CN111286497A - 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用 - Google Patents

一种催化性能提高的脂肪酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111286497A
CN111286497A CN202010100869.9A CN202010100869A CN111286497A CN 111286497 A CN111286497 A CN 111286497A CN 202010100869 A CN202010100869 A CN 202010100869A CN 111286497 A CN111286497 A CN 111286497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipase
ala
amino acid
pro
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010100869.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111286497B (zh
Inventor
喻晓蔚
徐岩
温露文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202010100869.9A priority Critical patent/CN111286497B/zh
Publication of CN111286497A publication Critical patent/CN111286497A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111286497B publication Critical patent/CN111286497B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体公开了一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供一种热稳定性提高的脂肪酶CALB突变体A146G‑L278M和A146G‑L278M‑A151P的基因及酯合成应用。本发明在野生型脂肪酶基因序列的基础上，进行理性设计选择合适的突变位点，最终获得了Tm值分别提高了3.3℃和4.2℃、最适反应温度提高5℃且催化效率提高了4.1倍的突变体。

Description

一种催化性能提高的脂肪酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体涉及一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
脂肪酶具有良好的水解、转酯、酯化、酯交换等反应的催化能力，在食品、医药、精细化工、生物能源等行业中应用广泛。微生物来源的脂肪酶已成为工业应用中脂肪酶的主要来源。工业中的催化反应一般在较高的温度下进行，一方面是增加温度能提高酶反应速率，另一方面是由于温度的升高可以提高反应物的溶解度并减少微生物污染的风险。此外，也可减少冷却设备的使用，从而节约生产成本。但是自然界中天然的微生物脂肪酶在高温下极易失活，限制了脂肪酶在工业中的应用。因此，获得最适温度提高、热稳定性强、催化活性高的脂肪酶对于工业应用具有重要意义。
南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)，CALB由于具有出色的酯合成、水解、转酯等催化活性，广泛应用于工业。但天然来源的CALB耐热性较差，较高温度下催化活力低，很大程度上制约了CALB在工业中的应用。因此提高CALB的最适反应温度、耐热性及催化活性对拓宽CALB的工业应用具有重要意义。
提高脂肪酶的催化特性的途径主要有两个，一是从自然界中筛选获得，二是对现有的酶进行分子改造。其中，酶的分子改造主要有两个途径，一是定向进化，二是理性设计。通过以上方法可以提高酶的一种或者两种特性，但是能够同时提高酶的多种催化特性的报道较少，如同时提高最适反应温度、耐热性及催化活性。
Xie等人通过选取活性部位附近高B-factor值的柔性位点进行突变，成功得到南极假丝酵母脂肪酶B的优势双突变体D223G/L278M，其在48℃下的半衰期为49min，为野生型的13倍；孵育15min的半失活温度(T50 15)为58.5℃，较野生型提高了12℃；Tm值较野生型增加了3.6℃；最适温度比野生型提高了6.5℃；催化效率(kcat/Km)比起野生型，无显著变化，均为38.4min-1μM-1。对于单突变体L278M，其在48℃下的半衰期比野生型提高了6.4倍，催化效率(kcat/Km)较野生型提高了40％，最适反应温度提高了2.5℃。(参考文献：Xie,Y.,An,J.,Yang,G.,Wu,G.,Zhang,Y.,Cui,L.,Feng,Y.,2014.Enhanced enzyme kinetic stabilitybyincreasing rigidity within the active site.The Journal of biologicalchemistry.289,7994-8006.)。此外，谢渊等人还成功获得了催化效率较野生型分别提高26倍和33倍的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A281F和I285F。通过进一步组合突变成功获得热稳定性和催化效率均有所提高的三点突变体D223G/L278M/A281F，酶的热稳定性及催化效率较野生型分别有6.5倍和10倍的提升，但其最适反应温度情况并无报道(谢渊,脂肪酶活性中心区域进化提高酶动力学稳定性和催化活性.吉林大学,2014.)。
Zhang等人采用定向进化策略来筛选热稳定性有所提高的突变体，经两轮易错PCR分别得到两株热稳定性有所提高的突变体23G5(V210I/A281E)和195F1(V210I/A281E/V221D)，比起野生型，突变体23G5和195F1在70℃的半衰期增加了约20倍；对于底物p-NB，突变体23G5和195F1的催化效率(kcat/Km)分别比野生型高4.4和3.3倍(参考文献：Zhang,N.,Suen,W.C.,Windsor,W.,Xiao,L.,Madison,V.,Zaks,A.,2003.Improving tolerance ofCandida antarctica lipase B towards irreversible thermal inactivation throughdirected evolution.Protein Engineering,Design and Selection.16,599-605.)。
Kim等人依据结合B-factor值和RosettaDesign算法进行氨基酸残基位点的选择，成功获得热稳定性有所提高的南极假丝酵母脂肪酶B的两个突变体K13L、R249L。尤其是R249L，其在55℃孵育1h后的残余酶活比野生型高2倍，比起野生型Tm值增加了2.3℃。动力学研究结果表明，与野生型相比，突变体R249L和野生型的Vmax/Km分别为0.048s-1和0.052s-1，说明突变后催化活性没有太大变化(参考文献：Kim,H.S.,Le,Q.A.T.,Kim,Y.H.,2010.Development of thermostable lipase B from Candida antarctica(CalB)through in silico design employing B-factor and RosettaDesign.Enzyme andMicrobial Technology.47,1-5.)。
Park等人通过分子动力学模拟结合RosettaDesign算法选择合适的氨基酸残基位点，成功获得了热稳定性提高的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A251E，A251E在50℃下的半衰期(251min)是野生型(100min)的2.5倍。但是比起野生型，突变体A251E的比活下降了一半(参考文献：Park,H.J.,Park,K.,Kim,Y.H.,Yoo,Y.J.,2014.Computational approach fordesigning thermostable Candida antarctica lipase B by molecular dynamicssimulation.Journal of Biotechnology.192,66-70.)。
Le等人采用计算机工具MODIP和DbD v1.20预测CALB潜在的二硫键形成位点，最终成功获得热稳定性提高的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A162C-K308C。突变体A162C-K308C的酶液在50℃孵育1h后，其残余酶活是野生型的1.5倍。突变体A162C-K308C在50℃的半衰期(220min)比野生型(49min)提高了约4.5倍。比起野生型Tm值增加了1.1℃。突变体R249L和野生型的Vmax/Km分别为0.851s-1和0.936s-1，突变后催化效率有轻微的下降(参考文献：Le,Q.A.T.,Joo,J.C.,Yoo,Y.J.,Kim,Y.H.,2011.Development of thermostable Candidaantarctica lipase B through novel in silico design of disulfidebridge.Biotechnology and Bioengineering.109,867-876.)。
Chodorge等人建立的一个理性定向策略，筛选得到一株热稳定性有所提高的突变体35E3(N317Y)，该突变体在90℃孵育15min后，其残余酶活是野生型的7.5倍。而且，突变体35E3和野生型在E.coli中的表达水平和酶活力相差不大(参考文献：Chodorge,M.,Fourage,L.,Ullmann,C.,Duvivier,V.,Masson,J.-M.,Lefèvre,F.,2005.RationalStrategies for Directed Evolution of Biocatalysts–Application to Candidaantarctica lipase B(CALB).Advanced Synthesis&Catalysis.347,1022-1026.)。
Peng等人通过氨基酸残基的B Value和多位点饱和诱变，在CALB中引入氢键，同时将其展示在酵母表面，以提高热稳定性。最后获得突变体mCALB7(P218N/L219K/F220T/V221S)和mCALB168(A57T/T89A/G226R/R168K)。在60℃下的半衰期，与展示在酵母表面野生型CALB相比，突变体mCALB168和mCALB7的残余酶活分别增加了14和7倍，该文献未报道突变后酶活是否发生了变化(参考文献：Peng,X.-Q.,2013.Improved Thermostability ofLipase B from Candida antarctica by Directed Evolution and Display on YeastSurface.Applied Biochemistry and Biotechnology.169,351-358.)。
发明内容
本发明是通过对南极假丝酵母脂肪酶B进行酶工程分子改造，获得最适反应温度、耐热性及催化活性均提高的突变体酶。从而拓宽CALB在工业上的应用。
本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶突变体，其氨基酸序列是(1)或(2)：
(1)SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
(2)在SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的基础上，经修饰、缺失或添加一或多个氨基酸获得的同源性90％及以上的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体，是氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸。编码所述脂肪酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸，第151位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸。编码所述脂肪酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码脂肪酶亲本酶的基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述脂肪酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pPICZαA。
本发明的第四个目的是提供表达上述脂肪酶突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括毕赤酵母。
本发明的第五个目的是提供一种同时提高脂肪酶的最适反应温度、活性和热稳定性的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸，或将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸，第151位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸。
本发明的第六个目的是提供一种制备上述脂肪酶突变体的方法，是将OD600达到2～6的含上述细胞的菌体转移至BMMY培养基，加入甲醇诱导，26～30℃，200～220rpm摇床培养。
本发明的第七个目的是提供上述脂肪酶突变体在食品、制药、生物能源或化工领域的应用。
本发明的有益效果：本发明提供一种脂肪酶突变体，脂肪酶突变体最适反应温度提高，并且具有良好的热稳定性及催化活力。双点突变A146G/L278M和三点突变A146G/L278M/A151P的最适反应温度均为50℃，比野生型提高了5℃；Tm值分别提高了3.3℃和4.2℃。两点突变和三点突变的催化效率均为野生型的4.1倍。与野生型脂肪酶相比，本发明提供的脂肪酶突变体耐热性有明显提高，且催化活性有所提升，有利于工业应用。
附图说明
图1：未纯化突变体及野生型酶的热稳定性及发酵酶活。
图2：本发明实施例提供的突变体和野生型的最适反应温度的测定曲线图。
图3：本发明实施例提供的突变体和野生型的Tm测定曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、实验材料和试剂：
质粒和菌株：基因由由GENEWIZ公司合成；表达宿主菌及载体：GS115和pPICZαA均由本实验室保藏，均来源于商业途径；定点突变脂肪酶重组质粒由本实验室构建。
主要试剂：PCR产物纯化试剂盒等购自OMEGA BIO-TEK公司。博莱霉素Zeocin购自Invitrogen公司，DNA和蛋白Marker，限制性内切酶NotI，EcoRI以及PrimeSTAR均购自Takara公司，T4 DNA连接酶和限制性内切酶PmeI购自New England Biolabs公司。其他常规试剂为国产分析纯。
实验仪器：离心机(Eppendorf)；配备氢火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent)；差示扫描量热仪(Waters)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；PCR仪(Bio-Rad)；
Figure BDA0002386823860000051
蛋白纯化仪(美国GE公司)。
主要培养基：YPD培养基(酵母粉10g·L-1，胰蛋白胨20g·L-1，葡萄糖20g·L-1)，LLB培养基(酵母粉5g·L-1，胰蛋白胨10g·L-1，NaCl 5g·L-1)、BMGY培养基(酵母粉10g·L-1，胰蛋白胨20g·L-1，甘油10g·L-1，pH 6.0磷酸盐缓冲液100mmol·L-1，YNB13.4g·L-1，生物素4×10-4g·L-1)，BMMY培养基(酵母粉10g·L-1，胰蛋白胨20g·L-1，甲醇10g·L-1，pH6.0磷酸盐缓冲液100mmol·L-1，YNB 13.4g·L-1，生物素4×10-4g·L-1)。
2、脂肪酶酶活力的测定
在酶促反应条件下，1min内生成1μmol己酸乙酯所需的酶量定义为1个酶活力单位U。根据产物与内标峰面积之比计算产物的含量。
1)实验仪器：恒温水浴锅；配备氢火焰离子化检测器的气相色谱仪(Agilent)等。
2)实验材料：正庚烷、己酸、乙醇(国药试剂)。
3)溶液配制：
pH缓冲液：20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)；
20mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0～8.0)；
20mM tris-HCl(pH 8.0～9.0)。
底物溶液：1.2mol/L己酸/庚烷、1.2mol/L乙醇/庚烷；
4)CALB酯合成酶活测定法：于EP管中加入200μL己酸/庚烷(1.2mol/L)，200μL乙醇/庚烷(1.2mol/L)，最后加入10μL酶液，于45℃下反应60min。反应结束后，取200μL上清液进行气相色谱分析。计算产物己酸乙酯的含量。
实施例1脂肪酶突变体突变位点的预测
基于南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构，采用计算机辅助进行蛋白质设计，确定的突变位点如表1所示。
表1突变氨基酸的选取
Figure BDA0002386823860000061
实施例2脂肪酶突变体的重组质粒的构建
根据突变位点进行引物合成，以编码南极假丝酵母来源的脂肪酶B的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，通过重叠延伸PCR进行定点突变(定点突变引物见表2)。PCR扩增获得的点突变基因后，通过T4连接酶将点突变基因与表达载体pPICZαA相连。随后采用化学转化法将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态中，涂布至含25μg·mL-1博莱霉素LLB筛选平板。挑取转化子提质粒，进行测序鉴定，最后获得含突变体基因的重组质粒pPICZαA-A130C、pPICZαA-A146G、pPICZαA-N181V、pPICZαA-N264P、pPICZαA-L278M、pPICZαA-S50R、pPICZαA-S56M、pPICZαA-Q112L、pPICZαA-A151P、pPICZαA-G226R。
表2引物
引物 序列(5’-3’)
S50R ATCTTTTGATAGAAACTGGATTCCATTGT
S56M GATTCCATTGATGACTCAATTGGGTTAC
Q112L GTTTGGTTGCTTTGTGGGGTTTG
A130C ATAGATTGATGTGTTTTGCTCCTG
A146G TGGTCCATTGGATGGTTTGGCTGTTT
A151P GGCTGTTTCTCCACCTTCTGTT
N181V GTTCCAACTACTGTTTTGTACTCTGCT
G226R TTGATCATGCTAGATCTTTGACT
N264P CTTTGCCAGCTCCAGATTTGACTCC
L278M TGCTGCTTTGATGGCTCCAG
注：正反向引物完全互补。
实施例3脂肪酶突变体的重组质粒的转化与验证
采用限制性核酸内切酶PmeΙ分别线性化上述重组质粒。分别取200ng线性化片段，加入毕赤酵母GS115感受态细胞中混匀后转移至电转杯，冰浴5min后采用电转仪(Eppendorf)进行电转，电转结束加入1mL山梨醇进行复苏，并于30℃，200rpm下复苏培养2h。随后将复苏液涂布至含100μg·mL-1博莱霉素YPD筛选平板，培养2～3d。
分别挑取转化子接种至YPD培养基，过夜培养。收集菌体提取基因组。以基因组为模板，采用通用引物3’AOX和5’AOX进行PCR验证。阳性克隆可得到扩增得到1500bp大小的条带。
通用引物如下：
3’AOX1：GCAAATGGCATTCTGACATCC；
5’AOX1：GACTGGTTCCAATTGACAAGC。
实施例4摇瓶发酵验证
将上述经验证得到的阳性克隆突变体的转化子分别接种至BMGY培养基，30℃培养至OD600达到2～6；后将BMGY培养液倒入50mL离心管中，然后4℃，6000rpm离心10min，弃去上清液收集菌体。用BMMY培养基吹吸悬浮菌体沉淀，并将其转移至BMMY培养基，同时加入1％的甲醇诱导。28℃，200rpm摇床发酵培养。每隔24h加入10g·L-1的甲醇进行诱导。培养120小时，分别取上清液，测定酶活和分析酶学性质，并与野生型脂肪酶进行比较。
实施例5发酵液纯化
发酵结束后，离心收集发酵液。随后将发酵液置于pH 8.0，20mM的Tris-HCl缓冲液中透析。透析结束后，采用超滤浓缩透析液。随后采用QFF阴离子交换柱纯化浓缩透析液。由于CALB具有pH 4～8的广泛的等电区域，因此在pH 8.0条件下，CALB的净电荷几乎为零，故突变体蛋白主要集中在穿透峰流出。收集穿透峰，浓缩后即得突变体纯酶。
实施例6酶学性质测定
为简化筛选步骤，首先测定实施例4中未经纯化的突变体酶在发酵液中的热稳定性。将发酵液置于50℃下孵育180min后测定残余酶活，以未孵育的发酵液酶活为100％，同时测定点突变对酶活的影响，结果如图1。在50℃下孵育180min，突变体A146G，A151P和L278M的热稳定性均有显著提高，残余酶活分别是野生型的2.0，1.5和2.8倍。此外，酶活分别为野生型的0.77，1.2，0.97倍，其余突变体酶活提高程度不高，甚至有所下降。
选取其中的有效单点突变进行组合突变，获得A146G/L278M两点突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和A146G/L278M/A151P(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)三点突变体，对这两种突变体纯化后进行酶学特性研究。
最适反应温度分析：分别在35，40，45，50，55，60℃条件下测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图2所示。与野生型相比，上述两个突变体最适温度均提高了5℃。
Tm分析：采用差示扫描量热法(DSC)对上述两个突变体和野生型进行Tm的测定。结果如图3所示。与野生型相比，两个突变体Tm值分别提高了3.3℃和4.2℃。
催化效率分析：测定野生型和突变体纯酶的反应动力学参数。两点突变和三点突变的催化效率均为野生型的4.1倍，说明突变体的催化效率高于野生型。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> Candida antarctica
<400> 1
ttgccatctg gttctgatcc tgctttttct caaccaaagt ctgttttgga tgctggtttg 60
acttgtcaag gtgcttctcc atcttctgtt tctaaaccta ttttgttggt tccaggtact 120
ggtactactg gtcctcaatc ttttgattct aactggattc cattgtctac tcaattgggt 180
tacactcctt gttggatttc tccacctcca ttcatgttga acgatactca agttaacact 240
gaatacatgg ttaacgctat cactgctttg tatgctggtt ctggtaacaa taagttgcca 300
gttttgactt ggtctcaagg tggtttggtt gctcaatggg gtttgacttt ctttccatct 360
atcagatcta aggttgatag attgatggct tttgctcctg attataaagg tactgttttg 420
gctggtccat tggatgcttt ggctgtttct gctccttctg tttggcaaca aactactggt 480
tctgctttga ctactgcttt gagaaacgct ggtggtttga ctcaaatcgt tccaactact 540
aatttgtact ctgctactga tgagattgtt caacctcaag tttctaactc tccattggat 600
tcttcttatt tgttcaacgg taaaaacgtt caagctcaag ctgtttgtgg tcctttgttt 660
gttattgatc atgctggttc tttgacttct caattctctt acgttgttgg tagatctgct 720
ttgagatcta ctactggtca agctagatct gctgattatg gtattactga ttgtaaccct 780
ttgccagcta atgatttgac tccagaacaa aaagttgctg ctgctgcttt gttggctcca 840
gctgctgctg ctattgttgc tggtcctaag caaaattgtg agcctgattt gatgccatac 900
gctagacctt tcgctgttgg taaaagaact tgttctggta ttgttactcc ttaa 954
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> Candida antarctica
<400> 2
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 3
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgccatctg gttctgatcc tgctttttct caaccaaagt ctgttttgga tgctggtttg 60
acttgtcaag gtgcttctcc atcttctgtt tctaaaccta ttttgttggt tccaggtact 120
ggtactactg gtcctcaatc ttttgattct aactggattc cattgtctac tcaattgggt 180
tacactcctt gttggatttc tccacctcca ttcatgttga acgatactca agttaacact 240
gaatacatgg ttaacgctat cactgctttg tatgctggtt ctggtaacaa taagttgcca 300
gttttgactt ggtctcaagg tggtttggtt gctcaatggg gtttgacttt ctttccatct 360
atcagatcta aggttgatag attgatggct tttgctcctg attataaagg tactgttttg 420
gctggtccat tggatggttt ggctgtttct gctccttctg tttggcaaca aactactggt 480
tctgctttga ctactgcttt gagaaacgct ggtggtttga ctcaaatcgt tccaactact 540
aatttgtact ctgctactga tgagattgtt caacctcaag tttctaactc tccattggat 600
tcttcttatt tgttcaacgg taaaaacgtt caagctcaag ctgtttgtgg tcctttgttt 660
gttattgatc atgctggttc tttgacttct caattctctt acgttgttgg tagatctgct 720
ttgagatcta ctactggtca agctagatct gctgattatg gtattactga ttgtaaccct 780
ttgccagcta atgatttgac tccagaacaa aaagttgctg ctgctgcttt gatggctcca 840
gctgctgctg ctattgttgc tggtcctaag caaaattgtg agcctgattt gatgccatac 900
gctagacctt tcgctgttgg taaaagaact tgttctggta ttgttactcc ttaa 954
<210> 5
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Gly Leu Ala Val Ser Pro Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Met Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 6
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgccatctg gttctgatcc tgctttttct caaccaaagt ctgttttgga tgctggtttg 60
acttgtcaag gtgcttctcc atcttctgtt tctaaaccta ttttgttggt tccaggtact 120
ggtactactg gtcctcaatc ttttgattct aactggattc cattgtctac tcaattgggt 180
tacactcctt gttggatttc tccacctcca ttcatgttga acgatactca agttaacact 240
gaatacatgg ttaacgctat cactgctttg tatgctggtt ctggtaacaa taagttgcca 300
gttttgactt ggtctcaagg tggtttggtt gctcaatggg gtttgacttt ctttccatct 360
atcagatcta aggttgatag attgatggct tttgctcctg attataaagg tactgttttg 420
gctggtccat tggatggttt ggctgtttct ccaccttctg tttggcaaca aactactggt 480
tctgctttga ctactgcttt gagaaacgct ggtggtttga ctcaaatcgt tccaactact 540
aatttgtact ctgctactga tgagattgtt caacctcaag tttctaactc tccattggat 600
tcttcttatt tgttcaacgg taaaaacgtt caagctcaag ctgtttgtgg tcctttgttt 660
gttattgatc atgctggttc tttgacttct caattctctt acgttgttgg tagatctgct 720
ttgagatcta ctactggtca agctagatct gctgattatg gtattactga ttgtaaccct 780
ttgccagcta atgatttgac tccagaacaa aaagttgctg ctgctgcttt gatggctcca 840
gctgctgctg ctattgttgc tggtcctaag caaaattgtg agcctgattt gatgccatac 900
gctagacctt tcgctgttgg taaaagaact tgttctggta ttgttactcc ttaa 954
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atcttttgat agaaactgga ttccattgt 29
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gattccattg atgactcaat tgggttac 28
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtttggttgc tttgtggggt ttg 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atagattgat gtgttttgct cctg 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tggtccattg gatggtttgg ctgttt 26
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggctgtttct ccaccttctg tt 22
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttccaacta ctgttttgta ctctgct 27
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttgatcatgc tagatctttg act 23
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctttgccagc tccagatttg actcc 25
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgctgctttg atggctccag 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcaaatggca ttctgacatc c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gactggttcc aattgacaag c 21

Claims (10)

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列是(1)或(2)：
(1)SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
(2)在SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的基础上，经修饰、缺失或添加一或多个氨基酸获得的同源性90％及以上的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因。
3.含权利要求2所述基因的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包括pPICZαA。
5.表达权利要求1所述脂肪酶突变体的细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞的宿主包括毕赤酵母。
7.一种同时提高脂肪酶的最适反应温度、活性和热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸。
8.一种同时提高脂肪酶的最适反应温度、活性和热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的脂肪酶亲本酶的第146位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸，第151位氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸。
9.一种制备权利要求1所述脂肪酶突变体的方法，其特征在于，将OD600达到2～6的含权利要求5所述的细胞的菌体转移至BMMY培养基，加入甲醇诱导，26～30℃，200～220rpm摇床培养。
10.权利要求1所述的脂肪酶突变体在食品、制药、生物能源或化工领域的应用。
CN202010100869.9A 2020-02-19 2020-02-19 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用 Active CN111286497B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010100869.9A CN111286497B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010100869.9A CN111286497B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111286497A true CN111286497A (zh) 2020-06-16
CN111286497B CN111286497B (zh) 2021-08-24

Family

ID=71019082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010100869.9A Active CN111286497B (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111286497B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226468A (zh) * 2020-12-16 2021-01-15 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 酶催化的双迈克尔连续加成方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660517A (zh) * 2011-12-08 2012-09-12 上海交通大学 热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法
CN103881992A (zh) * 2012-12-21 2014-06-25 沈阳药科大学 一种脂肪酶突变体及其用途
CN105200024A (zh) * 2015-08-24 2015-12-30 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 脂肪酶calb突变体、其制备方法及应用
CN106085975A (zh) * 2016-06-16 2016-11-09 上海交通大学 一种高效提高酶热动力学稳定性的通用策略
CN107384892A (zh) * 2017-07-14 2017-11-24 江南大学 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用
CN108118043A (zh) * 2016-11-26 2018-06-05 华中科技大学 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660517A (zh) * 2011-12-08 2012-09-12 上海交通大学 热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法
CN103881992A (zh) * 2012-12-21 2014-06-25 沈阳药科大学 一种脂肪酶突变体及其用途
CN105200024A (zh) * 2015-08-24 2015-12-30 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 脂肪酶calb突变体、其制备方法及应用
CN106085975A (zh) * 2016-06-16 2016-11-09 上海交通大学 一种高效提高酶热动力学稳定性的通用策略
CN108118043A (zh) * 2016-11-26 2018-06-05 华中科技大学 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体
CN107384892A (zh) * 2017-07-14 2017-11-24 江南大学 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体、改造方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PARK HJ等: "Computational approach for designing thermostable Candida antarctica lipase B by molecular dynamics simulation", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
XIE Y等: "Enhanced enzyme kinetic stability by increasing rigidity within the active site", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
刘艳如等: "理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体", 《微生物学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226468A (zh) * 2020-12-16 2021-01-15 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 酶催化的双迈克尔连续加成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111286497B (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108913671B (zh) 一种ω-转氨酶突变体及其应用
CN107937365B (zh) 一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用
CN106591271A (zh) 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN112301012B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法
CN106635846B (zh) 一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株
CN109182298B (zh) 一种重组脂肪酶突变体、工程菌及应用
CN107858337B (zh) 一种耐热突变脂肪酶及制备方法与应用
CN111286497B (zh) 一种催化性能提高的脂肪酶及其应用
CN111235135A (zh) 一种中性普鲁兰酶突变体及其应用
CN108359655A (zh) 一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因
CN107916257B (zh) T1脂肪酶突变体和应用
CN114836406B (zh) 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用
CN110592119A (zh) 一种来源于类芽孢杆菌新型普鲁兰酶及其基因与应用
CN114250217B (zh) 一种理性设计提升腈水解酶活性的方法及应用
CN113755473B (zh) 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用
CN112574975B (zh) 甘油酯脂肪酶突变体g28c-p206c及其编码基因与应用
CN110819609B (zh) 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
CN114752583A (zh) 一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用
CN108220268B (zh) 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌
CN106636019B (zh) Sortase A介导的(S)-羰基还原酶寡聚体高效催化(S)-苯基乙二醇的合成
CN114621944B (zh) 酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体
CN112680425B (zh) 一种醇脱氢酶突变体及其应用
CN112210544B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
CN112481245B (zh) 一种重组d-塔格糖3差向异构酶dte-cm及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant