CN107699584B - 木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法 - Google Patents

木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法，其中，所述木聚糖酶基因Xynsyn2用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点，从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量，提高了木聚糖酶的酶活力。

Description

木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其 制备方法、及饲料的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法。
背景技术
现有的饲料一般以玉米、小麦、麸皮或稻谷等作为主要原料，其中含有较多的非淀粉性多糖(包括阿拉伯木聚糖、葡聚糖、果胶以及纤维素等)，但是由于非反刍类动物体内缺少降解纤维素的酶，使其无法消化半纤维素而容易形成糜状积食，影响动物肠道微生物的种群类型，从而影响对饲料的吸收。在饲料中添加合适的木聚糖酶可以破碎植物细胞壁并水解半纤维素，从而达到降低食糜粘度的目的，提高饲料的利用率。
在工业生产中制备饲料的过程中，其工艺温度较高，因此需要木聚糖酶在高温条件下仍具有活性。但是现有的木聚糖酶的制备方法，一种是通过PCR 技术从相关产木聚糖酶的微生物中扩增出木聚糖基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主来表达木聚糖酶，制备出来的木聚糖酶的最适温度比较低、最适pH偏中性且蛋白的表达量小，工业应用限制较大；另一种是从自然界产木聚糖酶的微生物中筛选菌株，然后对菌株进行改良或者对发酵工艺尽心优化，制备出来的木聚糖酶的酶活和表达量均不高、且最适温度较低，在工业生产中容易失活。
毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法，旨在提高木聚糖酶基因在木聚糖酶中的表达量。
为实现上述目的，本发明提出一种木聚糖酶基因Xynsyn2，用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。
本发明还提出一种重组表达载体，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
优选地，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷贝数为多个。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。
本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体 pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体。
本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体 pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。
本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体 pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株；
培养重组表达菌株，从培养物中获得木聚糖酶。
本发明还提出一种制备饲料的方法，包括步骤：在糖化过程的蛋白质休止期或发酵过程中添加如权利要求2所述的木聚糖酶。
本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点，从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中pAO815表达载体和pAO815-Xynsyn2重组表达载体的图谱；
图2为本发明实施例1中木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的pAO815-Xynsyn2 重组表达载体的双酶切检验结果图；
图3为本发明实施例2中木聚糖基因Xynsyn2两拷贝的pAO815-Xynsyn2重组表达载体的图谱；
图4为本发明实施例2中木聚糖酶基因Xynsyn2syn单拷贝和两拷贝的重组表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE测试结果；
图5为本发明实施例3中发酵上清液的酶活随时间的变化曲线；
图6为本发明实施例3中发酵上清液的SDS-PAGE测试结果；
图7为本发明实施例4中木聚糖酶水解木聚糖的薄层层析测试结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种木聚糖酶基因Xynsyn2，用于编码木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点，从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。
本发明还提出一种木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。
本发明中根据已有的木聚糖酶基因(来源于海栖热胞菌(Thermotoga maritima))序列进行人工设计，设计出一条全新的木聚糖酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述木聚糖酶基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1 所示，命名为Xynsyn2，所述木聚糖酶基因Xynsyn2编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据毕赤酵母对基因的偏好性，对木聚糖酶基因序列进行了人工优化，采用毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点，使通过人工合成获得的木聚糖酶基因Xynsyn2，有效地提高了木聚糖酶基因Xynsyn2中含量较高氨基酸密码子的使用频率，同时还有利于木聚糖酶表达量的提高，实现了高效的异源表达。
本发明还提出一种重组表达载体，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
通过人工合成的方法获得木聚糖酶基因Xynsyn2后，需要通过载体将目的基因导入宿主细胞，使目的基因随着宿主细胞的繁殖而复制，从而获得大量的目的基因。
重组表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体，其中，所述启动子的类型可以是强表达型启动子、组织特异性启动或诱导型启动子，在实际中，可根据实际情况选择相应的启动子来进行驱动表达。在本发明中，所述重组表达载体的启动子为甲醇诱导型启动子，且启动子位于所述木聚糖酶基因的上游，用以驱动所述木聚糖酶基因表达。在甲醇诱导型启动子的诱导下，所述甲醇诱导型启动子驱动上述木聚糖酶基因转录表达出所述木聚糖酶，具体地，在本发明的一些实施例中，所述甲醇诱导型启动子 (AOX)的序列为：GACTGGTTCCAATTGACAAGC。
可选地，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷贝数为多个。
通过增加基因的拷贝数，可增加上述木聚糖酶基因Xynsyn2的表达量，进一步提高木聚糖酶的表达量。当然，载体上的每个木聚糖酶基因Xynsyn2 均具有独立的启动子驱动表达。更优选地，在本发明的一些实施例中，所述木聚糖酶基因的拷贝数为两个或三个。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
将上述的重组表达载体导入宿主细胞中获得重组表达菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等。
优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。
毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。同时，本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2经过密码子优化，采用了适用于毕赤酵母进行转录翻译表达出木聚糖酶的高频密码子，因此，以毕赤酵母作为宿主细胞，提高了木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。
本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：
步骤S11、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRⅠ，经EcoR Ⅰ酶切后，连接至同样经EcoRⅠ酶切后的中间载体pUC57上，即可获得 pUC-Xynsyn2载体。
步骤S12、将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
可选地，步骤S10和步骤S20中的酶切体系均为：30μL的载体、2μL的 EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH2O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。
步骤S13、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL 的Xynsyn2基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH2O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2的重组质粒pAO815-Xynsyn2重组表达载体，其结构如图1所示，Xynsyn2基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。
本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：
步骤S21、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRⅠ，经EcoR Ⅰ酶切后，连接至同样经EcoRⅠ酶切后的中间载体pUC57上，即可获得 pUC-Xynsyn2载体。
步骤S22、将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
可选地，步骤S21和步骤S22中的酶切体系均为：30μL的载体、2μL的 EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH2O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。
步骤S23、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL 的Xynsyn2基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH2O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2的重组质粒pAO815-Xynsyn2重组表达载体，其结构如图1所示，Xynsyn2基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。
步骤S24、将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。
可选地，通过电转仪将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。
本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S31、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRⅠ，经EcoR Ⅰ酶切后，连接至同样经EcoRⅠ酶切后的中间载体pUC57上，即可获得 pUC-Xynsyn2载体。
步骤S32、将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
可选地，步骤S31和步骤S32中的酶切体系均为：30μL的载体、2μL的 EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH2O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。
步骤S33、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL 的Xynsyn2基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH2O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2的重组质粒pAO815-Xynsyn2重组表达载体，其结构如图1所示，Xynsyn2基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。
步骤S34、将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株；
可选地，通过电转仪将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。
步骤S35、培养重组表达菌株，从培养物中获得木聚糖酶。
通过发酵培养重组表达菌株，从发酵上清液中提纯获得木聚糖酶。当然，在本发明其他实施例中，也可以不经过提纯处理，直接将发酵上清液视为木聚糖酶产物。具体地，本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2表达出的木聚糖酶的最适pH值为5.8～6.2(优选为6.0)、最适温度为60～70℃(优选为60℃)，在此环境条件下，所述木聚糖酶具有正常的生物活性，能够高效地促进木聚糖水解。
本发明还提出一种制备饲料的方法，包括步骤：在糖化过程的蛋白质休止期或发酵过程中添加如权利要求2所述的木聚糖酶。
木聚糖酶基因Xynsyn2编码木聚糖酶，通过人工合成木聚糖酶基因 Xynsyn2，然后将木聚糖酶基因Xynsyn2导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株，再对重组表达菌株进行发酵培养，即可制得木聚糖酶，将制备的木聚糖酶应用到饲料的制备中，可以将饲料的非淀粉多糖分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用，同时它可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝重组表达菌株的构建
(1)在DNA 2.0软件的辅助下设计木聚糖酶基因Xynsyn2序列，通过人工合成的方法获得木聚糖酶基因Xynsyn2片段。
(2)在合成的Xynsyn2基因两端加上酶切位点EcoR I，经EcoR I酶切后，连接至经EcoR I酶切后的中间载体pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)上，得到pUC-Xynsyn2载体；其中，酶切体系为：30μL的载体、2μL 的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH2O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h。
(3)将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体(购自美国Invitrogen公司，其图谱如图1所示)分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2 片段和pAO815片段；其中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL 的10×Buffer、ddH2O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h。
(4)将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；其中，连接体系为：1μL的T4 buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的Xynsyn2基因片段、2.5μL的pAO815 片段、ddH2O补齐至10μL；在16℃条件下连接10h后，取5μL连接体系与大肠杆菌(DH5α)混匀后于冰上放置15min，然后于42℃反应1min，再置于冰上2min，最后涂布于筛选平板上筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的pAO815-Xynsyn2重组表达载体，其结构如图1 所示，木聚糖酶基因Xynsyn2由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT) 终止子终止表达。
(5)利用电转仪将单拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体转化入巴斯德毕赤酵母GS115(美国Invitrogen公司)中，然后在YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)平板上筛选得到阳性转化子，经PCR(聚合酶链式反应)验证为正确的阳性转化子，即获得单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。其中，电转化方法为：取10μL的单拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体与90μL 的巴斯德毕赤酵母GS115混匀后于冰上放置5min，然后用电转化仪电击(电压1500V)，加入YPD培养基(含葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L)，于28℃孵育2h后涂布于平板上。
提取pAO815-Xynsyn2单拷贝的重组表达载体中的质粒载体，进行双酶切验证(BglII和BamH I)，结果如图2所示(图中：M为DL5000DNA Marker， 1泳道为没有酶切的pAO815-Xynsyn2重组表达载体；2泳道为单酶切后的 pAO815-Xynsyn2重组表达载体；3泳道为双酶切后的pAO815-Xynsyn2重组表达载体)。由图3可知，在1000bp位置有条带，说明木聚糖酶基因Xynsyn2 成功连接至pAO815-Xynsyn2重组表达载体上。
实施例2
木聚糖酶基因Xynsyn2多拷贝重组表达菌株的构建
(1)将实施例1获得的pAO815-Xynsyn2单拷贝重组表达载体用Bgl II 和BamH I双酶切后，胶回收大片段，得到pAO815-Xynsyn2片段，其中，酶切体系为：30μL的pAO815-Xynsyn2重组表达载体、1.5μL的BamH I、1.5μL 的Bgl II、20μL的10×Buffer K、20μL的BSA、20μL的Triton X-100、ddH2O 补齐至200μL，37℃条件下，酶切4h。
(2)用BamH I单酶切新的pAO815-Xynsyn2单拷贝重组表达载体后胶回收，将其与步骤(1)得到的pAO815-Xynsyn2片段用T4DNA连接酶连接，得到具有两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组质粒的pAO815-Xynsyn2重组表达载体，其结构如图3所示；将两拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中，筛选阳性克隆子，获得两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。
根据本实施例提供的步骤(2)，以此类推即可获得具有多拷贝(包括三拷贝、四拷贝等)木聚糖酶基因Xynsyn2的pAO815-Xynsyn2重组表达载体，再将多拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中，筛选阳性克隆子，获得多拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。
(3)木聚糖酶含量测试：摇瓶发酵培养上述步骤获得的木聚糖酶基因 Xynsyn2单拷贝和两拷贝重组表达菌株，提取上清液，进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测试，结果如图4所示(图中：1-1、1-2、 1-3、1-4和1-5为木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的重组表达菌株；2-1、2-2、2-3、2-4为木聚糖酶基因Xynsyn2两拷贝的重组表达菌株)，从图4可以看出，两拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达菌株的发酵上清液中的木聚糖酶含量较高，说明两拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体的木聚糖酶的表达量较高。
(4)DNS法测定木聚糖酶酶活：
a、取0.5mL稀释100倍的上清液(上述步骤(3)中获得)，加入到0.5mL 的木聚糖溶液(1％)和1mL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH值为5.0)的混合液中，于50℃水浴反应10min，用2mL的DNS(3，5-二硝基水杨酸)终止反应，然后置于沸水浴中5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至25mL，混合均匀后测试520nm处的吸光度；
b、配制浓度为1mg/mL的木聚糖标准溶液，准确量取0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2mL的木聚糖标准溶液，用蒸馏水定容至2mL，再加入2mL的DNS，置于沸水浴中5min，冷却至室温后测试520nm处的吸光度，绘制木聚糖标准曲线；
c、根据酶活公式计算出木聚糖酶酶活，其中，每分钟水解棉籽糖形成 1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活(U/mL)计算公式为：U＝r×Df×1000/150.14/t，其中，Df为上清液稀释倍数；r为根据OD520吸光度值，从木聚糖标准曲线上读取的与标准木聚糖溶液相对应的浓度(μg/mL) 得到的葡萄糖的摩尔浓度(μmol/mL)；t为酶解反应时间(min)。
计算结果为：单拷贝重组表达菌株的上清液稀释100倍酶活为96U/mL；两拷贝重组表达菌株的上清液稀释100倍的酶活为200U/mL，其中，两拷贝重组表达菌株的酶活比单拷贝提高了52.30％。
在现有技术中，通过人工合成优化来自于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因 xyl11M，发酵表达后的最高酶活为105.3U/mL；以及通过克隆来源于海栖热袍MSB8菌的木聚糖酶基因XylB，并在P.pastoris毕赤酵母中表达，其木聚糖酶最大酶活为50U/mL。由上述计算结果可知，通过本发明实施例制备的木聚糖酶(两拷贝)相比于现有技术中制备的木聚糖酶，其酶活得到了显著的提升。
实施例3
木聚糖酶的发酵生产
(1)将实施例2中的两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株(400mL 种子液)接种至含发酵培养基的发酵罐(体积为10L)中进行发酵培养，其中，发酵培养基包括：350g的KH2PO4、7g的CaSO4、40g的(NH4)2SO4、50g的 MgSO4、120g的K2SO4以及560g的甘油，然后加入蒸馏水定容至7L。
(2)发酵培养各阶段的条件控制如下：
a、生物量积累阶段：罐温为28℃，pH值为6.0，转速为400rpm，通气量3.5L/min，持续20h；
b、营养流加阶段：步骤a之后，流加甘油和葡萄糖的混合溶液(葡萄糖10g+甘油10g)，发酵参数不变，持续2h；
c、饥饿阶段：步骤b之后，开始流加甲醇并逐渐降低转速和通气量，在 2h内使甲醇含量达到0.5％，温度降低至25℃(此阶段为酵母适应甲醇碳源阶段)，甲醇流速为4.0mL/L/h，流加时间为24h；
d、甲醇流加第二阶段：酵母适应甲醇后，溶氧开始下降，调节转速和通气量使溶氧维持在30％，温度为25℃，pH值为5.5，甲醇流速为4.0mL/L/h，流加时间为48h；
e、甲醇流加第三阶段：减少甲醇流速至2.5mL/L/h，使溶氧维持在20％。 24h后结束发酵，得到含木聚糖酶的发酵上清液。
(3)将发酵上清液提纯后，即可得到木聚糖酶。
(4)木聚糖酶产量测试：在发酵过程中，取不同的时间点(0h、24h、 48h、72h、96h和120h)的发酵上清液，通过上述DNS法测试酶活，结果如图5所示，并进行SDS-PAGE测试，结果如图6所示。由图5和图6可知， 48h之前，木聚糖酶表达量很低，这是由于此时酵母处于营养生长阶段，还没有进入甲醇诱导阶段，故木聚糖酶表达量较低；营养生长阶段的酶活比较低且变化趋势也较小，进入诱导阶段后酶活开始急剧上升，在发酵后期酶活逐渐趋于稳定。在发酵时间达到120h时，木聚糖酶的产量最高，此时，发酵上清液稀释倍数为100倍时酶活为200U/mL，10L发酵液上清稀释100倍测得酶活达到3000U/mL。
(5)木聚糖酶最适应用条件测试：
a、最适温度测试：将水浴温度在55～95℃之间，每隔5℃设定为一个温度反应区间，通过上述DNS法测试木聚糖酶酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各温度反应区间的相对比酶活，计算结果表明，本实施例提供的木聚糖酶的最适温度范围为60～70℃(优选为60℃)。
b、最适pH值测试：将缓冲液的pH值在3～10之间，每隔1个pH单位设定为一个反应区间，通过上述DNS法测试木聚糖酶酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各反应区间的相对比酶活，其中，pH值为3、7 和8时，缓冲液选用50mmol的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液，pH值为4、5和6 时，缓冲液选用50mmol的NaAC-HAC缓冲液，pH值为9和10时，缓冲液选用50mmol的甘氨酸-NaOH缓冲液。计算结果表明，本实施例提供的木聚糖酶的最适pH为5.8～6.2(优选为6.0)。
实施例4
木聚糖酶水解木聚糖
(1)水解木聚糖：取0.5mL实施例3制备的发酵上清液，加入到0.5mL 木聚糖溶液(1％)和1mL醋酸钠-醋酸缓冲液(pH为6.0)的混合溶液中，于60℃水浴反应5min。
(2)薄层层析测试木聚糖水解效果：取上述步骤(1)中的反应液(1～2μL) 点于硅胶板上，吹干后放入有展开剂的展开缸中展层50min，再次吹干硅胶板，然后在硅胶板上均匀喷涂显色剂，吹干后立即放入108℃的烘箱中烘干5min 后取出，结果如图7所示，其中，图7A为本发明实施例4提供的木聚糖酶水解木聚糖的结果图，图7B为公开文献《产碱性木聚糖酶菌株的筛选及酶学性质》中木聚糖酶水解木聚糖的结果图。
由图7可知，图7B中，木聚糖经过木聚糖酶水解后仍然没有被完全水解，而图7A中，木聚糖水解前包括木聚糖和杂多糖，水解后只剩下木二糖以及少量的木糖，说明本发明实施例提供的木聚糖酶可以将木聚糖完全水解。
综上所述，本发明根据毕赤酵母的偏好性对木聚糖基因进行优化设计后，将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2与pAO815表达载体连接后，转入毕赤酵母 GS115中表达，并结合多拷贝技术获得重组表达菌株，最后发酵培养重组表达菌株获得木聚糖酶，其摇瓶发酵的发酵上清液(稀释100倍)的酶活可达 96U/mL，其发酵罐培养的发酵上清液(稀释100倍)的酶活可达3000U/mL，制备工艺简单且产量高，而且提高了木聚糖酶酶活和表达量。此外，本发明提供的制备木聚糖酶的方法，通过培养含上述木聚糖酶基因Xynsyn2的细胞，能够高效率、高产量地生产出木聚糖酶，制备的木聚糖酶的最适温度为60℃，最适pH为6.0，可以高效地水解木聚糖。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉轻工大学
<120> 一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法
<130> 0919
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagattt tgccatctgt tttgattttg ttgttgggtt gtgttccagt tttttcttct 60
caagatgttt ctttgagaga attggctgaa aagttgaaca tttacattgg ttttgctgct 120
attaacaact tttggtcttt gtctgatgct gaaaagtaca tggaagttgc tagaagagaa 180
tttaacattt tgactccaga aaaccaaatg aagtgggata ctattcatcc agaaagagat 240
agatacaact ttactccagc tgaaaagcat gttgaatttg ctgaagaaaa cgatatgatt 300
gttcatggtc atactttggt ttggcataac caattgccag gttggattac tggtagagaa 360
tggactaagg aagaattgtt gaacgttttg gaagatcata ttaagactgt tgtttctcat 420
tttaagggta gagttaagat ttgggatgtt gttaacgaag ctgtttctga ttctggtact 480
tacagagaat ctgtttggta caagactatt ggtccagaat acattgaaaa ggcttttaga 540
tgggctaagg aagctgatcc agatgctatt ttgatttaca acgattactc tattgaagaa 600
attaacgcta agtctaactt tgtttacaac atgattaagg aattgaagga aaagggtgtt 660
ccagttgatg gtattggttt tcaaatgcat attgattaca gaggtttgaa ctacgattct 720
tttagaagaa acttggaaag atttgctaag ttgggtttgc aaatttacat tactgaaatg 780
gatgttagaa ttccattgtc tggttctgaa gaatactact tgaagaagca agctgaagtt 840
tgtgctaaga tttttgatat ttgtttggat aacccagctg ttaaggctat tcaattttgg 900
ggttttactg ataagtactc ttgggttcca ggttttttta agggttacgg taaggctttg 960
ttgtttgatg aaaactacaa cccaaagcca tgttactacg ctattaagga agttttggaa 1020
aagaagattg aagaaagaaa gtaa 1044
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Ile Leu Pro Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys Val Pro
1 5 10 15
Val Phe Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu
20 25 30
Asn Ile Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser
35 40 45
Asp Ala Glu Lys Tyr Met Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu
50 55 60
Thr Pro Glu Asn Gln Met Lys Trp Asp Thr Ile His Pro Glu Arg Asp
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Phe Thr Pro Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Glu
85 90 95
Asn Asp Met Ile Val His Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu
100 105 110
Pro Gly Trp Ile Thr Gly Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn
115 120 125
Val Leu Glu Asp His Ile Lys Thr Val Val Ser His Phe Lys Gly Arg
130 135 140
Val Lys Ile Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Glu Ser Val Trp Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu
165 170 175
Lys Ala Phe Arg Trp Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile
180 185 190
Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val
195 200 205
Tyr Asn Met Ile Lys Glu Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly
210 215 220
Ile Gly Phe Gln Met His Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Phe Arg Arg Asn Leu Glu Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr
245 250 255
Ile Thr Glu Met Asp Val Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr
260 265 270
Tyr Leu Lys Lys Gln Ala Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys
275 280 285
Leu Asp Asn Pro Ala Val Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp
290 295 300
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu
305 310 315 320
Leu Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys
325 330 335
Glu Val Leu Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys
340 345

Claims (8)

1.一种木聚糖酶基因Xynsyn2，用于编码木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述木聚糖酶基因Xynsyn2编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷贝数为多个。
4.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因Xynsyn2。
5.如权利要求4所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。
6.一种如权利要求2至3任意一项所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体。
7.一种如权利要求4至5任意一项所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。
8.一种由如权利要求1所述的木聚糖酶基因Xynsyn2所编码的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRⅠ连接到中间载体pUC57，获得pUC-Xynsyn2载体；
将pUC-Xynsyn2载体和pAO815载体分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；
将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pAO815-Xynsyn2重组表达载体；
将pAO815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株；
培养重组表达菌株，从培养物中获得木聚糖酶。
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