CN114920808A

CN114920808A - 一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274及其应用

Info

Publication number: CN114920808A
Application number: CN202210463040.4A
Authority: CN
Inventors: 黄火清; 张成杰; 周樱; 詹志春; 辜玲芳; 刘文悦
Original assignee: Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114920808B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体提供了纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2，对于纤维素酶活性表达具有调节作用。本发明还提供了在产纤维素酶的宿主菌中下调所述转录抑制因子55274的表达或活性，提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法。在宿主菌中抑制转录抑制因子55274的表达可提高宿主菌的蛋白表达量和纤维素酶酶活，为提高纤维素酶产量，降低纤维素酶成本，实现纤维素有效利用提高了新途径。

Description

一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274及其应用。

背景技术

纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物，作为地球上数量最大的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要求，纤维素酶的高成本仍然是纤维素生物炼制的主要瓶颈之一。

里氏木霉(Trichoderma reesei)是公认的纤维素酶高产菌株，也是纤维素酶生产工业菌株的主要来源，其混合发酵液中，纤维二糖水解酶的表达占胞外总分泌蛋白的50％以上。在里氏木霉中，纤维素酶的表达受多个调控途径的影响。其中，主要调控是发生在转录水平，包括主要激活因子Xyr1、ACEII和Hap2/3/5，抑制因子Cre1和ACEI，以及其他新发现的Ace3、Vib1、Azf1、Rce1等各自的转录因子的协同调控。已知里氏木霉有中500多个转录因子，近几十年，只发现了几个对转录调控改造有明显效果的转录因子。因此，继续挖掘新型转录因子并对其进行基因工程改造提高纤维素酶的表达，显的尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中纤维素酶表达受制约的问题。

为此，本发明提供了一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MEEPAVTTTNASLPEPQGSSSQQNDGGKDEANRKKTGTRKRTKTGCLTCRRRRIKCDEGRPICHNCIKSRRECEGYSQRVIFKEPLGSFSSPFNQAIYPGPPSIVDESLATHRQSSRGLFPAIAPRPPTFDQRHHGLPLQSSAAPYQQQYHHEPLVQGSSAYNMGPGQLLQAPYNAQFPNPLLATEVDGGHAHYTHAPPEAQFFSIQDGGPARDMLGDFRRLTSDHALNVHTGAAMTQPLNDRWGLDMLDDEASLPDSDDDLPDVRGNLLPIKSMVPERWTMSAVDANVFSAFAQNDDVLAHMETPYSSEFWASGLNTIFMHFINVTGPGISIFEGDISCASQRARSSTAAGTGQSLWSYNPPTAALRHYHRAIRRIAKNVKSPSRRTQPATLAATLLLGYFEVWSSDHTKWCNHLFGARILFREMSLGDMTRACFPAKRMRQRREAGGYQLGHVSSYFYHSHAHAAPAQSGQRSLDYGFLNAITGLAVSPEDYGDAEHQPSDERRSPVSDKEIERYDIICDLFWWYCKMDVYQSILGGTRLFMEYEHWTQIPPRAPFSTYSSAYGTYDHLILLLGRLSDFVSKDLSRKQKVIDAQCGGAGTGSPPMFPGMFPMFGKVQAPMGFSPPRDGTPHSDSQEDLDPEASYEAALQEWNAIYHSFEVFKSRLGPEFQPLGDELDGQTRTKTPFGDPIYFRTYSIAGIWMNYYMGFIHLYRSHPSMPPVAMRAAGMTAKKTAAFALKIGQIASGLAADCSEYTEINTYLGAALIESSFCVFVAGIQYNDTAQRHWVIQRMHDVARLTGWQSAMQIACGCESAWIKACQMGGPEYARPTIINDISSTIWKNPRRIDKKIDELDSSEERRLVLAKAERTHYAIGILAIETELARLELRDDLN

具体的，编码所述转录抑制因子55274的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGGAGGAACCAGCTGTTACAACCACGAACGCCAGCTTGCCAGAACCCCAAGGGAGCTCATCTCAGCAGAATGACGGAGGAAAAGATGAGGCGAATCGCAAGAAGACGGGAACAAGGAAGCGAACCAAAACTGGCTGTCTCACCTGTCGTAGGAGACGCATCAAATGCGACGAAGGCAGGCCGATTTGCCACAACTGCATCAAATCGAGACGAGAGTGCGAAGGATATAGCCAGAGGGTCATATTTAAGGAACCTCTTGGATCTTTCTCGTCCCCTTTCAACCAGGCAATATATCCTGGCCCGCCAAGTATCGTTGACGAGTCTTTGGCTACGCACCGTCAGTCTTCAAGGGGACTCTTTCCAGCCATCGCGCCGAGACCCCCGACCTTTGACCAGCGTCACCATGGTTTGCCTCTGCAGTCAAGTGCCGCGCCGTATCAGCAGCAATACCACCATGAACCGTTGGTACAAGGCTCTTCAGCTTACAATATGGGACCCGGCCAGTTGCTACAGGCACCTTACAACGCACAGTTTCCCAACCCCCTGCTTGCGACAGAGGTCGACGGAGGACATGCTCACTATACCCATGCTCCCCCCGAGGCACAATTCTTCTCTATCCAAGATGGCGGCCCTGCCAGAGATATGCTTGGCGATTTCCGTCGTCTGACCAGCGATCACGCTCTCAATGTCCACACAGGAGCCGCCATGACACAGCCCCTGAATGATCGGTGGGGACTAGACATGCTGGATGACGAAGCATCGTTACCCGATTCTGATGATGATTTACCGGACGTTCGAGGCAACTTGCTGCCAATTAAGAGCATGGTGCCAGAGCGTTGGACCATGAGTGCTGTGGATGCCAACGTCTTTTCCGCCTTTGCCCAGAACGACGATGTTCTGGCACACATGGAGACACCGTATTCTTCTGAATTCTGGGCTAGTGGCCTAAACACGATCTTCATGCATTTCATCAATGTGACTGGTCCTGGAATCTCAATCTTTGAAGGAGATATTTCTTGCGCTTCGCAGAGAGCCAGGAGCAGCACCGCAGCTGGTACTGGGCAGAGCTTATGGAGCTATAATCCCCCGACGGCAGCTCTGAGGCATTACCATCGTGCCATACGTCGTATAGCCAAGAATGTGAAGTCACCATCCCGGAGGACACAGCCCGCGACCCTAGCTGCTACTCTGCTGCTCGGATATTTTGAGGTTTGGTCATCTGATCACACCAAGTGGTGCAACCATCTGTTTGGTGCCAGGATCTTGTTCCGCGAAATGTCTTTGGGAGACATGACTCGGGCTTGTTTCCCAGCGAAGCGCATGAGGCAACGACGGGAAGCTGGAGGCTATCAACTGGGACATGTAAGCTCCTACTTTTACCATTCGCATGCCCACGCAGCGCCAGCCCAGAGCGGGCAGCGCTCTCTCGACTATGGCTTCTTGAATGCCATTACGGGACTCGCCGTGTCTCCCGAAGACTACGGTGATGCAGAGCATCAACCTTCTGATGAGAGGCGTTCTCCAGTGAGCGACAAAGAAATTGAGAGATACGACATCATCTGCGACTTGTTTTGGTGGTACTGCAAGATGGATGTGTACCAGAGCATCTTGGGTGGAACCAGGTTATTCATGGAATACGAGCACTGGACTCAAATCCCTCCAAGGGCTCCCTTTTCGACATATTCATCCGCATATGGCACCTATGATCACTTGATACTCCTGCTCGGCCGCCTCTCAGACTTTGTGTCAAAGGATTTGTCCCGGAAACAGAAGGTCATAGACGCTCAATGCGGCGGTGCTGGAACTGGCTCGCCCCCTATGTTTCCAGGCATGTTCCCCATGTTCGGAAAAGTGCAGGCGCCTATGGGATTCAGTCCTCCACGAGACGGCACGCCACACAGTGATTCGCAGGAAGACCTTGACCCAGAAGCCAGCTACGAAGCTGCGTTGCAGGAATGGAATGCCATTTATCACTCCTTTGAGGTCTTCAAGAGCCGTCTCGGACCCGAATTCCAGCCCCTCGGTGACGAGCTTGACGGTCAGACGAGGACAAAGACACCTTTTGGAGACCCTATCTACTTCCGAACATATTCAATTGCCGGCATATGGATGAACTACTACATGGGGTTCATCCATCTATATCGAAGCCACCCCTCGATGCCACCGGTTGCGATGAGGGCAGCGGGCATGACGGCGAAGAAGACGGCTGCTTTCGCGCTCAAGATTGGGCAAATTGCCTCAGGACTTGCTGCCGACTGTTCAGAGTACACTGAAATCAACACCTATCTTGGCGCTGCCCTCATTGAAAGTTCTTTCTGCGTATTTGTTGCAGGTATACAGTATAATGACACTGCGCAAAGACATTGGGTCATCCAGAGGATGCATGACGTTGCGCGTCTCACTGGTTGGCAATCGGCGATGCAGATTGCCTGTGGCTGTGAGTCGGCATGGATCAAGGCTTGCCAGATGGGAGGACCGGAGTATGCACGACCAACAATCATCAACGACATTTCTTCTACCATTTGGAAAAATCCTCGCCGCATCGACAAGAAAATCGACGAACTAGACTCGAGCGAGGAACGGCGGTTAGTACTGGCCAAGGCTGAAAGAACACATTACGCAATCGGGATACTAGCAATCGAAACAGAACTCGCGAGGCTCGAACTACGAGACGATTTAAACTAA

本发明还提供了一种提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法：在所述产纤维素酶的宿主菌中下调上述转录抑制因子55274的表达或活性。

具体的，上述下调转录抑制因子55274的表达或活性包括：敲除或沉默转录抑制因子55274的编码基因，或抑制转录抑制因子55274的活性。

具体的，上述方法包括采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除转录抑制因子55274的编码基因。

具体的，上述基因编辑包括以下步骤：

(1)设计gRNA序列；

(2)构建p55274 donor质粒：所述p55274 donor质粒包括55274上游同源臂、pCre/Loxp-hph和55274下游同源臂；

(3)构建p55274sgRNA质粒：所述p55274sgRNA质粒包括pdc1P-55274sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌元件；

(4)p55274donor DNA和p55274sgRNA酶切后转化宿主菌，得到敲除转录抑制因子55274的宿主菌，提高宿主菌中纤维素酶活性的表达。

具体的，上述gRNA序列为CGCCGTATCAGCAGCAATAC。

具体的，上述p55274 donor质粒的55274上游同源臂、pCre/Loxp-hph和55274下游同源臂通过无缝拼接方式串联拼接；p55274sgRNA质粒的pdc1P-55274sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌元件通过无缝拼接方式串联拼接。

本发明还提供了一种生产纤维素酶的宿主菌，所述宿主菌中纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274的表达或活性被下调。

具体的，上述宿主菌包括里氏木霉。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的这种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274对于纤维素酶活性表达具有调节作用，通过构建该基因的敲除质粒，并用其转化宿主菌，在宿主菌中抑制转录抑制因子55274的表达可提高宿主菌的蛋白表达量和纤维素酶酶活，为提高纤维素酶产量，降低纤维素酶成本，实现纤维素有效利用提高了新途径。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例1中Mfuzz聚类分析示意图。

图2是本发明实施例2中p55274 donor质粒示意图。

图3是本发明实施例2中p55274sgRNA质粒示意图。

图4是本发明实施例2中敲除转录抑制因子55274的里氏木霉PCR验证结果图。

图5是本发明实施例3中蛋白浓度测定结果图。

图6是本发明实施例3中内切纤维素酶酶活测定结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

下面通过具体实施例对本发明的纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274及其应用的效果进行研究。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。本发明所使用的里氏木霉TU-6菌株购自美国ATCC菌种中心(保藏编号为ATCC MYA-256)；Cxyr1菌株是在TU-6菌株的基础上，过表达了里氏木霉全局性转录激活因子xyr1,该菌株的纤维素酶较TU-6菌株提高了10-20倍。

实施例1：转录抑制因子55274的筛选

在Avicel诱导条件下，对里氏木霉TU-6菌株和一株高产纤维素酶的Cxyr1菌株(过表达主要的转录激活因子xyr1)的不同培养时间(0h、12h、24h和36h)进行了转录组分析。通过Mfuzz聚类分析(图1)，发现多个转录因子与xyr1在TU-6和Cxyr1菌株的不同培养时间下落在同一聚类区间。结合基因的差异表达数据进一步缩减转录因子的范围，在诱导性碳源Avicel中，较TU-6菌株，在Cxyr1菌株的转录因子差异表达明显的，如在Avicel(log2 foldchange(FC)>2倍)的转录因子；此外，结合转录因子的FPKM数据和功能。最终确定对转录抑制因子55274进行敲除，验证其基因的功能。

实施例2：在里氏木霉中敲除转录抑制因子55274

(1)设计gRNA序列

通过在线的E-CRISPR网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计针对转录抑制因子55274的gRNA，选择打分高的gRNA序列，结合软件分析以确保gRNA没有预测的脱靶结合位点。最终确定gRNA序列为CGCCGTATCAGCAGCAATAC。

2、构建p55274 donor质粒

p55274 donor质粒包括：55274上游同源臂、pCre/Loxp-hph(潮霉素表达盒)和55274下游同源臂。

PCR反应体系包括：2ng模板、1μl正向引物、1μl反向引物、25μl的2xPCR Mix，双蒸水补足至50μl。

PCR反应程序为：95℃，5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、3min，34个循环；72℃，10min。

(1)以里氏木霉TU-6基因组为模板，使用引物55274UPF1/55274UPR1扩增55274基因上游1.5kb长度的同源臂，引物序列如下：

55274UPF1：CGTCAGCCCGTCCGTCTCGCTCTA

55274UPR1：ATAATTGGGTTTAAACCCCCGATACGATTCTTTGCTGCGGGAGAG

(2)以pCre/Loxp-hph质粒为模板，使用引物Hph-GF/Hph-GR扩增pCre/Loxp-hph部分，引物序列如下：

Hph-GF：GGGGTTTAAACCCAATTATTCGT

Hph-GR：GCTTTCATCGCTCGAGGCTAGCAT

(3)以里氏木霉TU-6基因组为模板，使用引物55274DownF1/55274DownR1扩增55274基因下游1.5kb长度的同源臂，引物序列如下：

55274DownF1：TAGCCTCGAGCGATGAAAGCCAAGCGATATAGAATGTGTGATG

55274DownR1：GGACGGGCTGACGTTAATTAACGCTGAGAGACCCGACTCGGAG

PCR结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。3个片段用同源重组的方法进行连接，并转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。对平板上长出的大肠杆菌Trans1-T1菌落进行PCR验证。验证引物设计55274下游和55274上游同源臂的接头处，扩增约500bp的片段，验证引物Y55274F和Y55274R序列如下:

Y55274F：GCCTACGCATCCAGTGGCAG

Y55274R：CACAGATGCAGCTCTGTCTCTCTG

对扩增出的目的条带的单克隆测序，测序正确的质粒命名为p55274donor质粒,如图2所示。

3、构建p55274sgRNA质粒

p55274sgRNA质粒包括：pdc1P-55274sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌元件(氨苄编码基因和大肠杆菌复制起始点)。

(1)pdc1P-55274sgRNA-pdc1T片段：以里氏木霉基因组TU-6模板，使用引物pdc1PF1和pdc1PR1扩增pdc1启动子；以合成的55274sgRNA序列部分为模板，使用引物55274sgRNAF1和55274sgRNAR1扩增合成55274sgRNA序列部分；以里氏木霉基因组TU-6模板，使用引物pdc1TF1和pdc1PR1扩增pdc1终止子。各引物序列如下：

pdc1PF1：AGTAGACGATGAAAGCCTTGCAAC

pdc1PR1：GATTGTGCTGTAGCTGCGCTGCTTT

55274sgRNAF1：CGCAGCTACAGCACAATCATCTGACTGATGAGTCCGTGAGGA

55274sgRNAR1：AGACTTCATGCCGGGGTCCCATTCGCCATGCCGAAGCATGTT

pdc1TF1：CCCGGCATGAAGTCTGACCGGGTA

pdc1TR1：GGAATCTGACATTGCAATTGACTC

PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收的3个目的条带片段通过体外overlap获得pdc1P-55274sgRNA-pdc1T片段。

(2)TEL序列：以合成的TEL序列部分为模板，使用引物TELF1和TELR1扩增合成TEL序列。引物序列如下：

TELF1：AATTGCAATGTCAGATTCCTACGTAGTAAAACGACGGCCAGTG

TELR1：GTCCTCGAAAGATGGAATTCCAGCTATGACCATGATTACGCCAA

PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

(3)pdc1P-Cas9-pdc1T：以里氏木霉基因组TU-6模板，使用引物pdc1PF2和pdc1PR22扩增pdc1启动子；以pCas9质粒为模板，使用引物Cas9F1和Cas9R1扩增合成Cas9基因；以里氏木霉基因组TU-6模板，使用引物pdc1TF2和pdc1PR2扩增pdc1终止子。引物系列如下：

pdc1PF2：GAATTCCATCTTTCGAGGACGGAC

pdc1PR2：GATTGTGCTGTAGCTGCGCTGCTTT

Cas9F1:AGCGCAGCTACAGCACAATCATGGACAAGAAGTACAGCATTGGC

Cas9R1:CGGTCAGACTTCATGCCGGGTTAGACCTTGCGCTTCTTCTTGGG

pdc1TF2：CCCGGCATGAAGTCTGACCGGGTA

pdc1TR2：GGAATCTGACATTGCAATTGACTC

PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收的3个目的条带片段通过体外overlap获得pdc1P-Cas9-pdc1T片段。

(4)大肠杆菌基本元件(氨苄编码基因和大肠杆菌复制起始点)片段：以pCas9质粒为模板，使用引物oriF1和oriR1扩增大肠杆菌基本元件。引物序列如下：

oriF1：AATTGCAATGTCAGATTCCGCTCCTAAGAGGAAACAGGGCCCT

oriR1：CAAGGCTTTCATCGTCTACTATGCATTTTTGTAGAACAAAAAAG

PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

上述pdc1P-55274sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌基本元件(氨苄编码基因和大肠杆菌复制起始点)四个片段采用同源重组的方法转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。对平板上长出的大肠杆菌Trans1-T1菌落进行PCR。验证引物为Ypdc1F和Ycas9R，扩增约500bp的片段，引物序列如下:

Ypdc1F:TCTCCATCACAAGGAGCTTCTTCA

Ycas9R:CGGTGCGCTTGAGGCGGGTGGCCT

对扩增出目的条带的单克隆测序，测序正确的质粒命名为p55274sgRNA质粒，如图3所示。

4、在里氏木霉中敲除转录抑制因子55274

(1)p55274 donor DNA和p 55274sgRNA转化里氏木霉

将里氏木霉TU-6接种于土豆培养基(PDA)平板上，28℃静置培养7天待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的PDB培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的纤维素酶在30℃消化2-3小时，收集原生质体备用。

p 55274donor DNA和p 55274sgRNA分别用Pac1和I-Ceu1酶切，琼脂糖凝胶电泳进行跑胶、回收。酶切后的p55274donor DNA和p55274sgRNA分别加入1μg于原生质体中混合。混合液加入50μl的PEG缓冲液，混匀，冰上放置30min。再次混匀后，加入1ml的PEG缓冲液进行混匀，室温放置20min。最后将混合物与100ml的MM培养基、2％的葡萄糖、1M的山梨醇、2％的琼脂培养基混合均匀，倒入90cm的平板上，28℃培养5-7天。

(2)PCR验证转录抑制因子55274在里氏木霉基因组的敲除

挑取单个转化子，接种于含MM-葡萄糖培养基的24孔板，于28℃培养5-7天。提取基因组DNA，验证转录抑制因子55274在里氏木霉基因组的敲除。

验证引物的F端设计在里氏木霉基因组的55274基因上游250bp处，R端设计在p55274 donor质粒的大肠杆菌复制起始点处，验证引物序列如下：

引物F:AGTCTGCCTCAACTCACTCGATAC

引物R:GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG

如果扩增出约2000bp大小的片段，则证明p55274 donor插入到55274基因的位置，该基因被敲除。将PCR产物在1％琼脂糖胶上进行电泳，结果如图4所示，有6个转化子(2、3、4、5、6、7)出现和预期一致的条带。

实施例3：敲除转录抑制因子55274对蛋白浓度和纤维素酶表达的影响

(1)转化子的摇瓶诱导

将2×10⁷的敲除转录抑制因子55274的转化子孢子和2×10⁷的出发菌株(里氏木霉TU-6)孢子分别接种于50ml的MM-glucose培养基中，28℃，160rpm培养2天。以10％的接种量转接至50ml的MM+2％Avicel培养基中以诱导纤维素酶的表达。从第3天开始，每隔24h取样，连续取样至6天。

(2)蛋白浓度测定

用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，加入250μl的1×dye reagent染液和10μl蛋白标品后，室温下反应10分钟，测定595nm的吸光值,结果如图5所示。在发酵第5天，里氏木霉TU-6的蛋白浓度是0.027mg/ml,Δ55274菌株(转化子)的蛋白浓度是0.059mg/ml，提高了1.2倍。

(3)内切纤维素酶活性测定

采用羧甲基纤维素钠(1.5％CMC-Na)作为底物测定内切纤维素酶的酶活。用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.05M、pH 5.0)配制羧甲基纤维素钠。1ml液体酶在50℃、pH 5.0的条件下，每小时水解羧甲基纤维素钠，产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

取适当稀释的酶液100μl，加入到900μl的CMC-Na底物中，振荡混合均匀，50℃水浴保温30min，反应终止时，向各试管中加入1.5ml的DNS试剂，在沸水中煮5min，迅速冷却，测定540nm的吸光度，结果如图6所示。在发酵第5天，里氏木霉TU-6的内切纤维素酶酶活为1.42U/ml,Δ55274菌株的内切纤维素酶酶活为3.52U/ml，提高了1.5倍。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉新华扬生物股份有限公司

<120> 一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 894

<212> PRT

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 1

Met Glu Glu Pro Ala Val Thr Thr Thr Asn Ala Ser Leu Pro Glu Pro

1 5 10 15

Gln Gly Ser Ser Ser Gln Gln Asn Asp Gly Gly Lys Asp Glu Ala Asn

20 25 30

Arg Lys Lys Thr Gly Thr Arg Lys Arg Thr Lys Thr Gly Cys Leu Thr

35 40 45

Cys Arg Arg Arg Arg Ile Lys Cys Asp Glu Gly Arg Pro Ile Cys His

50 55 60

Asn Cys Ile Lys Ser Arg Arg Glu Cys Glu Gly Tyr Ser Gln Arg Val

65 70 75 80

Ile Phe Lys Glu Pro Leu Gly Ser Phe Ser Ser Pro Phe Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Tyr Pro Gly Pro Pro Ser Ile Val Asp Glu Ser Leu Ala Thr His

100 105 110

Arg Gln Ser Ser Arg Gly Leu Phe Pro Ala Ile Ala Pro Arg Pro Pro

115 120 125

Thr Phe Asp Gln Arg His His Gly Leu Pro Leu Gln Ser Ser Ala Ala

130 135 140

Pro Tyr Gln Gln Gln Tyr His His Glu Pro Leu Val Gln Gly Ser Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Asn Met Gly Pro Gly Gln Leu Leu Gln Ala Pro Tyr Asn Ala

165 170 175

Gln Phe Pro Asn Pro Leu Leu Ala Thr Glu Val Asp Gly Gly His Ala

180 185 190

His Tyr Thr His Ala Pro Pro Glu Ala Gln Phe Phe Ser Ile Gln Asp

195 200 205

Gly Gly Pro Ala Arg Asp Met Leu Gly Asp Phe Arg Arg Leu Thr Ser

210 215 220

Asp His Ala Leu Asn Val His Thr Gly Ala Ala Met Thr Gln Pro Leu

225 230 235 240

Asn Asp Arg Trp Gly Leu Asp Met Leu Asp Asp Glu Ala Ser Leu Pro

245 250 255

Asp Ser Asp Asp Asp Leu Pro Asp Val Arg Gly Asn Leu Leu Pro Ile

260 265 270

Lys Ser Met Val Pro Glu Arg Trp Thr Met Ser Ala Val Asp Ala Asn

275 280 285

Val Phe Ser Ala Phe Ala Gln Asn Asp Asp Val Leu Ala His Met Glu

290 295 300

Thr Pro Tyr Ser Ser Glu Phe Trp Ala Ser Gly Leu Asn Thr Ile Phe

305 310 315 320

Met His Phe Ile Asn Val Thr Gly Pro Gly Ile Ser Ile Phe Glu Gly

325 330 335

Asp Ile Ser Cys Ala Ser Gln Arg Ala Arg Ser Ser Thr Ala Ala Gly

340 345 350

Thr Gly Gln Ser Leu Trp Ser Tyr Asn Pro Pro Thr Ala Ala Leu Arg

355 360 365

His Tyr His Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Lys Asn Val Lys Ser Pro

370 375 380

Ser Arg Arg Thr Gln Pro Ala Thr Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Gly

385 390 395 400

Tyr Phe Glu Val Trp Ser Ser Asp His Thr Lys Trp Cys Asn His Leu

405 410 415

Phe Gly Ala Arg Ile Leu Phe Arg Glu Met Ser Leu Gly Asp Met Thr

420 425 430

Arg Ala Cys Phe Pro Ala Lys Arg Met Arg Gln Arg Arg Glu Ala Gly

435 440 445

Gly Tyr Gln Leu Gly His Val Ser Ser Tyr Phe Tyr His Ser His Ala

450 455 460

His Ala Ala Pro Ala Gln Ser Gly Gln Arg Ser Leu Asp Tyr Gly Phe

465 470 475 480

Leu Asn Ala Ile Thr Gly Leu Ala Val Ser Pro Glu Asp Tyr Gly Asp

485 490 495

Ala Glu His Gln Pro Ser Asp Glu Arg Arg Ser Pro Val Ser Asp Lys

500 505 510

Glu Ile Glu Arg Tyr Asp Ile Ile Cys Asp Leu Phe Trp Trp Tyr Cys

515 520 525

Lys Met Asp Val Tyr Gln Ser Ile Leu Gly Gly Thr Arg Leu Phe Met

530 535 540

Glu Tyr Glu His Trp Thr Gln Ile Pro Pro Arg Ala Pro Phe Ser Thr

545 550 555 560

Tyr Ser Ser Ala Tyr Gly Thr Tyr Asp His Leu Ile Leu Leu Leu Gly

565 570 575

Arg Leu Ser Asp Phe Val Ser Lys Asp Leu Ser Arg Lys Gln Lys Val

580 585 590

Ile Asp Ala Gln Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ser Pro Pro Met Phe

595 600 605

Pro Gly Met Phe Pro Met Phe Gly Lys Val Gln Ala Pro Met Gly Phe

610 615 620

Ser Pro Pro Arg Asp Gly Thr Pro His Ser Asp Ser Gln Glu Asp Leu

625 630 635 640

Asp Pro Glu Ala Ser Tyr Glu Ala Ala Leu Gln Glu Trp Asn Ala Ile

645 650 655

Tyr His Ser Phe Glu Val Phe Lys Ser Arg Leu Gly Pro Glu Phe Gln

660 665 670

Pro Leu Gly Asp Glu Leu Asp Gly Gln Thr Arg Thr Lys Thr Pro Phe

675 680 685

Gly Asp Pro Ile Tyr Phe Arg Thr Tyr Ser Ile Ala Gly Ile Trp Met

690 695 700

Asn Tyr Tyr Met Gly Phe Ile His Leu Tyr Arg Ser His Pro Ser Met

705 710 715 720

Pro Pro Val Ala Met Arg Ala Ala Gly Met Thr Ala Lys Lys Thr Ala

725 730 735

Ala Phe Ala Leu Lys Ile Gly Gln Ile Ala Ser Gly Leu Ala Ala Asp

740 745 750

Cys Ser Glu Tyr Thr Glu Ile Asn Thr Tyr Leu Gly Ala Ala Leu Ile

755 760 765

Glu Ser Ser Phe Cys Val Phe Val Ala Gly Ile Gln Tyr Asn Asp Thr

770 775 780

Ala Gln Arg His Trp Val Ile Gln Arg Met His Asp Val Ala Arg Leu

785 790 795 800

Thr Gly Trp Gln Ser Ala Met Gln Ile Ala Cys Gly Cys Glu Ser Ala

805 810 815

Trp Ile Lys Ala Cys Gln Met Gly Gly Pro Glu Tyr Ala Arg Pro Thr

820 825 830

Ile Ile Asn Asp Ile Ser Ser Thr Ile Trp Lys Asn Pro Arg Arg Ile

835 840 845

Asp Lys Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ser Ser Glu Glu Arg Arg Leu Val

850 855 860

Leu Ala Lys Ala Glu Arg Thr His Tyr Ala Ile Gly Ile Leu Ala Ile

865 870 875 880

Glu Thr Glu Leu Ala Arg Leu Glu Leu Arg Asp Asp Leu Asn

885 890

<210> 2

<211> 2685

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei)

<400> 2

atggaggaac cagctgttac aaccacgaac gccagcttgc cagaacccca agggagctca 60

tctcagcaga atgacggagg aaaagatgag gcgaatcgca agaagacggg aacaaggaag 120

cgaaccaaaa ctggctgtct cacctgtcgt aggagacgca tcaaatgcga cgaaggcagg 180

ccgatttgcc acaactgcat caaatcgaga cgagagtgcg aaggatatag ccagagggtc 240

atatttaagg aacctcttgg atctttctcg tcccctttca accaggcaat atatcctggc 300

ccgccaagta tcgttgacga gtctttggct acgcaccgtc agtcttcaag gggactcttt 360

ccagccatcg cgccgagacc cccgaccttt gaccagcgtc accatggttt gcctctgcag 420

tcaagtgccg cgccgtatca gcagcaatac caccatgaac cgttggtaca aggctcttca 480

gcttacaata tgggacccgg ccagttgcta caggcacctt acaacgcaca gtttcccaac 540

cccctgcttg cgacagaggt cgacggagga catgctcact atacccatgc tccccccgag 600

gcacaattct tctctatcca agatggcggc cctgccagag atatgcttgg cgatttccgt 660

cgtctgacca gcgatcacgc tctcaatgtc cacacaggag ccgccatgac acagcccctg 720

aatgatcggt ggggactaga catgctggat gacgaagcat cgttacccga ttctgatgat 780

gatttaccgg acgttcgagg caacttgctg ccaattaaga gcatggtgcc agagcgttgg 840

accatgagtg ctgtggatgc caacgtcttt tccgcctttg cccagaacga cgatgttctg 900

gcacacatgg agacaccgta ttcttctgaa ttctgggcta gtggcctaaa cacgatcttc 960

atgcatttca tcaatgtgac tggtcctgga atctcaatct ttgaaggaga tatttcttgc 1020

gcttcgcaga gagccaggag cagcaccgca gctggtactg ggcagagctt atggagctat 1080

aatcccccga cggcagctct gaggcattac catcgtgcca tacgtcgtat agccaagaat 1140

gtgaagtcac catcccggag gacacagccc gcgaccctag ctgctactct gctgctcgga 1200

tattttgagg tttggtcatc tgatcacacc aagtggtgca accatctgtt tggtgccagg 1260

atcttgttcc gcgaaatgtc tttgggagac atgactcggg cttgtttccc agcgaagcgc 1320

atgaggcaac gacgggaagc tggaggctat caactgggac atgtaagctc ctacttttac 1380

cattcgcatg cccacgcagc gccagcccag agcgggcagc gctctctcga ctatggcttc 1440

ttgaatgcca ttacgggact cgccgtgtct cccgaagact acggtgatgc agagcatcaa 1500

ccttctgatg agaggcgttc tccagtgagc gacaaagaaa ttgagagata cgacatcatc 1560

tgcgacttgt tttggtggta ctgcaagatg gatgtgtacc agagcatctt gggtggaacc 1620

aggttattca tggaatacga gcactggact caaatccctc caagggctcc cttttcgaca 1680

tattcatccg catatggcac ctatgatcac ttgatactcc tgctcggccg cctctcagac 1740

tttgtgtcaa aggatttgtc ccggaaacag aaggtcatag acgctcaatg cggcggtgct 1800

ggaactggct cgccccctat gtttccaggc atgttcccca tgttcggaaa agtgcaggcg 1860

cctatgggat tcagtcctcc acgagacggc acgccacaca gtgattcgca ggaagacctt 1920

gacccagaag ccagctacga agctgcgttg caggaatgga atgccattta tcactccttt 1980

gaggtcttca agagccgtct cggacccgaa ttccagcccc tcggtgacga gcttgacggt 2040

cagacgagga caaagacacc ttttggagac cctatctact tccgaacata ttcaattgcc 2100

ggcatatgga tgaactacta catggggttc atccatctat atcgaagcca cccctcgatg 2160

ccaccggttg cgatgagggc agcgggcatg acggcgaaga agacggctgc tttcgcgctc 2220

aagattgggc aaattgcctc aggacttgct gccgactgtt cagagtacac tgaaatcaac 2280

acctatcttg gcgctgccct cattgaaagt tctttctgcg tatttgttgc aggtatacag 2340

tataatgaca ctgcgcaaag acattgggtc atccagagga tgcatgacgt tgcgcgtctc 2400

actggttggc aatcggcgat gcagattgcc tgtggctgtg agtcggcatg gatcaaggct 2460

tgccagatgg gaggaccgga gtatgcacga ccaacaatca tcaacgacat ttcttctacc 2520

atttggaaaa atcctcgccg catcgacaag aaaatcgacg aactagactc gagcgaggaa 2580

cggcggttag tactggccaa ggctgaaaga acacattacg caatcgggat actagcaatc 2640

gaaacagaac tcgcgaggct cgaactacga gacgatttaa actaa 2685

Claims

1.一种纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274，其特征在于：所述转录抑制因子55274的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274，其特征在于：编码所述转录抑制因子55274的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于：在所述产纤维素酶的宿主菌中下调如权利要求1或2所述的转录抑制因子55274的表达或活性。

4.如权利要求3所述的提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于，下调转录抑制因子55274的表达或活性包括：敲除或沉默转录抑制因子55274的编码基因，或抑制转录抑制因子55274的活性。

5.如权利要求4所述的提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于：通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除转录抑制因子55274的编码基因。

6.如权利要求5所述的提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于，所述基因编辑包括以下步骤：

(1)设计gRNA序列；

7.如权利要求6所述的提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于：所述gRNA序列为CGCCGTATCAGCAGCAATAC。

8.如权利要求6所述的提高产纤维素酶的宿主菌中纤维素酶活性的方法，其特征在于：所述p55274 donor质粒的55274上游同源臂、pCre/Loxp-hph和55274下游同源臂通过无缝拼接方式串联拼接；所述p55274sgRNA质粒的pdc1P-55274sgRNA-pdc1T、TEL序列、pdc1P-Cas9-pdc1T和大肠杆菌元件通过无缝拼接方式串联拼接。

9.一种生产纤维素酶的宿主菌，其特征在于：所述宿主菌中纤维素酶表达相关的转录抑制因子55274的表达或活性被下调。

10.如权利要求9所述的生产纤维素酶的工程菌，其特征在于：所述宿主菌包括里氏木霉。