其是α-氨基异丁酸，氮端通常烷基化，碳端羟基化，含有5～20个氨基酸残基，多数为15～20个氨基酸残基。peptaibols类抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤及诱导植物产生抗性等多种生物学活性。Peptaibols类抗菌肽对多种植物病原微生物具有广谱的抗菌活性，并能抑制植物病害的发生，因此可用作生防制剂，防治植物病害的发生，从而减少化学农药的使用，保护环境。Peptaibols类抗菌肽还能通过激活Ca²⁺信号转导途径引起肝癌细胞系HepG2的凋亡和自噬，具有新型抗肿瘤药物的潜力。因此，peptaibols类次级代谢产物在农业和医药领域都具有很好的应用潜力。

Peptaibols抗菌肽含有大量的非蛋白源的氨基酸残基，不能采用现有的多肽化学合成方法生产，因此生物合成是其主要的生产方法。中国专利文献CN105950691A公开了一种peptaibols类抗菌肽及其制备方法和应用，该方法将橘绿木霉发酵培养得到发酵液，再通过树脂吸附、溶剂萃取、以及减压浓缩等工艺获得peptaibols类抗菌肽，培养得到的发酵液中抗菌肽的含量仅为0.24％。2007年宋晓妍等人报道了康宁木霉菌(T.koningii SMF2)用固体培养方式培养3天产生Peptaibols，每公斤培养基仅能产生146.20毫克的Trichokonin IV。现有技术中，无论是液体发酵还是固体发酵，都存在产量较低的问题，而且缺乏高效的生产菌株。Sigma aldrich公司的Alamethicin是仅有的商品化peptaibols抗菌肽，但价格昂贵，无法满足peptaibols抗菌肽在农业和医药领域的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株高产Peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用，本发明构建的ΔTlrgt2木霉工程菌能够显著提高peptaibols抗菌肽的产量，peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍。

术语说明：

Peptaibols抗菌肽：是指一类由非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成的富含α-氨基异丁酸(Aib)、具有烷基化的N-末端和羟基化的C-末端、具有α-螺旋线性结构、对多种细菌和真菌等具有拮抗作用的一类特殊的肽类抗生素的总称。

本发明的技术方案如下：

一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：

upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGC

upR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

downF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCA

downR：TTCAATTCTT TGTTCGCTCC TGGT

(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：

hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAG

hphR：CATACCCACGCCGAAACAAG

(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；

(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：

CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAG

CR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述提取木霉SMF2的基因组DNA参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.^TMFungal DNA Mini Kit，OMEGA)说明书进行。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述纯化是将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后即得纯化产物，其中胶回收采用DNA回收试剂盒(OMEGA)。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述融合PCR扩增体系为：上游同源臂序列1μL，下游同源臂序列1μL，hph序列2.5μL，dNTP混合物2μL，5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补足20μL；

所述融合PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃退火6min，72℃延伸4min，16个循环；72℃终延伸10min。

根据本发明优选的，步骤(4)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

根据本发明优选的，步骤(5)中所述木霉SMF2原生质体的制备步骤如下：将木霉SMF2的孢子接种于菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13.5h；将菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7M NaCl溶液洗涤沉淀三次，每次25mL，加入细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3h，过滤，滤液中加入15mL预冷的浓度为0.7M的NaCl溶液，4℃，3800rpm离心5min收集原生质体，收集到的原生质体用15mL预冷的STC溶液洗涤两次，然后加入预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度为5×10⁷～5×10⁸个/mL；

进一步优选的，所述菌丝生长培养基的组分如下，均为质量体积比：2.5％马铃薯葡萄糖水，1.5％酵母提取物，pH自然。

进一步优选的，所述细胞壁裂解酶液的组分如下：0.24g细胞壁裂解酶，溶于5.7mL浓度为0.7M的NaCl溶液中，过滤除菌，加入0.3mL pH5.8的PBS缓冲液。

进一步优选的，所述STC溶液的组分如下：0.7M D-山梨糖醇，0.05M CaCl₂，10mMTris-HCl，pH 7.5。

根据本发明优选的，步骤(5)中所述转化木霉SMF2原生质体的步骤为：取150μL ΔTlrgt2敲除载体和150μL原生质体混匀加入到10mL离心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mL PTC溶液，冰浴20min，再室温放置20min；再加入2mL STC溶液混匀，得转化液。

进一步优选的，所述PTC溶液的组分如下：质量体积比为60％PEG 4000(聚乙二醇4000)，10mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，pH 7.5。

根据本发明优选的，步骤(5)中所述再生的步骤为：将转化木霉SMF2原生质体所得的转化液涂布于含100μg/mL潮霉素B的再生培养基平板上，28℃培养2-3d。

进一步优选的，所述再生培养基的组分如下：质量体积比为2.5％马铃薯葡萄糖水，0.7M蔗糖，质量体积比为0.7％琼脂粉。

根据本发明优选的，步骤(5)中所述筛选的步骤为：将再生培养基平板上长出的菌落转接到含100μg/mL潮霉素B的PDA培养基上培养，挑取生长良好的菌落再次转接到PDA培养基上，培养得转化子。

进一步优选的，所述PDA培养基的组分如下：25g马铃薯葡萄糖水，20g琼脂粉，蒸馏水定容到1L。

根据本发明优选的，步骤(5)中所述验证的步骤为：提取筛选的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证，得阳性转化子；后采用单孢分离的方法对阳性转化子进行纯化，采用PCR技术进行内部基因验证；

其中，上游同源臂序列锚定验证引物YZ-F1和YZ-R1、下游同源臂序列锚定验证引物YZ-F2和YZ-R2、内部基因验证引物YZ-F3和YZ-R3的核苷酸序列如下：

YZ-F1：TTCTGGGCTCTTGCGGGACA

YZ-R1：CAGCGGGCAGTTCGGTTTCA

YZ-F2：GCCCTGGGTTCGCAAAGATAA

YZ-R2：GCTGGCGGTACGGCATACTCT

YZ-F3：CAATCAACGGCATTCTCGC

YZ-R3：GCCCACTATCAACAGTTTACGG。

进一步优选的，所述PCR的具体反应体系和反应条件参见GenStar2×Taq PCRStarMix说明书。

按照上述构建方法获得的高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。

上述ΔTlrgt2木霉工程菌在制备peptaibols抗菌肽中的应用。

根据本发明优选的，上述应用，步骤如下：

将构建的ΔTlrgt2木霉工程菌接种于PDB培养基，在28℃，180rpm培养10d，得菌种培养液，10000rpm离心20min，得粗提液，将粗提液用Agela C₁₈固相萃取柱提纯，浓缩后得peptaibols抗菌肽。

进一步优选的，所述PDB培养基组分如下：马铃薯去皮，称取200g，切块加适量水煮沸30min，4层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加蒸馏水定容到1L。

本发明的技术特点及有益效果

1、本发明中的木霉SMF2糖转运相关基因Tlrgt2含有一个具有1737个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码578个氨基酸，Tlrgt2基因编码的TlRgt2因子属于MFS家族，具有糖转运功能。本发明通过构建Tlrgt2敲除载体，采用基因敲除的方法制备得到ΔTlrgt2木霉工程菌株，敲除Tlrgt2基因，可以有效地提高菌株的peptaibols抗菌肽生产能力。

2、本发明构建的ΔTlrgt2木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高木霉peptaibols抗菌肽的产量，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍，因此本发明有助于木霉peptaibols抗菌肽在医药和农业上的应用。

附图说明

图1、Tlrgt2基因敲除原理图；

图2、ΔTlrgt2木霉工程菌各转化子上下游同源臂序列锚定验证和内部基因验证的PCR验证电泳图；

其中：WT为出发菌株木霉SMF2；

图3、木霉SMF2菌株和ΔTlrgt2木霉工程菌在10d时peptaibols抗菌肽的HPLC分析图谱；

其中：WT为出发菌株木霉SMF2；

图4、木霉SMF2菌株和ΔTlrgt2木霉工程菌中peptaibols抗菌肽合成基因tpx1和tpx2基因表达量的qRT-PCR分析；

其中：WT为出发菌株木霉SMF2。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。

材料来源：

木霉(Trichoderma)SMF2购自中国典型培养物保藏中心，菌种编号CCTCC NO:M209031；

pUCATPH质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

马铃薯葡萄糖水为粉末状培养基，购自青岛日水生物技术有限公司。

若无特殊说明，本发明涉及的药品及试剂均为普通市售产品。

实施例1：

ΔTlrgt2敲除载体的构建，步骤如下：

1.引物的设计与合成

根据木霉SMF2Tlrgt2基因的上下游2500bp的位置分别设计引物用于克隆出该基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列；根据潮霉素抗性基因hph设计引物用于从pUCATPH质粒中克隆出潮霉素抗性基因hph序列；根据上游同源臂的N端，下游同源臂C端设计引物用于ΔTlrgt2敲除载体的扩增；所述Tlrgt2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，由Tlrgt2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Tlrgt2基因的上游同源臂序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，Tlrgt2基因的下游同源臂序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，潮霉素抗性基因hph序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，潮霉素抗性基因hph编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

其中，上游同源臂序列的扩增引物为：

upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGC

upR：CTTCAATATC ATCTTCTGTC GACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

下游同源臂序列的扩增引物为：

downF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCA

downR：TTCAATTCTT TGTTCGCTCC TGGT

潮霉素抗性基因hph序列的扩增引物为：

hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAG

hphR：CATACCCACGCCGAAACAAG

ΔTlrgt2敲除载体的扩增引物为：

CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAG

CR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

上述引物均由华大基因公司合成。

2.利用PCR技术对Tlrgt2基因上下游同源臂序列及hph序列的扩增

1)参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.^TMFungal DNA Mini Kit，OMEGA)说明书提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列；

其中，PCR扩增的体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

PCR扩增的程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列；

其中，PCR扩增的体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

PCR扩增的程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

3.Tlrgt2基因上下游同源臂序列及hph序列的融合

将步骤2中的经PCR扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用OMEGA公司的DNA回收试剂盒进行胶回收，得纯化后的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列，将上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，以该融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经胶回收后得Tlrgt2基因敲除载体。

其中，融合PCR扩增的体系为：上游同源臂序列1μL，下游同源臂序列1μL，hph序列2.5μL，dNTP混合物2μL，5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补足至20μL；

融合PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃退火6min，72℃延伸4min，16个循环；72℃终延伸10min。

以CF、CR为上下游引物进行PCR扩增的体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

PCR扩增的程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

实施例2：

ΔTlrgt2木霉工程菌的构建，步骤如下：

1.木霉SMF2原生质体的制备

1)制备孢子浓度为5×10⁷～5×10⁸个/mL的木霉SMF2孢子悬液，取1mL接种于50mL菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13.5h，得菌丝培养物；

2)将步骤1)得到的菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7M NaCl溶液洗涤沉淀三次，每次25mL，得菌丝体；

3)向步骤3)得到的菌丝体中加入6mL细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3h；通过显微镜观察，当有大量游离的原生质体出现时，利用G2漏斗过滤，向滤液中加入15mL预冷的0.7M的NaCl溶液，4℃，3800rpm离心5min收集原生质体，收集到的原生质体用15mL预冷的STC溶液洗涤两次，加入适量预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度约为5×10⁸个/mL，得木霉SMF2原生质体；以上操作均在冰上进行。

2.Tlrgt2基因敲除载体的转化与再生

1)取150μL实施例1制备的Tlrgt2基因敲除载体和150μL步骤1制备的木霉SMF2原生质体，混匀后加入到10mL离心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mL预冷的PTC溶液，冰浴20min，再室温放置20min，再加入2mL STC溶液后混匀，得转化液；

2)将300μL步骤1)制备的转化液涂布于含100μg/mL潮霉素B(购自Roche公司)的再生培养基平板上，28℃培养2-3d。

上述培养基的组分如下：

菌丝生长培养基，均为质量体积比：2.5％马铃薯葡萄糖水，1.5％酵母提取物，pH自然；

细胞壁裂解酶液：0.24g细胞壁裂解酶(sigma公司)，溶于5.7mL浓度为0.7M的NaCl溶液中，过滤除菌，加入0.3mL pH5.8的PBS缓冲液。

STC溶液：0.7M D-Sorbitol(D-山梨糖醇)，0.05M CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH 7.5；

PTC溶液：质量体积比为60％PEG 4000(聚乙二醇4000)，10mM Tris-HCl，10mMCaCl₂，pH 7.5；

再生培养基：质量体积比为2.5％马铃薯葡萄糖水，0.7M蔗糖，质量体积比0.7％琼脂粉。

Tlrgt2基因敲除的原理如图1所示，首先以Tlrgt2基因的上游同源臂序列、下游同源臂序列和潮霉素抗性基因hph序列构建敲除载体，将敲除载体转化木霉SMF2原生质体，敲除载体与木霉SMF2基因组相应部位发生同源重组，将敲除载体中的潮霉素抗性基因hph序列整合到木霉SMF2基因组上，取代了Tlrgt2基因，从而达到敲除Tlrgt2基因的目的。

3.ΔTlrgt2木霉工程菌的筛选与验证

1)将步骤2中再生培养基平板上长出的菌落转接到含100μg/mL潮霉素B的PDA培养基上，28℃培养2d，挑取生长良好的菌落再次转接到PDA培养基上培养，得转化子；

2)提取步骤1)得到的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证，其中上游同源臂序列锚定验证引物为YZ-F1和YZ-R1，上游同源臂序列锚定验证引物为YZ-F2/YZ-R2，引物序列如下：

YZ-F1：TTCTGGGCTCTTGCGGGACA

YZ-R1：CAGCGGGCAGTTCGGTTTCA

YZ-F2：GCCCTGGGTTCGCAAAGATAA

YZ-R2：GCTGGCGGTACGGCATACTCT

3)采用单孢分离的方法对步骤2)中验证为阳性的转化子进行纯化，采用PCR技术，以YZ-F3和YZ-R3引物进行内部基因验证，若无目的条带，即为ΔTlrgt2木霉工程菌；

其中，引物序列如下：

YZ-F3：CAATCAACGGCATTCTCGC

YZ-R3：GCCCACTATCAACAGTTTACGG

步骤2)和步骤3)的PCR反应体系为20μL，具体反应体系和反应条件参见GenStar2×Taq PCR StarMix(购自武汉飞羿科技有限公司)说明书。

上述PDA培养基组分如下：25g马铃薯葡萄糖水，20g琼脂粉，蒸馏水定容到1L。

验证结果如图2所示，在上下游同源臂序列锚定验证中，出发菌株木霉SMF2(WT)无目的条带，阳性转化子在上下游同源臂序列验证中均有一条明亮的目的条带，条带大小约为2500bp；在内部基因的验证中，出发菌株木霉SMF2(WT)有一条明亮的目的条带，条带大小约为1000bp，ΔTlrgt2木霉工程菌无目的条带。

实施例3

ΔTlrgt2木霉工程菌的peptaibols抗菌肽产量分析，步骤如下：

1.ΔTlrgt2木霉工程菌的发酵培养

将构建的ΔTlrgt2木霉工程菌和木霉SMF2菌株分别接种于PDB培养基，在28℃，180rpm分别培养10d，得菌种培养液，每个菌种设置3个重复；

上述PDB培养基组分如下：马铃薯去皮，称取200g，切块加适量水煮沸30min，4层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加蒸馏水定容到1L；

2.peptaibols抗菌肽的HPLC检测

将步骤1得到的菌种培养液10000rpm离心20min，得粗提液，将粗提液用Agela C₁₈固相萃取柱(500mg/6mL)进行的peptaibols抗菌肽的提取与浓缩，将浓缩液用0.22μm的针头滤器过滤后进行HPLC检测，流动相为甲醇(购自天津市科密欧化学试剂有限公司)和超纯水(加入0.1％TFA(三氟乙酸))，甲醇与超纯水的比例为84:16，流速为1mL/min，选用watersC₁₈反相色谱柱，检测波长为203nm，上样量为15μL。

结果如图3所示，比较分析结果表明，木霉SMF2菌株peptaibols抗菌肽的产量为0.47mg/mL，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽的产量达到5.72mg/mL，ΔTlrgt2木霉工程菌比出发菌株提高了约12倍。

实施例4

ΔTlrgt2木霉工程菌中与peptaibols抗菌肽合成相关的tpx1和tpx2基因表达量的qRT-PCR分析，步骤如下：

将构建的ΔTlrgt2木霉工程菌涂布于PDA培养基上，28℃培养5d，从平板上刮取适量的孢子，配制成孢子悬液，使孢子浓度达到10⁸个/mL，然后接种到含有100mL PDB培养基的500mL三角瓶中，每瓶接种1mL孢子悬液，设置3组平行，28℃，180rpm培养84h，每12h取一次样。

使用TRizol试剂(invitrogen公司)提取样品中的总RNA。用TaKaRa的PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒对RNA进行反转录，反应体系为20μL，方法参照说明书。

1μL反转录产物用于随后的qRT-PCR扩增，按照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒进行qRT-PCR分析，扩增体系为20μL，tef1基因作为内参基因，实验程序参照说明书。

其中，内参基因tef1基因的qRT-PCR引物如下：

tef1-F：CCACATTGCCTGCAAGTTCGC；

tef1-R：GTCGGTGAAAGCCTCAACGCAC；

与peptaibols抗菌肽合成相关的tpx1和tpx2基因的qRT-PCR引物如下：

tpx1-F：CCACCACTCCTGAGATGAAGCA；

tpx1-R：TCCAGCTTAGCCGATGTGTTGA；

tpx2-F：CTCTTGGACGATCGAGGAGC；

tpx2-R：CGACAGCTTCCACCTTGACT

qRT-PCR反应体系为：反转录产物1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×SYBRGreen q RT-PCR Mix 10μL，ddH₂O 8μL，总计20μL；

qRT-PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环；72℃终延伸5min。

结果如图4所示，培养24h以后，ΔTlrgt2木霉工程菌的tpx1和tpx2基因的表达量均高于出发菌株木霉SMF2(WT)，tpx1和tpx2基因控制长链和中长链peptaibols抗菌肽合成有关，tpx1和tpx2基因的表达量高导致ΔTlrgt2木霉工程菌的peptaibols抗菌肽合成量提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1737

<212> DNA

<213> Trichoderma spp.

<400> 1

atggccatcg ccatgggctg gcacaagccc gacaatgtcg ctggctcgtc agcgccagcg 60

atcatggtcg gcctcttcgt cgcttccggt ggtttgctct ttggttacga tactggtgca 120

atcaacggca ttctcgccat ggatgagttc aagcagaggt ttggaacgtg taacaacaaa 180

accgaaaacg atgacatatg cgccaaagac tcggccctca tcgtcgccat cctcagcgtc 240

ggcaccgctg ttggagccct cctcgccgct cccgctggcg attcactagg tcgtcggcga 300

accctcctcc tttctgtctt catcttctgc gtcggtgccg ctctgcaagt ctctgccgac 360

gagctatccg ccctgttggc tggaagatgt ctggctggtg tcggcgttgg cgccgtctcg 420

gttcttgttc ctctatatca gtccgaaatg gctcccaaat ggatacgtgg taccctcgta 480

tgcgcctacc agctctccat caccataggc ctcctcgccg cctctatcat caacatcatc 540

acctctagaa tcccatcagc tgcctcctat cgagtccccc ttggccttca gatgctccct 600

gccgctatcc tgacgggcgg cctcctgctc ctccccgaga ctccacgatt ccttgtcaag 660

caaggcaaga aggaagccgc cggtctttcg ctaagtcgcc tccgacgcct cgacatcacc 720

cacccagccc tcatcgacga actccaggaa attgtcgcca atcaccagta cgaactgacc 780

ttgggtcccg acacctacaa ggagatcttt gtaggctcgc ctcatcttgg acgccggacc 840

tttaccggat gtgggatcca aatgctacag cagctcacgg ggatcaactt catcatgtac 900

tatagcacca cctttttcgg cggttcgggc gtcgacagcc cctacaccaa gtcgctcatc 960

atccaaatca tcaacgtcgt gtcaaccttt gtcggcgtct ttgttatcga gtcttggggt 1020

cgccgtaaac tgttgatagt gggcgccctc ggtatggcat gctgtcagct agtcatggcg 1080

tcgttcgctg ccgctgctgg ggaaggcctc aagcaggcat ctaccaccat cctaatcgtc 1140

ttttgttctc tcaacatctt cttcttcgcc gcctcctggg gtcccgttgc ctgggtggtg 1200

acgtcggaga tataccccct caaagttcgc gcaaagtcca tgtcgatctc gacattctcc 1260

aactgggttc tcaacttcgg tatcggctac agtacgccct tcatggtggg cagcgggccc 1320

ggcacggctg gttttggtac caagatcttc ttcatctggg gagcattttg catcctcgcc 1380

gtctttttcg tctgggccat ggtatacgaa accagcaaaa tcagcctgga gcagattgac 1440

gaaatgtacg agcgagtgga ccatgcctgg aatagcagaa acttcgagcc aagctggagc 1500

ttccagcaaa ttctcgacga gggatggtcg cccagcgccc agcctccgcc ggatcacgag 1560

ctacagacga cgtccacgca atcgagcgcc gatactaccc tgggcgactc aaattcggtc 1620

atcatacaaa tgcctcccaa cgcgcatcac ggggatggca acgaaataac gacagcatct 1680

tcaaatggaa acaaagactc ggtcccgacg atggcgcacg tcgacttcag ctactga 1737

<210> 2

<211> 578

<212> PRT

<213> Trichoderma spp.

<400> 2

Met Ala Ile Ala Met Gly Trp His Lys Pro Asp Asn Val Ala Gly Ser

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala Ile Met Val Gly Leu Phe Val Ala Ser Gly Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Ala Ile Asn Gly Ile Leu Ala Met Asp

35 40 45

Glu Phe Lys Gln Arg Phe Gly Thr Cys Asn Asn Lys Thr Glu Asn Asp

50 55 60

Asp Ile Cys Ala Lys Asp Ser Ala Leu Ile Val Ala Ile Leu Ser Val

65 70 75 80

Gly Thr Ala Val Gly Ala Leu Leu Ala Ala Pro Ala Gly Asp Ser Leu

85 90 95

Gly Arg Arg Arg Thr Leu Leu Leu Ser Val Phe Ile Phe Cys Val Gly

100 105 110

Ala Ala Leu Gln Val Ser Ala Asp Glu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Gly

115 120 125

Arg Cys Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Ala Val Ser Val Leu Val Pro

130 135 140

Leu Tyr Gln Ser Glu Met Ala Pro Lys Trp Ile Arg Gly Thr Leu Val

145 150 155 160

Cys Ala Tyr Gln Leu Ser Ile Thr Ile Gly Leu Leu Ala Ala Ser Ile

165 170 175

Ile Asn Ile Ile Thr Ser Arg Ile Pro Ser Ala Ala Ser Tyr Arg Val

180 185 190

Pro Leu Gly Leu Gln Met Leu Pro Ala Ala Ile Leu Thr Gly Gly Leu

195 200 205

Leu Leu Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe Leu Val Lys Gln Gly Lys Lys

210 215 220

Glu Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser Arg Leu Arg Arg Leu Asp Ile Thr

225 230 235 240

His Pro Ala Leu Ile Asp Glu Leu Gln Glu Ile Val Ala Asn His Gln

245 250 255

Tyr Glu Leu Thr Leu Gly Pro Asp Thr Tyr Lys Glu Ile Phe Val Gly

260 265 270

Ser Pro His Leu Gly Arg Arg Thr Phe Thr Gly Cys Gly Ile Gln Met

275 280 285

Leu Gln Gln Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ile Met Tyr Tyr Ser Thr Thr

290 295 300

Phe Phe Gly Gly Ser Gly Val Asp Ser Pro Tyr Thr Lys Ser Leu Ile

305 310 315 320

Ile Gln Ile Ile Asn Val Val Ser Thr Phe Val Gly Val Phe Val Ile

325 330 335

Glu Ser Trp Gly Arg Arg Lys Leu Leu Ile Val Gly Ala Leu Gly Met

340 345 350

Ala Cys Cys Gln Leu Val Met Ala Ser Phe Ala Ala Ala Ala Gly Glu

355 360 365

Gly Leu Lys Gln Ala Ser Thr Thr Ile Leu Ile Val Phe Cys Ser Leu

370 375 380

Asn Ile Phe Phe Phe Ala Ala Ser Trp Gly Pro Val Ala Trp Val Val

385 390 395 400

Thr Ser Glu Ile Tyr Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Ser Met Ser Ile

405 410 415

Ser Thr Phe Ser Asn Trp Val Leu Asn Phe Gly Ile Gly Tyr Ser Thr

420 425 430

Pro Phe Met Val Gly Ser Gly Pro Gly Thr Ala Gly Phe Gly Thr Lys

435 440 445

Ile Phe Phe Ile Trp Gly Ala Phe Cys Ile Leu Ala Val Phe Phe Val

450 455 460

Trp Ala Met Val Tyr Glu Thr Ser Lys Ile Ser Leu Glu Gln Ile Asp

465 470 475 480

Glu Met Tyr Glu Arg Val Asp His Ala Trp Asn Ser Arg Asn Phe Glu

485 490 495

Pro Ser Trp Ser Phe Gln Gln Ile Leu Asp Glu Gly Trp Ser Pro Ser

500 505 510

Ala Gln Pro Pro Pro Asp His Glu Leu Gln Thr Thr Ser Thr Gln Ser

515 520 525

Ser Ala Asp Thr Thr Leu Gly Asp Ser Asn Ser Val Ile Ile Gln Met

530 535 540

Pro Pro Asn Ala His His Gly Asp Gly Asn Glu Ile Thr Thr Ala Ser

545 550 555 560

Ser Asn Gly Asn Lys Asp Ser Val Pro Thr Met Ala His Val Asp Phe

565 570 575

Ser Tyr

<210> 3

<211> 2096

<212> DNA

<213> Trichoderma spp.

<400> 3

tgattagcca gccagagcag cgaataggcg gcggccgggt gctcgcacgg atgggtcaag 60

tagtggatac ggagcgagta cgtactggac gaccaggtcc tcgttctcca tcttcagcgc 120

tgcatgttcg ggagatgatg gaaatgtggt tttcccccgg gtgcttgcat ttgtcgacag 180

cgcgtatcca gtacctgcgc gtgctttctg taccttttta tgtctgagtg gtacggagta 240

cgaggacagc cgacaccatt gaggaggagg ctcggcaatc atggcccaag gcgcaagcca 300

agcggccaag ctgctgctgc tgccagagct gcccaggcca gtacctgagt agctggactg 360

gtaaatggtt gtaattgtcg gtgctggttt aaagtacgag tacagacaac gaagcgtccg 420

acatgcgtgg cagatgcaga gcagacgtcg atgctcgacg gcccatcgtt tccgtcgctg 480

acttgcaaca gcgcccacgt tgcgatcgat cccctgcccc aggatccggc ttccaggccc 540

aggcggagaa gcggcctaga agggggccac aggcgggtgc tccagggcct cctccactcc 600

atgctgcacc tatccacggc tgctccaggg ctgctccagt gctgctccag ggctccaggc 660

cccccgtcct tcagggcctt ccctctcctg ccgctgcggg gtggggcgca ccagagcccc 720

tcgtcggcca atcaggcgcc gtcagcgcca tgctgctcgc gctgatcgct tcctgttcgc 780

ttgctagccc tcccgcctcc attgactttg ctcctccgtc ttcctcgccc ggaatctgac 840

ctctgcccct tgtcgctctt cctcacttgc acgtttggtt ctccttcttc ttcaccactg 900

ctgccggcct tggtcgtgct gacaagcctt gcaagtacta taagcggccg ccgcccaatc 960

tggatcgcgg tgcttttgcg cgcatcacgc cgcggcccac aaatcccagt tccagctcgg 1020

aagccgctcg ccctctccct ccctcgacgt tccaggtcca accagcaatc tcacccgacg 1080

tcgaaatacc taccttactc aactgtcact gttcgctcac agacaaggcc caacgcccca 1140

ggttcgagtg ctccgacatc ccctgggctg cttctcccat gccgcgaccg caccagagca 1200

gcgccgcgga agcctcgagc tcgttgatcc agtgattgat gcctctcagc ctcgtcgtcc 1260

ttcttgcgcc gccgtcttgt accacttgga tccgtggatt cacttgctat tcgaccaagg 1320

acgccatcat cagcccccag gaccaggact ggctcacact cgactcgacc gacgcacctg 1380

tcgctattat tattacctcc aactattacg gtccagcaca gactaactaa caacctccat 1440

cctgctagca cggcactgtg ccctctgccc gtttgcctgt tagtgcctgc actgctcttg 1500

gtgccgttag caccgtcagt ggtcacgctt ctagcgcagc cggctcgctc caacccttgc 1560

ctctgctctg ctggtctggc ctcggcgccc cccgtcttcc actgagaggc aaagaatatt 1620

acccactgcc gtccgtgacg ctcgtcgccg cagcgttttt gcttgcttgc ttgcctgcct 1680

ctcgctcttc tcgtccgatt ctccacgacc tctccccaga aacactctcg ctcgtcgctg 1740

cgcctccaac agcgcctgtt accggcgacc tgccatcgtc aaaaccctcg cttctgccgc 1800

cgcccgcctc gacgcgaaag ggcgtcgcaa cgcctgaagc cctggattga ctccccaaac 1860

tccgtcacca tggccatcgc catgggctgg cacaagcccg acaatgtcgc tggctcgtca 1920

gcgccagcga tcatggtcgg cctcttcgtc gcttccggtg gtttgctctt tggttacgat 1980

actgggtaag cagcaccgcc cattgctatc agctcgtgaa ttgcgatgct cggccaccct 2040

cgcccgaccc tgtcccgatc tcgttgccga cttcgatgtc gctgttgccc gtacca 2096

<210> 4

<211> 2245

<212> DNA

<213> Trichoderma spp.

<400> 4

gtatacgaaa ccagcaaaat cagcctggag cagattgacg aaatgtacga gcgagtggac 60

catgcctgga atagcagaaa cttcgagcca agctggagct tccagcaaat tctcgacgag 120

ggatggtcgc ccagcgccca gcctccgccg gatcacgagc tacagacgac gtccacgcaa 180

tcgagcgccg atactaccct gggcgactca aattcggtca tcatacaaat gcctcccaac 240

gcgcatcacg gggatggcaa cgaaataacg acagcatctt caaatggaaa caaagactcg 300

gtcccgacga tggcgcacgt cgacttcagc tactgaaaac agaaacaaaa cacaaagaaa 360

aaaaaaaaag acgaaaatct ctcttctcca atcctacagg gagctgcgtc cacaaacccc 420

tcatcacccg ggcgcttctc ctgtcttttc aggccgttct tccctacgca tatagaggga 480

aacggtcgct ttataacatt ttagcctttt atgtgaacat gcggaaatat atcagcgacg 540

gagtttctga cgaaacggag ttttgcggcg tcttggtttt tgaatacttt ttacttatta 600

tcactacttc attgtccccc tttgtcaacg gttactggga tctccaaggg tacatgactc 660

cgggctgcac caaacaaact cttctagtca caaggggcgg aacggaaata tgggaattcg 720

caggggaaag gtttcgggaa aggcaccaat gggtcattat tattctgggc tcttttttgt 780

cgtctctcgg aaaggaaata tgtggatgtt atatgggagt tgtggtcgcc gggaggcggg 840

gaaaagggtc tcccgcttca tggacagcgt caatcaggcc gatttacgga tcgtggtctt 900

tgttcgatgt tcttttcttt ttcttttctt cttcttttct tttttttttt tttttttttt 960

tttttgggga tatctcttgg tatttggctt ttcttgtcat tttgttcatt tgcctgcctt 1020

ccttgttgat ttcattttga tcctctaggg ttggattatg catattggat actcgattct 1080

gcgaaatacc cttgtcctgt aacaaaaaga caaaaatctt ttcctccatg tgtacactcg 1140

aggctttctc tcttctcctg tgaggcagga ctggcgctct ctcggaagtg ttcgacgctc 1200

tgaatgtaca ccaattcaca aaagtctgca gccctgaaga gggacaacat tgggtgtgtc 1260

ctggtgtgaa cttggtgcat cacgagaata aacatccttt ttacgccccc atttcgaaga 1320

aactgtgacc atgcgatata taacggtgag tgagattgac agccttcgtt ttgtgaaaca 1380

aaccaaacgg caaggcgtat gtagcagcag cagttactga ccaacgcatc gtcaccataa 1440

ttcaagtcgt ctcctattca cccgcaccat caacactcag tctacagagc ctgttcttga 1500

tacaccaagt ttcccgatca atgaccctgt tcctatgctc gcagtactgt gacaagtctc 1560

cccattgaat gagtactatc gactacacag agagccactt catgatgggc aacatatcac 1620

gatagcctga cctaaaggct gactgcttga cgaaaccgct gcccaattct ctccctcata 1680

tcaccttact tccttttttg aacccttgat catggtcgac atggcgttca atacacacac 1740

acacaagcac acaagcacat atctacacat tcgctcgtcc atgtccaagg aaactccttt 1800

cttcaaggac gacgaagacg aataggagtt gctatcctgg aaacaaacgg caggcagagg 1860

cataatgagg tacaaacgaa aagcgtcgcc gtgcgggcaa gcttgctaca gctcacgatg 1920

ctctgccgcc ctctgtcctc agtgattgac cgcgctcgac agtgggaaag agtaacaagg 1980

acagcgtgga ataacacacc agaacaccag aacacagtga cctgaacaaa ccgccgatgg 2040

cacatagtca gtcagccggt gagttgcgga aatgaacgct cgcataacac gatccgtatc 2100

gtgatcgcag ttataagaca cggcaaagaa gccttctctc tccccctctc cctttcgatg 2160

ttgctctcct acctctccgc caactcaaca acgataacat aggaacctgt gctcctgcga 2220

aaccaggagc gaacaaagaa ttgaa 2245

<210> 5

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 6

<211> 341

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr

50 55 60

Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr

145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

180 185 190

His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp

210 215 220

Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala

225 230 235 240

Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

245 250 255

Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp

260 265 270

Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp

275 280 285

Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val

290 295 300

Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly

305 310 315 320

Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg

325 330 335

Pro Arg Ala Lys Glu

340

Claims (10)

1.一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：

upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGC

upR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

downF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCA

downR：TTCAATTCTT TGTTCGCTCC TGGT

(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：

hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAG

hphR：CATACCCACGCCGAAACAAG

(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；

(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：

CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAG

CR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG

(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA 1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足50μL；

步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述纯化是将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后即得纯化产物。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述融合PCR扩增体系为：上游同源臂序列1μL，下游同源臂序列1μL，hph序列2.5μL，dNTP混合物2μL，5×TransStartFastPfu缓冲液4μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补足20μL；

所述融合PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃退火6min，72℃延伸4min，16个循环；72℃终延伸10min。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述木霉SMF2原生质体的制备步骤如下：将木霉SMF2的孢子接种于菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13.5h；将菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7M NaCl溶液洗涤沉淀三次，每次25mL，加入细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3h，过滤，滤液中加入15mL预冷的浓度为0.7M的NaCl溶液，4℃，3800rpm离心5min收集原生质体，收集到的原生质体用15mL预冷的STC溶液洗涤两次，然后加入预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度为5×10⁷～5×10⁸个/mL；

优选的，所述菌丝生长培养基的组分如下，均为质量体积比：2.5％马铃薯葡萄糖水，1.5％酵母提取物，pH自然；

优选的，所述细胞壁裂解酶液的组分如下：0.24g细胞壁裂解酶，溶于5.7mL浓度为0.7M的NaCl溶液中，过滤除菌，加入0.3mL pH5.8的PBS缓冲液；

优选的，所述STC溶液的组分如下：0.7M D-山梨糖醇，0.05M CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述转化木霉SMF2原生质体的步骤为：取150μLΔTlrgt2敲除载体和150μL原生质体混匀加入到10mL离心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mL PTC溶液，冰浴20min，再室温放置20min；再加入2mL STC溶液混匀，得转化液；

优选的，所述PTC溶液的组分如下：质量体积比为60％聚乙二醇4000，10mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，pH 7.5。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述再生的步骤为：将转化木霉SMF2原生质体所得的转化液涂布于含100μg/mL潮霉素B的再生培养基平板上，28℃培养2-3d；

优选的，所述再生培养基的组分如下：质量体积比为2.5％马铃薯葡萄糖水，0.7M蔗糖，质量体积比为0.7％琼脂粉。

8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述筛选的步骤为：将再生培养基平板上长出的菌落转接到含100μg/mL潮霉素B的PDA培养基上培养，挑取生长良好的菌落再次转接到PDA培养基上，培养得转化子；

优选的，所述PDA培养基的组分如下：25g马铃薯葡萄糖水，20g琼脂粉，蒸馏水定容到1L；

优选的，步骤(5)中所述验证的步骤为：提取筛选的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证，得阳性转化子；后采用单孢分离的方法对阳性转化子进行纯化，采用PCR技术进行内部基因验证；

其中，上游同源臂序列锚定验证引物YZ-F1和YZ-R1、下游同源臂序列锚定验证引物YZ-F2和YZ-R2、内部基因验证引物YZ-F3和YZ-R3的核苷酸序列如下：

YZ-F1：TTCTGGGCTCTTGCGGGACA

YZ-R1：CAGCGGGCAGTTCGGTTTCA

YZ-F2：GCCCTGGGTTCGCAAAGATAA

YZ-R2：GCTGGCGGTACGGCATACTCT

YZ-F3：CAATCAACGGCATTCTCGC

YZ-R3：GCCCACTATCAACAGTTTACGG。

9.按照权利要求1所述的构建方法获得的高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。

10.权利要求9所述的ΔTlrgt2木霉工程菌在制备peptaibols抗菌肽中的应用；

优选的，所述应用，步骤如下：

将构建的ΔTlrgt2木霉工程菌接种于PDB培养基，在28℃，180rpm培养10d，得菌种培养液，10000rpm离心20min，得粗提液，将粗提液用Agela C₁₈固相萃取柱提纯，浓缩后得peptaibols抗菌肽；

进一步优选的，所述PDB培养基组分如下：马铃薯去皮，称取200g，切块加适量水煮沸30min，4层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加蒸馏水定容到1L。