CN110885840A - 一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法 - Google Patents

一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法 Download PDF

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Abstract

本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法。本公开基于对来源于里氏木霉(Trichoderma reesei，CCTCC NO:M2015804)的转录因子Cre1进行基因改造，将其末端突变，可以解除葡萄糖条件下CCR效应对纤维素酶表达的抑制，最终提高主要纤维素酶酶活及蛋白量，有利于在葡萄糖存在条件下纤维素酶的生产。该研究结果对纤维素酶工业生产过程中诱导物开发具有重要的指导意义。

Description

一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法
技术领域
本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种通过对里氏木霉中转录因子的改造来减轻或者解除微生物培养过程中葡萄糖等速效简单碳源导致的碳分解代谢物阻遏(carboncatabolite repression,CCR)效应，提高菌株生产纤维素酶的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
丝状真菌是自然界中降解木质纤维素类生物质的主要微生物，其所产的纤维素酶主要包括三种组分(纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶)，这三种酶相互协同对纤维素底物进行有效降解。
里氏木霉(Trichoderma reesei)是公认的纤维素酶高产菌株，也是纤维素酶生产工业菌株的主要来源。其生产纤维素酶必须要有诱导物的存在。纤维素是天然诱导物，但是纤维素不溶于水，需要通过菌株本底低水平纤维素酶，在非均相催化和非最适反应温度条件下缓慢水解纤维素释放真实诱导物β-糖链寡糖，才能诱导纤维素酶大量合成，这一过程显著延长了纤维素酶发酵时间，降低发酵罐的纤维素酶生产强度。由于丝状真菌纤维素酶液体深层发酵为高粘度非牛顿型流体，发酵过程中通风和搅拌混合能耗极高，而且纯纤维素，特别是诱导效果较好的微晶纤维素价格昂贵。因此，采用价格低廉的液体诱导物是解决上述问题的有效策率。目前常用的液体诱导物为乳糖、槐糖等碳源。为降低成本，粗品中包含大量的葡萄糖，并且其降解也会产生大量的葡萄糖，而过量的葡萄糖等速效碳源会引起菌株碳代谢阻遏效应，反而抑制纤维素酶生产。
碳代谢阻遏(Carbon Catabolite Repression,CCR)效应是微生物中普遍存在的一种重要调控机制，当有葡萄糖等速效碳源存在的情况下，降解复杂碳源的酶基因表达会受到明显抑制。例如，在T.reesei纤维素酶基因表达系统中，有较高浓度葡萄糖存在情况下，槐糖等诱导物无法诱导纤维素酶基因表达，同时向已表达纤维素酶的诱导培养条件下添加葡萄糖，主要的纤维素酶基因转录也会消失。因此，通过人工诱变、基因工程改造等方法改良菌株性状，选育去CCR效应的菌株，对纤维素酶工业化生产有重要意义。
Cre1是发现参与CCR过程的重要转录因子，其为Cys2His2型锌指蛋白，可通过与纤维素外切酶基因cbh1启动子上四个位点进行结合，从而抑制cbh1的转录，实现在葡萄糖存在条件下的CCR效应(参考FEBS Letters,1995,376:103-107；FEMS MicrobiologyLetters,1996,145:361-366.)。研究发现，无论在诱导条件或抑制条件下，Cre1的缺失或截短均导致纤维素酶表达量较出发菌株有所提高。但是，Cre1是一个全局性的调控因子，作用方式非常复杂，除了参与CCR效应外，还对菌体生长、孢子萌发等生理过程有明显影响(参考Applied and Environmental Microbiology,2009,75:4853-4860)。并且在乳糖诱导条件下，纤维素酶基因转录激活因子xyr1和ace2基因转录需要有Cre1蛋白的存在(参考Eukaryotic Cell,2011,10:262-271)。否则，Cre1蛋白的缺失将导致里氏木霉生物量大幅度下降，从而导致最终纤维素酶产量严重下降。因此，发明人认为，通过对其进行敲除达到纤维素酶高表达的方法是不可行的。
发明内容
发明人针对丝状真菌碳阻遏效应进行了进一步研究，将T.reesei中的Cre1386位点氨基酸之后的序列进行了截短和延长，发现葡萄糖条件下，主要纤维素酶基因的转录水平发生了明显地提高，有效地缓解了CCR效应。并且通过对Cre1蛋白386位之后的387-390的四个氨基酸位点进行了突变，发现存在387和388的位点突变后，在不同碳源的培养基中均能够良好的生长，且纤维素酶的产量大幅度提高。
基于研究成果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种解除CCR效应的基因序列，所述基因序列编码的如SEQID No:2-No.5所示的氨基酸序列。
优选的，所述基因序列包括由于密码子简并性能够翻译得到SEQ ID No:2-No.5所示氨基酸序列的基因序列。
本公开第二方面，提供一种表达盒，所述表达盒包括第一方面所述基因序列。
本公开第三方面，提供一种重组载体，所述重组载体中包括第二方面所述表达盒或第一方面所述基因序列的完整编码阅读框序列。
优选的，所述载体为质粒或病毒载体。
进一步优选的，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
本公开第四方面，提供一种解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述基因序列、第二方面所述表达盒或第三方面所述的重组载体。
优选的，所述试剂盒中还包括转化试剂、染色体抽提试剂、扩增酶及电泳试剂。
本公开第五方面，提供一种解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的方法，所述方法包括采用第三方面所述重组载体或第四方面所述试剂盒对丝状真菌Cre1的序列进行改造。
优选的，所述改造步骤如下：
采用原生质体转化法将所述第三方面所述重组载体转化到丝状真菌中；通过初步抗性筛选及测序验证，即得到突变株。
优选的，所述丝状真菌为里氏木霉菌(Trichoderma reesei)。
本公开第六方面，提供一种纤维素酶的表达方法，所述表达方法包括采用第三方面所述重组载体或第四方面所述试剂盒对产纤维素酶的菌株Cre1序列进行改造。
本公开第七方面，提供第一方面所述解除CCR效应的基因序列、或第二方面所述表达盒、第三方面所述重组载体、第四方面所述解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的试剂盒在纤维素酶生产领域的应用。
本公开第八方面，一种提高纤维素酶活的方法，所述方法包括对产纤维素酶的微生物进行基因工程改造使微生物CCR效应减弱。
优选的，所述基因工程改造包括对转录因子Cre1的C-末端的去除、添加、突变或者去磷酸化。
进一步优选的，所述点突变位点为Cre1的C末端386位之后的氨基酸残基。
进一步优选的，所述点突变位点为Cre1的C末端S387，S388，T389，T390的氨基酸残基。
进一步优选的，所述突变为点突变方式，突变为缬氨酸或者丙氨酸。
优选的，所述微生物包括具有CCR效应的产纤维素酶的菌，具体如里氏木霉，草酸青霉，黑曲霉，构巢曲霉，棘孢曲霉等。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
经本公开方法改造的菌株，在不同碳源的培养基中均能够良好的生长，且纤维素酶的产量大幅度提高。本公开的出发菌株为突变筛选后的纤维素酶高产菌株，本公开针对该高产菌株序列进行改造，突变株的纤维素酶产量和活性都获得了进一步的提高。将该改造方法应用于工作酶的改造，使其可以适应速效碳源培养基，降低培养成本的同时提高酶的产量，具有良好的经济意义。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，当速效碳源存在的情况下，微生物会产生碳代谢阻遏效应从而抑制纤维素酶基因的表达。为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种针对里氏木霉Cre1序列的386位点氨基酸之后的序列的截短和延长以及特定位点突变，从而实现提高纤维素酶活力的方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实验材料和试剂：
麸皮培养基：称取200g麸皮到1L自来水中，沸水煮30min，使用8-12层纱布过滤，并定容到1L，加入2％的琼脂粉，121℃灭菌30min。
MM培养基：配方为0.5％(NH4)2SO4,0.06％MgSO4,1.5％KH2PO4,0.08％CaCl2,0.00005％FeSO4.7H2O,0.00016％MnSO4.H2O,0.00014％ZnSO4.7H2O,0.00002％CoCl2。
PDA固体培养基(g/L)：土豆去皮薄片200g，加一定水煮沸30min，双层纱布过滤后定容到1000mL，葡萄糖20，琼脂粉20。
转化上层培养基：2％葡萄糖，18.22g山梨醇，MM盐定容至100mL，调pH到5.5,加入2％琼脂糖，115℃灭菌30min。
转化下层培养基:2％葡萄糖，1.5％磷酸二氢钾，18.22g山梨醇，加水定容至100mL，调节pH到5.5，加入2％琼脂糖，115℃灭菌30min。
传代培养基：2％的葡萄糖，MM盐，加水定容至100mL，调节pH到5.5，加入2％琼脂糖，115℃灭菌30min。
种子培养基：1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，0.05％无水硫酸镁，1％麸皮，1％玉米芯，0.3％磷酸二氢钾，0.5％碳酸钙。
产酶培养基：2％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.14％硫酸铵，0.2％磷酸二氢钾，0.013％尿素，0.05％Tween 80。
转化用溶液:
转化溶液1：1.2M山梨醇(21.88g)，0.1M磷酸二氢钾(1.36g)，蒸馏水定容至100mL，调节pH到5.6。
转化溶液2：1M山梨醇(18.22g)，50mM氯化钙(0.735g)，10mM Tris-HCI，1mL1 MTris-HCI，蒸馏水定容至100mL，调节pH到7.5。
转化溶液3：25％聚乙二醇6000(25g)，50mM氯化钙(0.735g)，10mM Tris-HCI，1mL1M Tris-HCI，蒸馏水定容至100mL，调节pH到7.5。
真菌染色体抽提Buffer：200mM Tris-HCl(4.846g)，250mM氯化钠(2.922g)，25mMEDTA(1.8612g)，2％SDS(0.4g)，蒸馏水定容至200ml，室温保存。
以下实施例中的出发菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei，CCTCC NO:M2015804)，为本实验室诱导突变而来的纤维素酶高产菌株，其Cre1氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。
实施例1里氏木霉Cre1突变株构建
1.使用Phanta高保真酶对目的基因进行扩增，体系如下：
Figure BDA0002279468990000051
Figure BDA0002279468990000061
PCR程序设定：
Figure BDA0002279468990000062
2.胶配置及其电泳：
①0.8％(质量体积分数)琼脂糖凝胶的配置：
0.4g琼脂糖加入50mL 1×TAE电泳缓冲液中，微波炉加热至完全溶解/完全透明液体状态，加入3-4μL Genegreen核酸染料，倒入制胶板中，等待胶凝固；
②样品准备：5μL样品与0.5μL蓝色的loading buffer混匀；
③点样：将凝固的琼脂糖凝胶将与loading buffer混匀的样品点入胶的样品孔。
④回收：使用蓝光切胶仪将目的条带切下，并使用Gel Extraction Kit(OMEGA)按照说明书操作，通过DNA吸附柱回收DNA，最终使用微量分光光度计对所回收DNA进行质量及浓度的检测。
3.表达盒的构建及GB-dir连接方法
①取少量大肠杆菌，接种于0.8mL含四环素LB中，900rpm 30℃过夜培养。
②将上述菌液转接40μL上述菌液于1.4mL，含四环素LB中900rpm 30℃进行培养。
③加入40μL阿拉伯糖，37℃诱导40min，同时，对片段进行除盐处理。
④将菌体离心1min。加入1mL无菌水，对菌体进行重悬，并且重复一次，弃掉上清，留下30～40μL菌体。
⑤向菌体中加入20μL除盐后片段，吹打混匀，转移至电转杯中进行电转化。
⑥加入1mL不含抗性LB，将电转杯中大肠杆菌吹打混匀，并且转移至新的离心管中，在37℃条件下孵育1h。
⑦将菌体进行离心，弃掉上清，剩余50～100μL菌液，划线或涂布平板，37℃过夜培养。
⑧待第二天转化子长出后，挑取单克隆进行PCR、酶切或者测序验证。
4.里氏木霉原生质体转化
(1)菌体准备
①取新鲜生孢的平板(生长3-4天)，使用灭菌洗孢子液3-4mL，将孢子洗下。
②准备10个麸皮平板，并在培养基表面铺匀一层玻璃纸，在表面均匀涂布150-200μL新鲜孢子液，30℃过夜培养，大约12-15h。
(2)原生质体的制备
①加入0.1g裂解酶到20mL溶液1中，轻轻摇匀。
②待平板的玻璃纸上长出新鲜生长的菌丝后，吸取2～3mL酶液到一个新的平皿中，加上一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加入2～3mL酶液，依次叠放8～10层。将此培养皿放置于30℃培养箱中。
③大约酶解2h后，用镊子将玻璃纸挑出，同时使用溶液1洗净上边的菌丝。
④准备带有4层擦镜纸的玻璃漏斗，用此漏斗过滤原生质体悬液到提前冰上预冷的50mL离心管中。
注意：接下来步骤均在冰上进行。
④使用2000rpm预冷水平离心机离心10min，小心去掉上清液，并用4mL溶液2小心重悬原生质体。再次离心。
⑥小心去掉上清液，并用0.5-1mL溶液2重悬原生质体，放置在冰上。
⑦使用显微镜进行镜检。
(3)原生质体转化(在冰上进行)
①将200μL原生质体悬液，10μL纯化DNA片段，50μL PEG轻轻混匀，置于冰上20min。
②加入室温状态下2mL PEG，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4mL溶液2轻轻混匀。
③将全部的得到的原生质体，加入预保温的上层选择培养基(含抗性)中，轻轻混匀，倒在铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后置于30℃进行培养。
④在筛选培养基上培养3～4天后，用枪尖挑取转化子到传代培养基中，一个平板上可接种多个转化子。
5.里氏木霉转化子验证
通过抗性筛选获得转化子，提取转化子基因组(详细步骤参见《分子克隆实验指南》第三版)，进行PCR验证，获得定点插入表达盒的纯合子菌株。构建菌株见表1。
表1本实施例中所构建的Cre1突变的菌株
Figure BDA0002279468990000081
实施例2里氏木霉转化子在葡萄糖条件下主要纤维素酶基因酶活及蛋白检测采用2％葡萄糖作为碳源，接种方式采用种子培养基2-3天→转接10％到2％葡萄糖为碳源的产酶培养基，在5天进行滤纸酶活(FPA)，pNPC、蛋白量和生物量的测定。
实验平行及重复：3次技术平行，2次生物学重复。
(1)滤纸酶活(FPA)：
底物使用1*6.4cm的Whatman快速定性滤纸条，将滤纸条折叠，放入25mL比色管找那个，加入1.5mL柠檬酸缓冲液(pH为4.8)，实验组加入0.5mL纤维素酶酶液，并混匀(对照组不加)，50℃水浴反应1h，对照组加入0.5mL酶液，实验组及对照组均立即加入3mL新鲜配置DNS溶液将反应终止，接下来沸水浴煮沸10min，后加入ddH2O将比色管定容到25mL，盖上盖子，来回颠倒数次混匀，使用分光光度计测量OD540时的吸光值。
(2)pNPC酶活测定：
在1.5ml的离心管中，加入50μL的pNPC，实验组加入100μL纤维素酶酶液，吹打混匀，50℃水浴反应30min，对照组加入100μL纤维素酶酶液。接下来加入150μL 10％NaCO3将反应终止，使用分光光度计测量OD420时的吸光值。
蛋白测定方法
(3)使用Bradford方法进行胞外蛋白含量的测定：
在酶标条中加入200μL Bradford，后加入20μL蛋白，在吸光值OD595处进行测量。
结果发现：Cre1蛋白突变后，位点S387,S388突变后，pNPC、FPA酶活和蛋白均有显著提高。以出发菌株为100％，突变后的菌株纤维素酶活性(FPase activity)及菌株pNPC含量、胞外蛋白量如表2所示。
表2：改造菌株与出发菌株酶活及蛋白比较相对值
Figure BDA0002279468990000091
注：表2是以出发菌株为100％，改造菌株纤维素酶活(FPase)、pNPC及胞外蛋白的相对值。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法
<130> 2010
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gln Arg Ala Gln Ser Ala Val Asp Phe Ser Asn Leu Leu Asn Pro
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ala Gly Gln Asp Ser Gly Ala Met Ser Thr Ala Ala Val
20 25 30
Thr Val Ile Lys Pro Asn Gly Pro Ile Pro Gly Thr Gln Ser Thr Glu
35 40 45
Thr Ala Asn Glu Leu Pro Arg Pro Tyr Lys Cys Pro Leu Cys Asp Lys
50 55 60
Ala Phe His Arg Leu Glu His Gln Thr Arg His Ile Arg Pro His Thr
65 70 75 80
Gly Glu Lys Pro His Ala Cys Gln Phe Pro Gly Cys Ser Lys Lys Phe
85 90 95
Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ser Arg Ile His Ser Asn Pro
100 105 110
Asn Ser Arg Arg Gly Asn Lys Gly Gln Gln Gln His Gln Leu His His
115 120 125
Gln Gly Met Pro His Pro Met His Val Asp Gly Leu Met His Pro Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Lys Ala Ile Arg Ser Ala Pro Pro Ser Thr Leu Val Ser
145 150 155 160
Pro Asn Val Ser Pro Pro His Ser Tyr Ser Ser Phe Val Met Pro His
165 170 175
Gly Pro Ile Ser His Tyr Gly Arg Gly Asn Asp Ile Thr Met Leu Ala
180 185 190
Lys Ala Ala Asn Gln Ile Glu Arg Glu Thr Leu Ser Gly Gly Pro Ser
195 200 205
Asn His Asn Ser Arg His His Pro Tyr Phe Gly Gln Gly Val Pro Gly
210 215 220
Ser Arg Gly His Pro Ser Leu Ser Ser Tyr His Met Ala Arg Ala His
225 230 235 240
Ser Asn Asp Glu Asp Asp His Tyr His Gly Ser Leu Arg His Ala Lys
245 250 255
Arg Ser Arg Pro Asn Ser Pro Asn Ser Thr Ala Pro Ser Ser Pro Thr
260 265 270
Phe Ser His Asp Ser Leu Ser Pro Thr Pro Asp His Thr Pro Ile Ala
275 280 285
Thr Pro Ala His Ser Pro Arg Leu Arg Pro Phe Ser Gly Tyr Glu Leu
290 295 300
Pro Ser Leu Arg Asn Leu Ser Leu Gln His Asn Thr Thr Pro Ala Leu
305 310 315 320
Ala Pro Met Glu Pro His Leu Asp Ala Pro Gln Phe His Pro Gln Leu
325 330 335
Gln Ala Asn Thr Thr Arg Ser Pro Gly Met Ser Leu Thr Asp Ile Ile
340 345 350
Ser Arg Pro Asp Gly Ser Gln Arg Lys Leu Pro Val Pro Gln Val Pro
355 360 365
Lys Val Ala Val Gln Asp Leu Leu Ser Asp Gly Val Phe Pro Asn Ser
370 375 380
Gly Arg Ser Ser Thr Thr Gly Ser Leu Ala Gly Gly Asp Leu Met Asp
385 390 395 400
Arg Met
<210> 2
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gln Arg Ala Gln Ser Ala Val Asp Phe Ser Asn Leu Leu Asn Pro
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ala Gly Gln Asp Ser Gly Ala Met Ser Thr Ala Ala Val
20 25 30
Thr Val Ile Lys Pro Asn Gly Pro Ile Pro Gly Thr Gln Ser Thr Glu
35 40 45
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Gly Arg Ser Ser Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gly Asp Leu Met Asp
385 390 395 400
Arg Met

Claims (10)

1.一种解除CCR效应的基因序列，其特征在于，所述基因序列编码的如SEQ ID No:2-No.5所示的氨基酸序列；优选的，所述基因序列包括由于密码子简并性能够翻译得到SEQID No:2-No.5所示氨基酸序列的基因序列。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括权利要求1所述基因序列。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中包括权利要求2所述表达盒或权利要求1所述基因序列的完整编码阅读框序列；优选的，所述载体为质粒或病毒载体；进一步优选的，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
4.一种解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述基因序列、权利要求2所述表达盒或权利要求3所述的重组载体；优选的，所述试剂盒中还包括转化试剂、染色体抽提试剂、扩增酶及电泳试剂。
5.一种解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求3所述重组载体或权利要求4所述试剂盒对丝状真菌Cre1的序列进行改造。
6.如权利要求5解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的方法，其特征在于，所述改造步骤如下：
采用原生质体转化法将所述权利要求3所述重组载体转化到丝状真菌中；通过初步抗性筛选及测序验证，即得到突变株；优选的，所述丝状真菌为里氏木霉菌(Trichodermareesei)。
7.一种纤维素酶的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括采用权利要求3所述重组载体或权利要求4所述试剂盒对产纤维素酶的菌株Cre1序列进行改造。
8.权利要求1所述解除CCR效应的基因序列、或权利要求2所述表达盒、权利要求3所述重组载体、权利要求4所述解除丝状真菌碳代谢阻遏效应的试剂盒在纤维素酶生产领域的应用。
9.一种提高纤维素酶活的方法，其特征在于，所述方法包括对产纤维素酶的微生物进行基因工程改造使微生物CCR效应减弱；优选的，所述基因工程改造包括对转录因子Cre1的C-末端的去除、添加、突变或者去磷酸化；优选的，所述微生物包括具有CCR效应的产纤维素酶的菌，具体如里氏木霉，草酸青霉，黑曲霉，构巢曲霉，棘孢曲霉等。
10.如权利要求9所述提高纤维素酶活的方法，其特征在于，所述点突变位点为Cre1的C末端386位之后的氨基酸，特别是S387，S388，T389，T390的氨基酸残基；或所述突变为点突变方式，突变为缬氨酸或者丙氨酸。
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