CN107760700B

CN107760700B - β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN107760700B
Application number: CN201710934870.XA
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 陈祺琛
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107760700A

Abstract

本发明公开一种β‑甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β‑甘露聚糖酶及其制备方法及应用，所述β‑甘露聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明解决了现有技术中β‑甘露聚糖酶耐高温性差、酶活低的问题。

Description

β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶具有十分广泛的应用前景，广泛应用于食品、饲料、保健、医药、造纸、纺织等行业。但是现有技术中的β-甘露聚糖酶不耐高温，然而在工业生产加工中常常伴随着高温出现，如酶液的喷雾干燥，饲料的制粒、膨化等时均会出现高温。

现有技术中一般通过PCR技术从相关产β-甘露聚糖酶的微生物中扩增出β-甘露聚糖酶的基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主，表达β-甘露聚糖酶。但是这样获得的β-甘露聚糖酶一般最适温度比较低，最适pH偏中性，蛋白的表达量较小，工业应用限制较大。还有研究人员通过各种手段构建外源基因(一般是小片段基因)的多拷贝表达载体来提高外源基因在宿主中的表达量；还有的将HAC1、PDI等基因和外源基因分别导入宿主细胞内来提高外源基因的表达量。但是并没有解决β-甘露聚糖酶不耐高温的问题。在工业生产加工中常常伴随着高温出现，如酶液的喷雾干燥，饲料的制粒、膨化等时均会出现高温，从而影响β-甘露聚糖酶的应用效果，因此在工业应用中耐高温、高酶活的β-甘露聚糖酶是十分重要意义的。

另外，传统上一般是从自然界产β-甘露聚糖酶的微生物中筛选菌株，然后对菌株进行改良，或者对发酵工艺进行优化。这样筛选的β-甘露聚糖酶的酶活和蛋白表达量一般不高，最适温度较低，在工业生产中易失活。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用，旨在解决现有技术中β-甘露聚糖酶耐高温性差、酶活低的问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种β-甘露聚糖酶基因，其适于编码β-甘露聚糖酶，所述β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种β-甘露聚糖酶，所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种重组表达载体，包括上述的β-甘露聚糖酶基因。

优选的，所述β-甘露聚糖酶基因的拷贝数为多个。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种菌株，包括上述的β-甘露聚糖酶基因。

优选的，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种β-甘露聚糖酶的制备方法，培养上述的菌株，得到β-甘露聚糖酶。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种β-甘露聚糖酶的应用，将上述的β-甘露聚糖酶应用于水解甘露聚糖，在甘露聚糖中加入上述β-甘露聚糖酶。

本发明提供的β-甘露聚糖酶基因(SEQ ID NO:1)，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了β-甘露聚糖酶基因转录出的mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母细胞中的表达量，且将含有该β-甘露聚糖酶基因的载体转入毕赤酵母菌株后得到的β-甘露聚糖酶具有生物酶活性，该β-甘露聚糖酶具有最适pH为5.0、最适温度为70℃的特性，其能够对甘露聚糖完全水解。本发明提供的β-甘露聚糖酶基因具有广阔的应用前景，可在发酵领域应用以高效率、高产量地生产出β-甘露聚糖酶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明中提供的pAO815表达载体的图谱；

图2为本发明中提供的pAO815-β-甘露聚糖酶基因的表达载体的图谱；

图3为本发明提供的单拷贝的pAO815-β-甘露聚糖酶基因的表达载体以及单双酶切检验结果图；

图4为本发明提供的两拷贝β-甘露聚糖酶基因的pAO815-β-甘露聚糖酶基因的表达载体的图谱；

图5为本发明提供的多拷贝重组表达载体的双酶切检验结果；

图6为本发明提供的多拷贝重组表达菌株发酵上清液的SDS-PEGE结果；

图7为本发明提供的两拷贝重组表达菌株在不同时间的发酵上清液的SDS-PEGE结果；

图8为本发明提供的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖薄层层析图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

本发明提供一种β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用，旨在解决现有技术中β-甘露聚糖酶耐高温性差、酶活低的问题。

单拷贝β-甘露聚糖酶的基因的表达载体的构建

1.1合成β-甘露聚糖酶的基因片段

根据现有的β-甘露聚糖酶的基因(来源于海栖热胞菌(Thermotoga maritima))，人工合成β-甘露聚糖酶的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。人工合成的β-甘露聚糖酶对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明人工合成β-甘露聚糖酶的基因序列设计主要考虑了如下几点：

1)通过采用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的高频密码子替换原有的低频密码子；

2)降低了mRNA的自由能；

3)通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域；

4)消除β-甘露聚糖酶中的蛋白酶作用位点。

经过本发明人工合成β-甘露聚糖酶的基因序列中，有效提高了含量较高氨基酸密码子的使用频率；有效降低了β-甘露聚糖酶的基因转录出的mRNA二级结构的复杂性，有利于提高β-甘露聚糖酶的表达量。

1.2单拷贝β-甘露聚糖酶的基因的表达载体

本发明的β-甘露聚糖酶的基因的表达载体优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体，本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、PAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体。本发明下面以pAO815为例来说明，如图1所示。

1.2.1在合成的β-甘露聚糖酶的基因的两端加上酶切位点EcoR I，经过EcoR I酶切后，连接至经过EcoR I酶切后的中间载体pUC57载体上，得到pUC-β-甘露聚糖酶的基因载体。

1.2.2将pUC-β-甘露聚糖酶的基因载体和pAO815载体分别用EcoR I酶切。

本发明采用的酶切体系：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。

1.2.3电泳、胶回收β-甘露聚糖酶的基因片段和pAO815片段，将得到的β-甘露聚糖酶的基因片段和pAO815片段用T4DNA连接酶，得到pAO815-β-甘露聚糖酶的基因的表达载体。

具体的，对步骤1.2.2中EcoR I酶切后得到的基因片段和pAO815片段采用电泳、胶回收。并通过T4DNA连接酶催化电泳、胶回收得到的基因片段和pAO815片段结合。

其中连接体系具体为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的Gal A基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH2O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝β-甘露聚糖酶基因的重组质粒，即pAO815-β-甘露聚糖酶的基因表达载体，其结构如图2所示，β-甘露聚糖酶的基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

1.2.4将pAO815-β-甘露聚糖酶的基因的表达载体转化入巴斯德毕赤酵母中，然后在YPD平板上筛选得到正确的阳性转化子。

在本实施例中采用的巴斯德毕赤酵母(Pichi pastoris GS115)，在其他实施例中也可以为其他的毕赤酵母菌株。

其中正确的阳性转化子为经PCR验证为正确的阳性转化子。

提取质粒载体，使用EcoR I和XbaI进行双酶切验证，结果如图3所示，其中图3中M为DL5000 DNA Marker，1泳道表示没有酶切的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体；2泳道表示单酶切后的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体；3泳道表示双酶切后的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体，在图3中在1000bp位置有条带，说明β-甘露聚糖酶的基因成功连接至pAO815表达载体上。

单拷贝β-甘露聚糖酶的基因的菌株的构建

根据上述得到的单拷贝β-甘露聚糖酶的基因的表达载体转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，可获得含单拷贝β-甘露聚糖酶基因的单拷贝表达的菌株。

多拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体的构建

本发明以两拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体来详细说明构建原理。

2.1构建两拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体

2.1.1获得含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段

含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段即含有β-甘露聚糖酶基因目的基因的片段，通过同尾酶双酶切法获得含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段。

步骤2.1.1具体的为：将上述“单拷贝菌株的构建”中得到的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体用Bgl II和BamH I双酶切后，胶回收大片段得到含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段，该酶切体系具体为：

30μL的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因表达载体、1.5μL的BamH I、1.5μL的Bgl II、20μL的10×Buffer K、20μL的BSA、20μL的Triton X-100、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下，酶切4h左右。

2.1.2取新的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体，用BamH I单酶切，并将步骤2.1.1中得到的含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段与其重组质粒，即得到两拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体，也即两拷贝的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因表达载体如图4所示。

如需要构建三拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体，则将两拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体作为上述步骤2.1.2中新的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体，将步骤2.1.1中得到的含β-甘露聚糖酶基因的表达盒片段与其重组质粒，得到三拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体。

以此类推，若要得到四拷贝，则将三拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体作为步骤2.1.2中新的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因重组表达载体，……，故，在此不再详述。

含多拷贝β-甘露聚糖酶基因的多拷贝重组表达菌株的构建

根据上述得到的多拷贝β-甘露聚糖酶的基因的重组表达载体转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，可获得含多拷贝β-甘露聚糖酶基因的多拷贝重组表达菌株。

下面将对获得的多拷贝重组表达菌株的表达量、酶活验证。

(1)对多拷贝重组表达菌株发酵培养，取上清，进行SDS-PEGE检测，检测结果如图6所示。由图6可以看出，两拷贝重组表达菌株的上清液中的β-甘露聚糖酶含量较高，这也说明两拷贝的pAO815-β-甘露聚糖酶的基因表达载体的β-甘露聚糖酶的表达量较高。

(2)对β-甘露聚糖酶的酶活测定，DNS法测β-甘露聚糖酶酶活

取0.5mL适当稀释的上清液(步骤2.1.5得到的)，加入到0.5mL 1％魔芋精粉和1mLpH 5.0醋酸钠-醋酸缓冲液混合液中；

50℃水浴反应10min，用2mL DNS(3，5-二硝基水杨酸)终止反应；

置于沸水浴中5min，加水定容到25mL；对照组加入沸水浴灭活的酶，其它不变；

测量OD₅₂₀吸光值，并对照葡萄糖标准曲线算出葡萄糖的浓度，根据后文的酶活公式计算出β-甘露聚糖酶酶活；

每分钟水解甘露聚糖形成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活(U/mL)计算公式：U＝r×Df×1000/180.6/t，其中，Df：酶液稀释倍数；r为根据OD₅₂₀吸光值得到的葡萄糖的摩尔浓度(μmol/mL)；t为反应时间(min)。

通过上述计算方式，本发明提供的单拷贝重组表达菌株的上清液稀释100倍酶活为：50U/mL，相比其它文献中原始基因单拷贝的酶活为5-10不等，酶活至少提高了400％；两拷贝重组表达菌株的上清液稀释100倍的酶活为：71U/mL，两拷贝重组表达菌株的酶活比单拷贝提高了24％。

生产β-甘露聚糖酶的方法

本发明提供的生产β-甘露聚糖酶的方法，下面以含两拷贝β-甘露聚糖酶基因的两拷贝重组表达菌株培养得到β-甘露聚糖酶的方法为例，对含两拷贝β-甘露聚糖酶基因的两拷贝重组表达菌株进行发酵培养。该方法包括：

步骤S311，将含两拷贝β-甘露聚糖酶基因的两拷贝重组表达菌株接种至发酵培养基的发酵罐中。

所述步骤S311中的两拷贝重组表达菌株取400ml种子液，所述发酵培养基取7L。其中发酵培养基的成分比例选取如下：

KH₂PO₄：350g；CaSO₄：7g；(NH₄)₂SO₄：40g；MgSO₄：50g；K₂SO₄：120g；甘油：560g；蒸馏水：定容至7L。

步骤S312，控制发酵罐中的条件，具体的条件为发酵罐内的温度为28℃，pH 5.0左右，转速200-500rpm，通气量2.0-5.5L/min，发酵时间20h。

步骤S313，待按步骤S312中的条件发酵后，流加甘油和葡萄糖的混合溶液(各50％)，开度20％，补充营养，发酵参数不变，持续2h。

步骤S314，待步骤S313结束后流加甲醇。

待步骤S313结束后发酵罐溶氧会不断上升，逐渐降低通气量和转速。

其中，步骤S314中流加甲醇分为三个阶段：

第一阶段，控制发酵罐内2h内使甲醇含量达到0.5％，温度降到25℃。

第二阶段，待第一阶段结束后，调节转速和通气使溶氧维持在30％左右，温度25℃，pH 5.5左右，甲醇流速为4.0mL/L/h。

此时，酵母适应甲醇后，溶氧开始下降。

第三阶段，发酵到后期，溶氧波动较大，此时减少甲醇流速至2.5mL/L/h，使溶氧维持在20％左右。当发酵液pH迅速增加时表明酵母细胞开始破碎，此时结束发酵，得到含β-甘露聚糖酶的发酵上清液。

步骤S315，对发酵上清液提纯后可得到β-甘露聚糖酶。

其中，发酵过程中，可在不同发酵的时间点(24h、48h、72h、96h)取发酵液上清，进行SDS-PEGE，如图7所示，由图7可以看出在发酵96h时，β-甘露聚糖酶的产量最高。

此外，测得发酵液酶活在最适PH为5.0，最适温度为70℃时，稀释倍数为100倍时酶活为62U/mL；14L发酵液上清稀释100倍测得酶活达到3918U/mL。

β-甘露聚糖酶对甘露聚糖的水解效果验证

该实施例主要对上述得到的β-甘露聚糖酶的性能的验证

取0.5mL生产β-甘露聚糖酶时的发酵上清液，加入到0.5mL 1％甘露聚糖和1mL pH5.0醋酸钠-醋酸缓冲液混合液中，70℃水浴反应10min，得到反应液。取反应液进行薄层层析，将水解的样品点于硅胶板上，点1～2μL即可，用吹风机吹干样品，放入加有展开剂的展开缸中进行展层约50min即可，用吹风机吹干硅胶板，在硅胶板上均匀喷上显色剂并用风机吹干立即拿到108℃烘箱烘5min即可。结果如图8所示。

从图8中可看出，本发明实施例得到的β-甘露聚糖酶可将甘露聚糖完全水解。

综上，本发明通过选择毕赤酵母偏好密码子等手段进行基因优化后，将合成的β-甘露聚糖酶基因(SEQ ID NO:1)与pAO815表达载体连接后，转入毕赤酵母GS115中表达，β-甘露聚糖酶基因单拷贝菌株小摇瓶发酵上清稀释100倍酶活达到50U/mL，β-甘露聚糖酶的最适pH为5.0，最适温度为70℃。

三拷贝的重组表达菌株发酵液上清稀释100倍酶活达到71U/mL，在14L发酵罐中发酵96h的发酵上清液在pH5.0，70℃，稀释100倍条件下酶活达到3918U/mL。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉轻工大学

<120> β-甘露聚糖酶基因、重组表达载体、菌株、β-甘露聚糖酶及其制备方法及应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaattcctgc ctaaagcctc ccctgcaccg tctacctcta gcagtgctgc ctccacctcc 60

ttcgccagca cctccggcct ccaattcacc attgatggcg aaactggcta cttcgccgga 120

acgaacagct actggatcgg tttcctcact gacaacgcgg acgtcgacct cgtcatgggc 180

cacctgaagt cgtccggcct caagatcctg cgtgtgtggg gcttcaacga tgtcacctcg 240

cagccctcct ccggcacagt ctggtaccaa ctgcaccagg acggcaaatc gacaatcaac 300

acgggtgccg acggtctcca gcgcttggac tacgtcgtct cgtctgccga acagcacgac 360

atcaaactca tcatcaactt cgtcaactac tggaccgatt acggtggtat gtctgcgtac 420

gtgagcgctt atggcggatc tggcgagacg gatttctata ccagtgatac catgcagagt 480

gcctatcaga catatatcaa gacggtcgtg gagcggtaca gtaactcctc ggctgtgttt 540

gcgtgggagt tggcgaatga gccgagatgt ccgagttgcg atacttctgt gttgtataac 600

tggattgaga agacgagtaa gtttattaag gggttggatg cggatcgtat ggtttgtatt 660

ggtgatgagg gcttcggtct caacatcgac tcggacggca gctaccctta tcaattctcc 720

gagggcttga actttacgat gaacctcggt atcgatacta ttgactttgg taccctccac 780

ttgtaccctg atagctgggg cacctccgac gactggggca acggctggat caccgcccac 840

ggcgcagcct gcaaagcggc cggcaagcca tgtctcctgg aggaatacgg agtcacctcg 900

aaccactgca gtgtggaggg ctcgtggcag aagacagctc tctctacaac gggcgtcggc 960

gcggatctgt tctggcagta tggtgatgat ttgagtaccg gtaagtcgcc agatgatggg 1020

aatactatct actatggtac tagtgattat cagtgcctgg tgacggatca tgttgctgct 1080

attggtagtg cttaatctag ac 1102

<110> 武汉轻工大学

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Leu Ser Asn Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Asn Val Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Ser Ala Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe

35 40 45

Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp

50 55 60

Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His

65 70 75 80

Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp

85 90 95

Val Thr Ser Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln

100 105 110

Asp Gly Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu

115 120 125

Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile

130 135 140

Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr

165 170 175

Met Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr

180 185 190

Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg

195 200 205

Cys Pro Ser Cys Asp Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr

210 215 220

Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr

245 250 255

Gln Phe Ser Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr

260 265 270

Ile Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser

275 280 285

Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys

290 295 300

Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn

305 310 315 320

His Cys Ser Val Glu Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr

325 330 335

Gly Val Gly Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr

340 345 350

Gly Lys Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp

355 360 365

Tyr Gln Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

370 375 380

Claims

1.一种β-甘露聚糖酶基因，其适于编码β-甘露聚糖酶，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，且由所述β-甘露聚糖酶基因编码所得的β-甘露聚糖酶的最适温度为70℃。

2.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶基因的拷贝数为多个。

4.一种菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因。

5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

6.一种β-甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，培养如权利要求4或5所述的菌株，得到β-甘露聚糖酶。