CN103146716A - 源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病理学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于稻瘟病菌的、在营养生长、孢子产生、附着胞形成致病性中起重要作用的新基因Movma11的编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。具体而言，本发明公开了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11，该基因Movma11的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该真菌致病性基因Movma11编码的蛋白质具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。基因Movma11的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标，蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。

Description

源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11及用途

技术领域

本发明属于植物病理学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于稻瘟病菌的、在营养生长、孢子产生、附着胞形成致病性中起重要作用的新基因Movma11的编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。

背景技术

由稻瘟病菌（Magnaporthe Oryzae）引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10~30%之间。我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。最近的2005年，四川省和重庆市遭受到10年来最严重的稻瘟病，四川省共有20个市、127个县的230万亩稻田发生稻瘟病，重庆市共有100多万亩稻田发生稻瘟病菌；这次稻瘟病流行迅速、危害程度重、发病水稻品种多、对水稻产量影响严重。除了水稻外，稻瘟病菌也能侵染其它50多种禾本科植物，也对小米（Eleusine coracana）、大麦（Hordeum vulgare）、小麦(Triticum aestivum)等重要农作物造成严重的危害。稻瘟病菌也是一种研究植物病原真菌－寄主植物相互作用的模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程；许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究设计出新型农药筛选的药靶，从而开发、设计新型抗真菌药物。

稻瘟病菌的生活史包括有性阶段和无性阶段。有性阶段由2个不同交配型的菌株交配后产生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MAT1－1和MAT1－2控制。无性阶段为营养菌丝分化产生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通过无性阶段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。

稻瘟病菌无性孢子落到水稻叶片表面后，侵染过程开始。当孢子与水相遇后，孢子顶端分隔内的粘胶释放出来，使孢子紧紧粘附在水稻叶片表面。水稻叶片表面具有一层蜡质角质膜，该膜具有很大的疏水性，而粘胶使孢子粘附在这一疏水的排斥性表面。粘附后2小时内，孢子萌发并产生芽管。芽管通常从孢子的一个顶端细胞伸出并生长。芽管顶端也分泌一种粘胶物质，使芽管紧紧粘附在植物叶片表面，防止被水滴冲走。4小时内，芽管生长停止，顶端钩状体形成并膨大形成附着胞。基质的硬度是芽管分化的一个重要因子，如稻瘟病菌孢子仅在硬的固体表面形成附着胞，而不能在液体表面或软基质表面形成附着胞。而基质疏水表面也通过类似于水稻叶片表面的蜡质的作用激发附着胞的形成。在孢子萌发后不久，产生芽管的细胞进行一次有丝分裂。一个细胞核留在孢子内，而另一个细胞核通过芽管移动，与孢子和芽管的细胞质内容物一起转移到形成中的附着胞。这些细胞质内容物包括储存在正在发育的附着胞中央大液泡的脂滴。然后，在附着胞和芽管之间形成隔膜。随着附着胞成熟，附着胞细胞壁出现黑色素沉积，最终形成黑色素层。黑色素层允许水分子自由通过，但溶解于水的物质不能自由通过，从而让附着胞建立并维持一个很大的细胞内膨压。附着胞的黑色素化过程完成后，附着胞产生一根狭小的菌丝--侵染栓。侵染栓对水稻叶片的穿透由于附着胞产生巨大的膨压而得以完成。膨压只要稍微降低就会阻止附着胞在人工表面或水稻叶片表面穿透。测量结果表明附着胞膨压达到8.0Mpa，相当于40倍汽车轮胎的压力。附着胞黑色素层的作用在于限制了细胞壁的渗透性，有利于细胞内渗透物质的积累和膨压的产生。甘油是一种可溶性物质，产生的渗透势足以使附着胞产生巨大的膨压。在膨压产生过程中，甘油在细胞内累积浓度超过3M。

侵入后，侵染栓分化成侵染菌丝，迅速在水稻叶片内生长并侵染其它细胞。侵入72小时后，病原菌生物量已经达到感染叶片的10%。5～7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并从病斑释放出来。这些新形成的孢子被潮湿的空气带到邻近的植物开始新的侵染过程。在冬天，稻瘟病菌以菌丝和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循环。

稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如： MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多数与附着胞形成有关，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分参与黑色素的形成和积累（ALB1、RSY1、BUF1等）以及甘油合成相关（ICL1等）；少数与稻瘟病菌的穿透相关（MPS1、PLS1、PDE1等）。稻瘟病菌芽管分泌的一种疏水蛋白，由MPG1 基因编码，参与菌丝和水稻叶表的互作，为形成正常的附着胞所必须（Talbot，1999）。MAGB基因编码的异源三聚G蛋白的α亚单位和MAC1编码的cAMP环化酶也是形成附着胞所必需的（Liu and Dean,1997; Choi and Dean,1997; Kulkarni and Dean, 2004）。CPKA 基因编码的cAMP依赖性蛋白激酶A 的催化亚单位PKA-c 是附着胞穿透所必须的(Mitchell & Hamer ,1995； Xu et al， 1997)，而正在分化的芽管中的PKA 活性对于形成正常的附着胞也非常关键（Adachi & Hamer1998）。同样，有丝分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）基因PMK1是附着胞形成所需的（Xu & Hamer 1996）。黑色素合成系列基因也证明是附着胞穿透所不可缺少的（Chumley and Valent,1990；Motoyama 等,1998）。在各种突变子库中也发现了一些突变子缺失致病性，如：编码一种与ATP 运输体(ATP-binding cassette transporters )相关的蛋白的ABC1 基因（Urban等，1999）、编码P-型ATP 酶的PDE1 基因（Balhadere等,1999, 2001）和编码tetraspannin样蛋白的PLS1基因（Clergeot等，2001）。尽管如此，稻瘟病菌的分子致病机制还是不清楚。

鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供有用的靶标位点。目前已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂，其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphen A的作用靶点是青霉的脱甲基酶（CYP51）。因此，利用分子生物学技术鉴定、克隆新的在稻瘟病菌的致病过程中具有重要功能的致病性基因，可以为设计、筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的、对稻瘟病菌等真菌的菌丝生长、分生孢子产生和萌发、附着胞形成以及致病性有重要影响的基因Movma11及该基因的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11，该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQID NO：1。

本发明同时提供了上述基因Movma11编码的cDNA序列，该cDNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明同时提供了上述基因Movma11编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQID NO：3所示的氨基酸序列。

具体如下：

1 atgccaggagtagtaccggatgactcggagctcgcgcccaagtttgcgccctttgtcggc

M P G V V P D D SE L A P K F A P F V G

61 atggccggcattgcggctgcaatgattttcggatgtgctggcgcagcattcggaaccgcc

M A G I A A A M IF G C A G A A F G T A

121 aagtcgggcatcggtatcgcgggagttggaacctttaggccagacctcatcatgaagtgc

K S G I G I A G VG T F R P D L I M K C

181 ttgattcctgtcatcatgtctggaatcatcgctgtctacgccctcgtcgtcgccgtcttg

L I P V I M S G II A V Y A L V V A V L

241 atcgcccaggatctcaacgctccgactgcaggcacgagttacgacctttttagaggcatc

I A Q D L N A P TA G T S Y D L F R G I

301 atgcacctcgcttgcggcctgtccgtcggtcttactggtcttgctgccggttactgcatc

M H L A C G L S VG L T G L A A G Y C I

361 ggcattgttggtgataagggtgtcagggcttacatggagcagtcaagaatctttgttggc

G I V G D K G V RA Y M E Q S R I F V G

421 atggtgctgattctgattttcggcgaggttttgggtctttatgggcttattgttgcgctc

M V L I L I F G EV L G L Y G L I V A L

481 attctcaacaccaggagccaggaataa

I L N T R S Q E *

本发明还同时提供了基因Movma11的用途，该基因Movma11的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。

本发明还同时提供了基因Movma11编码的蛋白质的用途，该蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。

本发明通过同源序列比对，在稻瘟病菌中克隆了与液泡融合相关的基因Movma11，并且对其进行了同源序列的比对和进化分析，结果说明Movma11基因在真核生物中的保守性很高。

本发明通过构建Movma11基因同源置换载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入到野生型稻瘟病菌，得到了基因缺失突变体ΔMovma11；在基因缺失突变体ΔMovma11中，重新引入Movma11基因，突变体的表型恢复，并且进行了表达水平上的检测。

本发明对稻瘟病菌Movma11基因进行了细胞定位，该基因在稻瘟病菌分生孢子、附着胞和菌丝的液泡上。

本发明分析了基因缺失突变体ΔMovma11的基本表型，稻瘟病菌Movma11基因缺失，气生菌丝变得非常稀疏，生长缓慢；产孢能力丧失，附着胞形成受阻；对水稻和大麦的致病性丧失。

本发明所涉及的基因因为同源重组造成的基因缺失突变导致稻瘟病菌菌丝稀疏、产孢量下降以及附着胞形成率下降，并且在感病水稻品种上的致病力缺失。因此，本发明最重要的用途是：应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因的表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物，或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰的化合物，从而开发出新的抗真菌药物。此外，本发明的用途还包括利用该基因的DNA或cDNA序列作为探针在其它真菌中分离与该基因具有一定序列同源性的序列。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：Movma11基因敲除位置和过程示意图。

图2：Southern杂交验证Movma11的敲除。

图2中：WT代表野生型Guy11菌株，VMA11-12和VMA11-15代表ΔMovma11。

图3： Movma11-GFP融合表达；Movma11-GFP融合蛋白在菌丝、分生孢子和附着胞中的表达。标尺 = 0.5 μm。

图3中：2-24h分别代表，接种分生孢子至附着胞成熟的不同时间。2h，分生孢子萌发形成芽管；4h，芽管顶端膨大形成钩状体；6h，附着胞形成初期；8h，附着胞形成；24h，附着胞成熟；Hyphae代表菌丝阶段。

图4：菌株在CM培养基和OMA培养基上的生长特性。

图5： ΔMovma11突变体的产孢量。

图6：ΔMovma11突变体对金属离子的敏感性增强。

图6中：野生型Guy11和恢复型菌株能够在这些离子环境下，正常生长。而突变体ΔMovma11基本上不能生长。

图7：不同碳源对ΔMovma11的影响。

图7中：以酪蛋白作为唯一碳源的培养基中，突变体ΔMovma11几乎不能生长，而野生型Guy11和恢复型菌株能够在各种碳源的培养基正常生长。

图8：离体水稻和大麦叶片上的致病性测试。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：Movma11基因的分离和克隆

从http://www.yeastgenome.org/网站搜索获得Saccharomyces cerevisiae Vma11/ YPL234C 基因的蛋白序列，在稻瘟病菌基因组数据库中http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html通过blastP进行同源序列搜索，获得一个预测蛋白MGG_03065.7，命名为Movma11。为了研究Movma11基因的功能，从稻瘟病菌野生型菌株Guy11的基因组中，利用引物McDNAp1和McDNAp2克隆了Movma11基因全序列，并且连接到pMD18-T载体上，进行了测序；同时，在野生型菌株Guy11的cDNA文库中克隆了该基因的编码序列，507bp，并且连接到pMD18-T载体上，进行了测序分析。DNA序列见SEQ ID NO：1， CDNA序列见SEQ ID NO：2。

实施例2： Movma11基因缺失突变体和互补突变体的获得

2.1 Movma11基因敲除载体的构建

以Guy11的基因组为模板，用引物VMA11up-1/2和VMA11dn-1/2分别扩增1.1kb的上、下游片段。

引物VMA11up-1/2和VMA11dn-1/2的序列（见表1）；

扩增体系为：

PCR反应体系（50μl）

扩增程序为：

PCR反应条件：

1. 94°C预变性 5min

2. 94°C 30s

3. 58°C 30s

4. 72°C 1min

2-4. 35个循环

5. 72°C 10min

6. 4°C 保温 。

用HPH-1/2引物，以质粒pCB1003为模版，扩增1.4 kb 潮霉素的片段。

HPH-1/2引物的序列（见表1）

PCR反应体系（50μl）

扩增程序为：

PCR反应条件：

1. 94°C预变性 5min

2. 94°C 30s

3. 60°C 30s

4. 72°C 72s

2-4. 35个循环

5. 72°C 10min

6. 4°C 保温 。

上面的三个片段利用PCR的方法进行融合，融合产物作为模版，用nVMA11-1/2引物进行扩增（引物的序列见表1），扩增的片段引入PstI/SalI位点（设计的引物上面含有PstI/SalI位点），连接到pCAMBIA1300相应位置，载体构建成功。所得的载体为包含Movma11基因上游序列-潮霉素抗性基因-下游片段的1300-Movma11载体。

具体如下：

获得融合产物的扩增体系为：

扩增程序为：

用nVMA11-1/2引物进行扩增体系：

PCR反应步骤如下：

表1、引物序列

备注说明：

上文中的1.1kb上游片段具体为：

CGACGCCAGTATCTTGTTTAATTATCAGCAGGTAGTGGGTATAGACGCTGGAATGATTTCAGCGCCAGGTAAGGTGAGTAGATAGACAGAGACAGTCTCGTTTTTTCCAGTTTAAGGTTGTGTCGTGTGGTTGCCCGCACACATTTCATCCAACGCCAAGGCACCTACCTACCTACCTCTACCTAGGTACCGAGATCAAATGCAAATCACAAAAAGGGATTGCTGCAAAGCTTAACACCATCCCAACCACACTCTCAGGCCATGTCCTACAGCGCTCAAAGGCGCTCACTGCTGCCGTCAATTATTGGGCCCGGCTAGATCTGCTTAACTTTACTACCCAGCGAGATCTAGCTAAGCCAAACGTAACGAGTTGGATGTATGCCTAGGTAATTACCTAGGTACCTACCTGTGGGTAAAGTACCTACCTACCGTACCTACCTACCTAGGTACCGACTCTTATCGCACAGTACCGTGGGGTCCATCATCCCGTCTGGCTTACAGTACCAGAAGGTTTAAACCACACGCGACGGTTCCGGATTTTGGTGGTTGGGACGGTTATCAGTGGGGCTAGACACTGTGCAATTGGTCTGCAAGCGACGACACCTGAACCGTCGGCTATGCTCCAGCCGCCACAGTCTGCCTGTACAGCAGTAATTCAAACTAGGTATCGGCAAGTTGTGTTAAGGCACTAAAAATGCACTAAATGTATCGTTTTTGAGCATGTTGGGAAATACATGGATTTCAAAGACAAAAAAGAGGACTTGATTGCAACCTTTTAACGCCTTTGGGCTCGTATCAAGTGCTCTTGACTCTCAGGTGATGTGATGTCATCCATGTCACCAGTCAGGTACGGCCTGACGAACAAAGAGTGGACCCTGAGGCCCGAGACTAGGTGGCCAGAGTTGCTCGAAGTCGAGCTTGCTGTCAAGTCACGTGGTCTAAACGCGAGCTTCCTCCGCGCTTCGTCCGGGGTCGCCATTAGAGCATCATCAGTCGCAGCCCTGGTCAAGCCCAACAGAACGACGACATTCAACATCATTTCTTGGGCAGCCGCATCTCAAATTTCTGTCGAATTGAGGCAGCTGCAATAAATCACG

上文中的1.1kb下游片段具体为：

GGAATAATTCGGACCTGTCGGATGCTCCATACTGCCCCCTTCAGCCACAAAGTCGAACCTCACAGACATCACGTACATGGGGGGAATGTCCCTATACTATTCCGCCAGGAGACGATGGAAGAGTTGAAGCAACCACCGGTGAGAGCATGGCAGCAGTTTCTGCTGTGCAGGGAAGTGTCAATATAGCATTTGGCCGGCGTTTTTTTCTTGGACAGTGAATCTACCTACTTATTTCTACATTTCCTTTGCAGTCTTTGACGACGGTTCACAGTGTACATTATATGGGCCCGGCATATTCGAGACTGCCAATATCTTGCAATAGAGATGATGCAGGGTCACCTTTTTCAGGTACAGTTAAAAAGTTACGACATTGTCACCACCCAGGATGAACGCATGCGGAACGAATGGGTACATAGCATACTCGTGTTCCCTAGTGCTAGTATGTACGGTCCTAACAATCTGAGTGGACTCCCCGTTCCGTTATGCAGTCAGATACGGCATATATGCCGTTCAGCTCAGTCTCCTATTTGTTCAGCTTCTGTGCATCGAATATCTTGAAATGCTGACATGAAAATTGTGTTGCCAGTTCTCTGTAAATGCCCAACATTGAAGAAAAAAGACAAAGGAAAGGAAATTCTCGCCAATTCATGCATGAAAAAAAAATGTGAAAAATATCCCAAAATCAACGACTCCGGGAATATGCAACAATATATGTGTCTTAAGGGTGATCCCCATGTCCTTTTCCCGGTCGAGGGTGATGATTCGACAGAATCGAAATGATGAACAAAGGAGACAAAAAGACAAAAGAAAAAACATCAAAGCTCTAGCTGGATTGTGCAGCTCGTGCCCGGCCAGCATTGGGCCGGTATCTGTTCGTGTGCGTCGTTTGATTTATGTTGGAAGATTGCCATCGCGGTGGCGTTTTCGTGGGGGTGAGGGCTATTATACCCTCATAGGAGGCGCCTGGACGAATTTCCTCGCCTATTGCGAGGCTGAAAGTCTCTCATCTGAGCTGCACATGGAACAGTATCAGTTTCAGGATTGGGTCCC

上文中的1.4 kb 潮霉素的片段具体如下：

TAGTGGAGGTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTCCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCATGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCCTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGCCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATG

用nVMA11-1/2引物进行扩增获得的片段序列---融合产物的序列内容（横线是Southern杂交的探针序列）：

GCAGGTAGTGGGTATAGACGCTGGAATGATTTCAGCGCCAGGTAAGGTGAGTAGATAGACAGAGACAGTCTCGTTTTTTCCAGTTTAAGGTTGTGTCGTGTGGTTGCCCGCACACATTTCATCCAACGCCAAGGCACCTACCTACCTACCTCTACCTAGGTACCGAGATCAAATGCAAATCACAAAAAGGGATTGCTGCAAAGCTTAACACCATCCCAACCACACTCTCAGGCCATGTCCTACAGCGCTCAAAGGCGCTCACTGCTGCCGTCAATTATTGGGCCCGGCTAGATCTGCTTAACTTTACTACCCAGCGAGATCTAGCTAAGCCAAACGTAACGAGTTGGATGTATGCCTAGGTAATTACCTAGGTACCTACCTGTGGGTAAAGTACCTACCTACCGTACCTACCTACCTAGGTACCGACTCTTATCGCACAGTACCGTGGGGTCCATCATCCCGTCTGGCTTACAGTACCAGAAGGTTTAAACCACACGCGACGGTTCCGGATTTTGGTGGTTGGGACGGTTATCAGTGGGGCTAGACACTGTGCAATTGGTCTGCAAGCGACGACACCTGAACCGTCGGCTATGCTCCAGCCGCCACAGTCTGCCTGTACAGCAGTAATTCAAACTAGGTATCGGCAAGTTGTGTTAAGGCACTAAAAATGCACTAAATGTATCGTTTTTGAGCATGTTGGGAAATACATGGATTTCAAAGACAAAAAAGAGGACTTGATTGCAACCTTTTAACGCCTTTGGGCTCGTATCAAGTGCTCTTGACTCTCAGGTGATGTGATGTCATCCATGTCACCAGTCAGGTACGGCCTGACGAACAAAGAGTGGACCCTGAGGCCCGAGACTAGGTGGCCAGAGTTGCTCGAAGTCGAGCTTGCTGTCAAGTCACGTGGTCTAAACGCGAGCTTCCTCCGCGCTTCGTCCGGGGTCGCCATTAGAGCATCATCAGTCGCAGCCCTGGTCAAGCCCAACAGAACGACGACATTCAACATCATTTCTTGGGCAGCCGCATCTCAAATTTCTGTCGAATTGAGGCAGCTGCAATAAATCACGTTAGTGGAGGTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTCCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCATGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCCTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGCCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGAGGAATAATTCGGACCTGTCGGATGCTCCATACTGCCCCCTTCAGCCACAAAGTCGAACCTCACAGACATCACGTACATGGGGGGAATGTCCCTATACTATTCCGCCAGGAGACGATGGAAGAGTTGAAGCAACCACCGGTGAGAGCATGGCAGCAGTTTCTGCTGTGCAGGGAAGTGTCAATATAGCATTTGGCCGGCGTTTTTTTCTTGGACAGTGAATCTACCTACTTATTTCTACATTTCCTTTGCAGTCTTTGACGACGGTTCACAGTGTACATTATATGGGCCCGGCATATTCGAGACTGCCAATATCTTGCAATAGAGATGATGCAGGGTCACCTTTTTCAGGTACAGTTAAAAAGTTACGACATTGTCACCACCCAGGATGAACGCATGCGGAACGAATGGGTACATAGCATACTCGTGTTCCCTAGTGCTAGTATGTACGGTCCTAACAATCTGAGTGGACTCCCCGTTCCGTTATGCAGTCAGATACGGCATATATGCCGTTCAGCTCAGTCTCCTATTTGTTCAGCTTCTGTGCATCGAATATCTTGAAATGCTGACATGAAAATTGTGTTGCCAGTTCTCTGTAAATGCCCAACATTGAAGAAAAAAGACAAAGGAAAGGAAATTCTCGCCAATTCATGCATGAAAAAAAAATGTGAAAAATATCCCAAAATCAACGACTCCGGGAATATGCAACAATATATGTGTCTTAAGGGTGATCCCCATGTCCTTTTCCCGGTCGAGGGTGATGATTCGACAGAATCGAAATGATGAACAAAGGAGACAAAAAGACAAAAGAAAAAACATCAAAGCTCTAGCTGGATTGTGCAGCTCGTGCCCGGCCAGCATTGGGCCGGTATCTGTTCGTGTGCGTCGTTTGATTTATGTTGGAAGATTGCCATCGCGGTGGCGTTTTCGTGGGGGTGAGGGCTATTATACCCTCATAGGAGGCGCCTGGACGAATTTCCTCGCCTATTGCGAGGCTGAAAGTCT

2.2 ΔMovma11突变体的获得

包含Movma11基因上游序列-潮霉素抗性基因-下游片段的1300-Movma11载体转化到农杆菌中后，通过ATMT方法利用农杆菌转化稻瘟病菌野生型菌株Guy11。在基因置换过程中，大部分外源DNA插入到稻瘟病菌的基因组中，由于两端同源序列的存在，部分会发生同源置换，同源置换的过程见图1。试验中总共得到30个转化子，提取所得转化子的基因组DNA，利用VMA11_yz1/2引物进行PCR验证（引物的序列见表1），其中部分转化子PCR产物电泳没有681bp的目的条带（SEQ ID NO1中加下划线部分），初步断定这些没有目的条带的转化子为基因置换突变体（这部分被潮霉素抗性基因替换）。选取其中两个突变体VMA11-12和VMA11-15大量提取基因组DNA，进行Southern杂交验证。用SacI对VMA11-12和VMA11-15的基因组进行酶切，野生型Guy11为对照，引物VMA11pb-1和VMA11pb-2的PCR扩增产物，1.0kb的片段，合成杂交探针。

备注说明：突变体VMA11-12和VMA11-15 的PCR产物电泳中没有681bp的目的条带。

转化子PCR反应体系：

反应程序

本发明Southern杂交用Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒（DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Kit I）进行。杂交探针的合成：反应体系与程序，与上游片段操作方法相同。获得的PCR产物，进行探针合成，步骤如下：

1)取1μg 探针PCR产物加灭菌双蒸水至16µl。

2)沸水浴中温育10min，使DNA变性，并迅速在冰水中冷却。

3)混匀DIG-High Prime，加4μl DIG-High Prime到变性的模板DNA中，混合并稍离心。在37˚C水浴中温浴24h。

杂交结果显示，野生型Guy11菌株在5.1kb处有杂交信号，而VMA11-12和VMA11-15在8.9kb处有杂交信号并且是单拷贝，该杂交结果证实了VMA11-12和VMA11-15为Movma11基因缺失突变体（图2）。选取VMA11-12进行单孢分离并保存进行后续试验。

备注说明：突变体VMA11-12和VMA11-15生长速度缓慢，气生菌丝少；野生型菌株气生菌丝较多，呈灰色。

2.3 互补载体的构建

为了验证突变体的表型是因为基因Movma11的缺失引起的，构建了互补载体p1300SUR- VMA11。利用引物VMA11-C1/2扩增了含有1.5 kb的上游序列和0.98 kb下游序列的全长Movma11基因，克隆到pMD18-T载体。用EcoRI和XbaI双酶切后，回收4.38kb的Movma11基因片段，连接到pCAMBIA1300X-SUR载体的EcoRI/XbaI位点上，获得互补载体p1300SUR-VMA11。选择标记基因SUR（常规标记基因，来自质粒pCB1532）扩增自pCB1532载体并且连接到pCAMBIA1300X的EcoRV/EcoRI位点，构成pCAMBIA1300X-SUR。将p1300SUR-VMA11载体转化到农杆菌中后，通过ATMT方法利用农杆菌转化稻瘟病菌突变体ΔMovma11（即突变体VMA11-12和VMA11-15）。

由于Movma11缺失突变体和野生型的差异非常大，互补后，缺失突变体的表型得到恢复，表型与野生型Guy11相同。ΔMovma11表型的变化是由Movma11基因的缺失引起的。选取互补菌株Movma11C进行后续试验（备注说明：C表示补充、恢复的意思）。

备注说明：互补后，突变体ΔMovma11的缺失表型得到恢复，互补菌株Movma11C生长速度变快，气生菌丝增多，与野生型Guy11的表型相同。

Movma11C由VMA11-12 互补后而得。

实施例3：荧光观察

3.1荧光载体的构建

利用前面卢建平等文章，构建的载体pKD5-GFP为骨架，把MoVMA11的编码序列（MoVMA11的cDNA 序列）构建在载体的BamHI/SmaI位置，构建成荧光表达载体。

3.2荧光观察

CM液体培养基上培养MoVAM11-GFP融合表达的转化子（上述3.1构建所得的产物），挑取分生孢子和菌丝，在共聚焦荧光显微镜Leica TCSSP5下观察，可以看到荧光在分生孢子和菌丝的液泡上均有表达。用FM4-64染色，发现绿色荧光与FM4-64染色的红色荧光可以共定位。将分生孢子的悬浮液（10⁵个/ml）滴到塑料盖玻片的表面上，用无菌水代替液体CM培养基诱导附着胞形成，观察荧光表达情况，同样发现在附着胞的液泡上表达（图3）。

实施例4：突变体表型分析

4.1 突变体菌落形态

在CM培养基上，ΔMovma11菌落的气生菌丝非常稀疏，生长缓慢，尤其是在OMA培养基上，生长缓慢；而野生型Guy11和互补型Movma11C的气生菌丝浓密，菌落呈灰褐色（图4）。Movma11基因的缺失影响了稻瘟病菌的菌落形态和生长速度。

4.2 突变体ΔMovma11气生菌丝产孢量明显下降

将菌株接种在CM培养基上，16小时光照，26°C生长7天后，无菌水将菌落表面菌丝洗掉，然后在超净工作台上，经无菌风吹干后继续培养3天。然后打孔，统计分生孢子产量。野生型Guy11的孢子产量为5.22±0.87×10⁵个/ml，互补型的菌株Movma11C孢子产量为4.8±0.33×10⁵个/ml，而基因缺失突变体ΔMovma11没有孢子产生（图5）。因此，基因Movma11缺失，严重影响稻瘟病菌的产孢能力。

4.3 ΔMovma11突变体对金属离子的敏感性

突变体ΔMovma11在含有Ca²⁺ (200 mM)，Cu²⁺ (1 mM)， Fe²⁺ 或者Fe³⁺ (3 mM)，Mn²⁺ (3 mM)和Zn²⁺ (4 mM)的培养基（MM培养基）中，基本上不能生长（图6）；而野生型Guy11和恢复型菌株能够在这些离子环境下，正常生长。

MM培养基配方如下：

MM培养基：

4.4 不同碳源对ΔMovma11的影响

在发酵型碳源（葡萄糖、果糖、淀粉）或者非发酵型碳源的培养基（酪蛋白、橄榄油、三油精、果胶）中，以酪蛋白作为唯一碳源的培养基中，突变体ΔMovma11几乎不能生长，而野生型Guy11和恢复型菌株在各种碳源的培养基中，能够正常生长（图7）。

备注说明：图7中的培养基，使用的是MM培养基，将葡萄糖换成其他的碳源。

实施例5：ΔMovma11突变体致病性丧失

在实验室条件下，菌株在CM平板上生长7天后，打孔。将菌块接种在育苗8天的大麦离体叶片上和育苗21天的水稻上，未接菌的叶片作对照。保湿4天后观察发病情况。结果显示，Guy11和Movma11C接种的叶片上产生黄褐色的病斑（图8）；而ΔMovma11没有可见病斑产生。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11，其特征是：该基因Movma11的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的真菌致病性基因Movma11编码的cDNA序列，其特征是：所述的cDNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的真菌致病性基因Movma11编码的蛋白质，其特征是：所述的蛋白质具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1或2所述的真菌致病性基因Movma11的用途，其特征是：基因Movma11的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标。

5.如权利要求3所述的蛋白质的用途，其特征是：所述蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。

Images