CN110656116A - 基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明采用Split‑marker重组技术构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因FoCWM从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFocwm；该突变体与其野生型相比，生长速率减慢，气生菌丝变得致密，穿透力减弱，并对细胞壁的完整性有重要作用。致病性试验表明，FoCWM的缺失显著降低了香蕉枯萎病菌的致病力。本发明证实FoCWM是香蕉枯萎病菌生长发育、维持细胞壁完整性和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

Description

基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)引起的一种土传维管束坏死的系统性病害，是目前制约我国香蕉生产的最重要因素。根据Foc对不同香蕉品系或者属种的致病性差异，将其划分为3个生理小种；其中，以4号生理小种(Foc4)对香蕉的危害性最大，其几乎能侵染所有品种的香蕉。研究表明，香蕉枯萎病菌成功侵染香蕉根系依赖于一系列致病因子，主要包括各种酶类、毒素、生长调节物质及其类似物、分泌蛋白等。因此，充分挖掘Foc致病相关基因并开展其功能研究，对有效控制该病菌的危害和选育抗病品种具有重要意义。

在开展香蕉枯萎病菌分泌蛋白质组学的研究中，我们鉴定到一个未知蛋白(Uncharacterized protein)；Uniprot数据库分析表明，该蛋白具有疏水表面结合蛋白A(Hydrophobic surface binding protein A，HsbA)结构域，不含半胱氨酸残基，含有N-端信号肽，属于经典分泌蛋白。研究发现，在一些真菌中发现含有HsbA结构域的同源蛋白存在，功能预测分析表明这些蛋白的功能不同，例如一些预测具有激素功能、一些预测为生长因子。采用实时荧光定量PCR技术，对稻瘟菌中含HsbA结构域的蛋白基因进行分析，发现其在附着胞阶段表达量相对较高，推测该基因可能与附着胞的形成相关(翟焕趁等，2011)。我们在香蕉枯萎病菌中发现一个含HsbA结构域的新基因FoCWM，其具体生物学功能不清楚。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

本发明公开了香蕉枯萎病菌一个新的未知蛋白基因FoCWM及其编码蛋白CWM的功能。基因FoCWM为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白CWM为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；CWM蛋白含有HsbA结构域。本发明采用Split-marker重组技术构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因FoCWM从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFocwm；该突变体在生长发育方面存在缺陷。致病性测定结果表明，敲除突变体ΔFocwm对巴西蕉的致病力显著降低。上述试验证明，香蕉枯萎病菌FoCWM基因为香蕉枯萎病菌的致病相关基因。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。

进一步的，所述的基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌生长发育中的应用。

进一步的，所述的基因FoCWM在维持香蕉枯萎病菌细胞壁完整性中的应用。

进一步的，所述的基因FoCWM在维持香蕉枯萎病菌的穿透力中的应用。

本发明提供一种基因FoCWM在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用。

本发明提供一种基因FoCWM作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoCWM的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。

阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoCWM的表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

其中，所述的基因FoCWM，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

所述的基因FoCWM，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；

进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。

含有上述香基因FoCWM的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的香蕉枯萎病菌基因FoCWM含有HsbA结构域，但其在香蕉枯萎病菌的生物学功能并不清楚。试验证明，将蛋白CWM的编码基因FoCWM的一段序列用潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换后，所得到的Foc4敲除突变体与其野生型相比，生长速率减慢，气生菌丝变得致密，穿透力减弱，并对细胞壁的完整性有重要作用。致病性试验表明，FoCWM的缺失显著降低了香蕉枯萎病菌的致病力。本发明证实FoCWM是香蕉枯萎病菌生长发育、维持细胞壁完整性和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是香蕉枯萎病菌FoCWM同源重组的构建示意图。

图2是部分潮霉素抗性转化子FoCWM的PCR扩增；其中，泳道WT：Foc4野生型；泳道3、4、5、8...82，分别表示不同转化子。

图3是部分潮霉素抗性转化子A-hph基因的PCR扩增；其中，泳道WT：Foc4野生型；泳道3、4、5、8...82分别表示不同转化子。

图4是以FoCWM片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；泳道1：Foc4野生型；泳道2-6：转化子68，43，8，5，4。

图5是以hph片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；其中，泳道1：转化子43；泳道2：转化子4。

图6是敲除突变体ΔFocwm在PDA培养基上的菌落形态。

图7是敲除突变体ΔFocwm细胞壁完整性分析。

图8是敲除突变体ΔFocwm穿透能力分析。

图9是敲除突变体ΔFocwm的致病性分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、实验材料

1.1供试菌株及供试植物

供试菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)；供试植物为具有4～5片叶的巴西蕉(Cavendish，AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌：大肠杆菌DH5α；

质粒载体：基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74。

2、实验方法

2.1香蕉枯萎病菌敲除重组片段的构建

采用Split-marker重组技术，对FoCWM基因敲除重组片段进行了构建(图1)。以Foc4基因组DNA为模板，设计特异引物，对FoCWM基因的左右同源臂片段进行扩增；以载体pCT74为模板，设计特异引物，扩增标记基因HYGS(含hph+SGFP)的左片段hy与右片段ygs(表1)。

表1 FoCWM左右同源臂A片段、B片段片段和标记基因HYGS左片段hy、右片段ygs的扩增引物

引物名称	引物序列5’-3’
		FoCWM-AF(P1)	GCCGATCCTTCGACTCACAT
FoCWM-AR(P2+C5)	<u>GTAGATGCCGACCGGGAAC</u>GAGAGCTTGATGCAACGAGTAA
		FoCWM-BF(C8+P3)	<u>AACATGAGAATTCCTGCAGCC</u>TTGGGAAATGAGGGACGAGT
FoCWM-BR(P4)	CGAGCCAATGCTGAGAATGC
		hy-F(P5)	GTTCCCGGTCGGCATCTAC
hy-R(P6)	CATTGGGGAGTTCAGCGAGA
		ygs-F(P7)	CCAGAAGAGGATGTTGGCGA
ygs-R(P8)	GGCTGCAGGAATTCTCATGTT

2.1.1 FoCWM基因左右同源臂片段的扩增

用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)提取Foc4基因组DNA；以其为模板，用FoCWM-AF(P1)/FoCWM-AR(P2+C5)为引物，用高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)进行PCR扩增，获得FoCWM基因的同源臂A片段(FoCWM-A)；用引物FoCWM-BF(C8+P3)/FoCWM-BR(P4)进行PCR扩增，获得FoCWM基因的同源臂B片段(FoCWM-B)。扩增体系如表2，扩增条件为：98℃反应5min；98℃反应10sec，55℃反应5sec，72℃反应90sec，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒对PCR扩增产物进行清洁回收。

表2 PrimeSTAR扩增体系(50μL)

样品名称	加样量
		模板DNA	1.5μL(<200ng)
引物F(10μmol/L)	1.5μL
		引物R(10μmol/L)	1.5μL
5×PrimeSTAR Buffer(Mg<sup>2+</sup>Plus)	10.0μL
		dNTP Mixture(2.5mM each)	4.0μL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	31μL

2.1.2标记基因HYGS(含hph+SGFP)左右片段的扩增

用质粒提取试剂盒(OMEGA Plasmid Mini Kit)提取pCT74质粒，并以其为模板，hy-F(P5)/hy-R(P6)为引物，使用高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)进行PCR扩增，获得HYGS左片段hy；用引物ygs-F(P7)/ygs-R(P8)进行PCR扩增，获得HYGS右片段ygs。扩增体系如表2；扩增条件为：98℃反应5min；98℃反应10sec，55℃反应5sec，72℃反应2min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit对PCR扩增产物进行清洁回收。

2.1.3 FoCWM基因重组片段的扩增

以FoCWM基因同源臂A片段(FoCWM-A)与标记基因HYGS左片段hy为模板，用FoCWM-AF(P1)/hy-R(P6)为引物进行PCR扩增，获得融合片段FoCWM-Ahy。以FoCWM基因同源臂B片段(FoCWM-B)与标记基因HYGS右片段ygs片段为模板，用ygs-F(P7)/FoCWM-BR(P4)为引物进行PCR扩增，获得融合片段FoCWM-ygsB。扩增体系见表2；扩增条件为：98℃反应5min；98℃反应10sec，55℃反应5sec，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。使用Omega GelExtraction Kit对PCR扩增产物进行切胶回收。

2.2 Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L，pH为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，200×铁盐5mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×10⁶个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl₂)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×10⁷个/mL。

2.3 Foc4原生质体的转化

将3～5μg的重组片段FoCWM-Ahy与FoCWM-ygsB与200μL的Foc4原生质体混匀，冰浴15min。逐滴加入新鲜配制的PSTC转化缓冲液(40％PEG4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5)1mL，混匀后冰上放置15min。加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mL PSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。

2.4 Foc4敲除突变体的PCR验证分析

按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取潮霉素阳性转化子基因组DNA，用PCR进行验证分析，分别用引物FoCWM-F/FoCWM-R进行基因片段FoCWM的PCR扩增；用引物A-hph-F/A-hph-R进行基因片段A-hph的PCR扩增分析；具体的PCR扩增体系见表3。

FoCWM-F：5′-AGCCTTCTCCCCTTGATTGC-3′，

FoCWM-R：5′-CCTCGTAGTTTGCTGTACTTGC-3′，

A-hph-F：5′-GTGAAGTGTCGGTATGGGCA-3′，

A-hph-R：5′-GGACGGGATGCTGATAGTCG-3′；

表3 rTaq扩增体系(25μL)

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，57℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。

2.5 Foc4敲除突变体的Southern blot分析

按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot分析。用引物FoCWM-F/FoCWM-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。DNA探针的PCR扩增体系如表4。

FoCWM-F：5′-AGCCTTCTCCCCTTGATTGC-3′，

FoCWM-R：5′-CCTCGTAGTTTGCTGTACTTGC-3′，

hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，

hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；

表4 Ex Taq扩增体系(50μL)

样品名称	加样量
		模板DNA	1.0μL
引物F(10μmol/L)	1.0μL
		引物R(10μmol/L)	1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	5.0μL
		dNTP Mixture(2.5mM each)	4.0μL
rTaq(5U/μL)	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	37.5μL

PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，54℃反应1min，72℃反应2min，共32个循环；72℃反应10min。

2.6 Foc4敲除突变体的表型观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型菌株和敲除突变体ΔFocwm接种于PDA培养基，于28℃下培养5d，观察菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

(2)分生孢子产生及菌丝形态观察。将Foc4野生型菌株和敲除突变体ΔFocwm接种到查氏培养基中，于28℃下120rpm震荡培养，观察分生孢子产生及菌丝形态。每个处理设置3个重复。

(3)细胞壁完整性测定。将Foc4野生型菌株和敲除突变体ΔFocwm分别接种到含有不同浓度山梨醇(1mol/L和2mol/L)和刚果红(100μg/mL和200μg/mL)的PDA培养基，于28℃下培养7d，观察菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

2.7Foc4菌敲除突变体的穿透力检测

将Foc4野生型菌株和敲除突变体ΔFocwm分别接种于覆盖有一层再生纤维素膜(玻璃纸，购自Solarbio，型号YA0620)的PDA培养基平板，于28℃下培养3d，掀去玻璃纸，再于28℃，黑暗培养2～3d，观察菌落生长情况。每个处理设置3个重复。

2.8敲除突变体ΔFocwm的致病性测定

采用伤根接种法，对敲除突变体ΔFocwm进行致病性测定。选取4～5叶期的健康巴西蕉，用2×10⁵个/mL的孢子悬浮液浸根30min，再移栽于营养土中；置于25±1℃的植物培养室内培养，于光/暗12h/12h交替培养，25d后统计发病情况。分别以Foc4野生菌株和无菌水作为阳性和阴性对照。

3结果与分析

3.1香蕉枯萎病菌FoCWM重组片段的构建

应用PCR技术分别克隆获得了FoCWM基因同源臂A、同源臂B片段、以及标记基因的左片段hy和右片段ygs。通过融合PCR技术，获得了敲除重组片段FoCWM-Ahy和FoCWM-ygsB。

3.2香蕉枯萎病菌敲除突变体的筛选

3.2.1基因片段FoCWM的PCR验证

利用同源重组方法，将基因敲除重组片段FoCWM-Ahy和FoCWM-ygsB转化Foc4原生质体，获得了90个具有潮霉素抗性的转化子。经基因组DNA的提取，利用FoCWM基因特异性引物，对这些潮霉素抗性转化子进行了PCR分析。结果表明，有15个转化子没有扩增到FoCWM基因，初步鉴定这15个转化子为阳性转化子(图2)。

3.2.2基因片段A-hph的PCR验证

以上述15个没有扩增到FoCWM基因的转化子基因组DNA为模板，利用A-hph特异性引物进行PCR扩增；结果表明，这15个转化子均能扩增出约1800bp的目的片段，进一步说明这15个转化子为阳性转化子(图3)。

3.2.3敲除突变体的Southern blot验证

随机选取5个验证为阳性的转化子进行Southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，有2个转化子未有杂交条带(图4)。以hph为探针进行杂交，发现转化子4没有杂交条带；而转化子43有单拷贝条带并且符合预期片段大小(图5)，证实该转化子为阳性转化子，标记为ΔFocwm-43。

3.3敲除突变体ΔFocwm的菌落形态和生长速率分析

与Foc4野生型相比，敲除突变体ΔFocwm在PDA培养基中生长缓慢，菌丝更为致密，菌丝颜色与色素无显著差异(图6)。产孢试验结果表明，ΔFocwm产生的分生孢子较小，孢子形态无明显差异；突变体菌丝与野生型相比无显著差异。

3.4香蕉枯萎病菌敲除突变体的细胞壁完整性测定

将敲除突变体ΔFocwm-43分别接种于含不同浓度山梨醇和刚果红(CR)的PDA培养基，对其菌落形态进行了观察。结果表明，与野生型相比，山梨醇对ΔFocwm的抑制效果更为显著，说明突变体抗高渗透压的能力减弱。刚果红处理对Foc4野生型具有明显的抑制作用，而对ΔFocwm则几乎没有影响(图7)，说明敲除FoCWM影响了香蕉枯萎病菌细胞壁的完整性。

3.5敲除突变体ΔFocwm-43的穿透力检测

穿透力试验结果表明，ΔFocwm不能穿透玻璃纸，而野生型菌株则能穿透玻璃纸形成菌落；说明敲除FoCWM影响了Foc4的穿透力。(图8)。

3.6敲除突变体ΔFocwm的致病性分析结果

致病性分析表明，Foc4野生型接种后，巴西蕉叶片上出现了明显的黄化枯死，且球茎大面积(超过50％)变黑变褐。接种敲除突变体ΔFocwm后，巴西蕉叶片发病较轻，仅下部叶片出现黄化，球茎的变色面积约为20％。病情指数统计分析表明，ΔFocwm接种后的病情指数显著低于野生型(图9)。该结果说明敲除FoCWM基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显下降。

因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基因FoCWM的核苷酸序列

<400> 1

atgcgtctca gccttctccc cttgattgcc ctcgctggct ctgccttcgc atctggagat 60

tctatctcga cggccattga taacatctcc aatgccacgc ttgctctcaa caagactgtg 120

gcgacgtggc ctcagaccct tctcggtgct ctgccaatta ctacaaagtc aacactgctc 180

ctcaccgaga tccacaaggg ctttgtgatc gctcgcgagt ctgagcctct atctcttgag 240

gaaaccctcc aagtcgcaaa ggctacatct gagctcagcg ccgacgtcga gctcaccatc 300

aacaccatca ttgccgccaa acccaacttt gacagactac aagtcagccc tgtcatcctc 360

ctcaacctga acctacagcg cgccctcagc caggactttt cggaagcagt catatccaag 420

gtccccaaag acctccaagg aaacgcaaaa gcactggtac aaggcatcga cgacagtttt 480

gcaagggcta taagcaagta cagcaaacta cgaggttaa 519

<210> 2

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基因FoCWM的氨基酸序列

<400> 2

Met Arg Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ile Ala Leu Ala Gly Ser Ala Phe

1 5 10 15

Ala Ser Gly Asp Ser Ile Ser Thr Ala Ile Asp Asn Ile Ser Asn Ala

20 25 30

Thr Leu Ala Leu Asn Lys Thr Val Ala Thr Trp Pro Gln Thr Leu Leu

35 40 45

Gly Ala Leu Pro Ile Thr Thr Lys Ser Thr Leu Leu Leu Thr Glu Ile

50 55 60

His Lys Gly Phe Val Ile Ala Arg Glu Ser Glu Pro Leu Ser Leu Glu

65 70 75 80

Glu Thr Leu Gln Val Ala Lys Ala Thr Ser Glu Leu Ser Ala Asp Val

85 90 95

Glu Leu Thr Ile Asn Thr Ile Ile Ala Ala Lys Pro Asn Phe Asp Arg

100 105 110

Leu Gln Val Ser Pro Val Ile Leu Leu Asn Leu Asn Leu Gln Arg Ala

115 120 125

Leu Ser Gln Asp Phe Ser Glu Ala Val Ile Ser Lys Val Pro Lys Asp

130 135 140

Leu Gln Gly Asn Ala Lys Ala Leu Val Gln Gly Ile Asp Asp Ser Phe

145 150 155 160

Ala Arg Ala Ile Ser Lys Tyr Ser Lys Leu Arg Gly

165 170

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-AF（P1）

<400> 3

gccgatcctt cgactcacat 20

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-AR（P2+C5）

<400> 4

gtagatgccg accgggaacg agagcttgat gcaacgagta a 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-BF（C8+P3）

<400> 5

aacatgagaa ttcctgcagc cttgggaaat gagggacgag t 41

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-BR（P4）

<400> 6

cgagccaatg ctgagaatgc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hy-F（P5）

<400> 7

gttcccggtc ggcatctac 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hy-R（P6）

<400> 8

cattggggag ttcagcgaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ygs-F（P7）

<400> 9

ccagaagagg atgttggcga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ygs-R（P8）

<400> 10

ggctgcagga attctcatgt t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-F

<400> 11

agccttctcc ccttgattgc 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FoCWM-R

<400> 12

cctcgtagtt tgctgtactt gc 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> A-hph-F

<400> 13

gtgaagtgtc ggtatgggca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> A-hph-R

<400> 14

ggacgggatg ctgatagtcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-F

<400> 15

tgctgctcca tacaagccaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hph-R

<400> 16

gacattgggg agttcagcga 20

Claims (10)

1.基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM在调控香蕉枯萎病菌生长发育中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM在维持香蕉枯萎病菌细胞壁完整性中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM在维持香蕉枯萎病菌的穿透力中的应用。

5.权利要求1所述的基因FoCWM在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用。

6.权利要求1所述的基因FoCWM作为用于植物病害防治的药物靶标的应用，其特征在于：所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物。

8.一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，其特征在于：包含阻断或抑制权利要求1所述基因FoCWM的表达。

9.阻断或抑制权利要求1所述基因FoCWM的表达的药剂在制备药物中的应用，其特征在于：

所述的药剂是权利要求1所述基因FoCWM的反义RNA或siRNA，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的基因FoCWM，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：

A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；

B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

C、以上A和B通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物。

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