CN102660517A - 热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法 - Google Patents

热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法 Download PDF

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CN102660517A CN2011104069229A CN201110406922A CN102660517A CN 102660517 A CN102660517 A CN 102660517A CN 2011104069229 A CN2011104069229 A CN 2011104069229A CN 201110406922 A CN201110406922 A CN 201110406922A CN 102660517 A CN102660517 A CN 102660517A
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Abstract

本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。热稳定性提高的脂肪酶突变体由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No：2、SEQ ID No：3和SEQ ID No：4均由317个氨基酸组成。本发明运用半理性设计的方法，对南极假丝酵母脂肪酶B基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变D223G、L278M及它们的组合。以各自的T50 15及48℃的半衰期t1/2来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

Description

热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。
背景技术
脂肪酶(Lipase)是一种用途十分广泛的生物催化剂，不仅可催化油脂在水相中的水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯等反应，常被用于洗涤剂添加剂、食品、制药工业、造纸工业和生物能源等方面。其中，南极假丝酵母脂肪酶B是目前最为有效的生物催化剂之一，广泛用于药物的手性拆分及生物柴油的生产(KirkO，Anderson EM，Karin M(1998)One biocatalyst-many applications：The use ofCandida antarctica b-lipase in organic synthesis.Biocatal Biotransform 16(3)：181-204)。但是工业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，长久以来一直在制约着脂肪酶的发展和应用。如为了保证催化效率，许多反应需要在较高温度下进行，而南极假丝酵母脂肪酶B属于中温脂肪酶，它的热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且使酶易于失活，增加了生产成本。因此，获得一株热稳定性提高的脂肪酶具有重要的工业应用价值。
半理性设计是一种结合了理性设计和定向进化两方面优势的方法，其主旨在于构建小而有效的突变库。目前，半理性设计已成功用于改变酶的底物特异性、热稳定性、对映体选择性等，并取得了显著的成绩(Reetz MT，Carballeira JD，PeyralansJ，Hobenreich H，Maichele A，Vogel A(2006a)Expanding the substrate scope ofenzymes：Combining mutations obtained by casting.Chemistry-a European Journal 12(23)：6031-6038.Reetz MT，D Carballeira J，Vogel A(2006b)Iterative saturationmutagenesis on the basis of b factors as a strategy for increasing protein thermostability.Angewandte Chemie-International Edition 45(46)：7745-7751.Reetz MT，Prasad S，Carballeira JD，Gumulya Y，Bocola M(2010)Iterative saturation mutagenesisaccelerates laboratory evolution of enzyme stereoselectivity：Rigorous comparison withtraditional methods.J Am Chem Soc 132(26)：9144-9152)。
我们首先利用已知的信息进行分析，找出可能的“热点”，再对这些“热点”进行饱和突变，构建突变文库；然后选择合适的载体和宿主进行表达；最后对文库进行筛选得到性质改变的突变体。再以此突变株作为模板，重复上述过程，直至变体达到所预期的要求。
大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期工作中，发明人已成功将南极假丝酵母脂肪酶B在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌作为宿主细胞，利用半理性设计的方法，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。本发明的脂肪酶突变体已于2011年11月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。其中，突变体Asp223Gly的保藏编号为CGMCC No.5390，突变体Leu278Met的保藏编号为CGMCC No.5389，突变体Asp223Gly/Leu278Met的保藏编号为CGMCC No.5387，野生型WT的保藏编号为CGMCC No.5388。
本发明的技术方案是：一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No：2、SEQ IDNo：3和SEQ ID No：4均由317个氨基酸组成。
上述热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，包括以下步骤：
A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆
对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因；
上游引物：5’-AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’，带下划线碱基为限制性内切酶NcoI识别位点；
下游引物：5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点；
以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b(Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB；
B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定
对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID：1TCA)，脂肪酶的催化三联体为：自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点：自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；
C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选
C1、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞
以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2％(v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37℃下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库；
C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体
将步骤C1中37℃培养后的LB抗性平板在4℃下放置1天，进行初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到分属5个突变体库的母板；
从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37℃培养3h，4℃放置30min，再加入终浓度为1mM的IPTG，15℃培养24h；
利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液；将所得到的粗酶液在49℃下孵育15min，再于冰上放置10min，室温放置15min，测定每孔的残余活力；
将从5个突变体库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mM，15℃诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T50 15，确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选，得到两个热点的优秀突变体，分别是D223G和L278M；
以L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变：针对285位缬氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并参考上述步骤进行新一轮的筛选；
经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为：Asp223Gly、Leu278Met和Asp223Gly/Leu278Met。
步骤A中所述的PCR反应的反应条件为：98℃2min；然后98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，共25个循环；最后72℃10min。
步骤C 1中所述的该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min；然后98℃10sec，55℃15sec，72℃7min，共25个循环；最后72℃10min。
上述热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6或SEQ ID No：7所示。
上述热稳定性提高的脂肪酶突变体应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸、或生物能源工业生产中。
与野生型南极假丝酵母脂肪酶B相比，本发明的脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以各自的T50 15及48℃的半衰期t1/2来表示热稳定性的提高，本发明的脂肪酶突变体的提高幅度如表1所示：
表1
Figure BDA0000117546970000041
本发明运用半理性设计的方法，对南极假丝酵母脂肪酶B基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变D223G、L278M及它们的组合。以各自的T50 15及48℃的半衰期t1/2来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1为脂肪酶突变体Asp223Gly的反向测序峰图；
图2为脂肪酶突变体Leu278Met的反向测序峰图；
图3、图4为脂肪酶突变体Asp223Gly/Leu278Met的反向测序峰图。
具体实施方式
下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可以参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，Dsvid W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物均由上海生工合成。
实施例1野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆
野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因由南京金斯瑞公司合成，通过上游引物5’-AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶NcoI识别位点)和下游引物5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)扩增目的基因，该PCR反应使用Takara的PrimeSTAR聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min，然后98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b(Novagen)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的南极假丝酵母脂肪酶B基因序列正确，且正确连入pET22b中，将该重组质粒命名为pET22b-CALB。
实施例2南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定
对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID：1TCA)，脂肪酶的催化三联体为：自N端起第104位的丝氨酸，第187位的天冬氨酸，第224位的组氨酸。选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定一系列的B因子较高的残基(自N端起，第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸)作为饱和突变的热点。
实施例3饱和突变体库的建立及突变体的筛选
用下述方法筛选具有较好热稳定性的南极假丝酵母脂肪酶B的变体，具体过程包括以下步骤：
1、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞
以实施例1中克隆的重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对实施例2中确定的热点，分别在第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件是：98℃2min；然后98℃10sec，55℃15sec，72℃7min，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对于5个定点饱和突变的PCR扩增产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2％(v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37℃下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库。
2、在饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体
将步骤1中37℃培养后的平板在4℃下放置1天，进行初步筛选。将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到分属5个突变库的母板。
从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37℃培养3h，4℃放置30min，再加入终浓度为1mM的IPTG，15℃培养24h。
利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液。将所得到的粗酶液在49℃下孵育15min，再于冰上放置10min，室温放置15min，测定每孔的残余活力。
将5个突变库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mM，15℃诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T50 15，确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选。第一轮筛选得到了两个热点的优秀突变体，分别是D223G和L278M，而277、281、285三个热点的突变体库并没有筛选到优秀突变体。
以突变体L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变：针对285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并参考上述步骤进行新一轮的筛选。
3、经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为：Asp223Gly、Leu278Met和双点突变Asp223Gly/Leu278Met。
图1为脂肪酶突变体Asp223Gly的反向测序峰图。
图2为脂肪酶突变体Leu278Met的反向测序峰图。
图3、图4为脂肪酶突变体Asp223Gly/Leu278Met的反向测序峰图。
实施例3南极假丝酵母脂肪酶B变体的热稳定性测定与活力测定
为了测定脂肪酶变体的T50 15活力及半衰期，需要对酶进行分离提纯。
将超声破碎得到的粗酶液通过Ni2+离子亲和柱进行纯化，透析过夜即可得到纯的脂肪酶变体组分。
脂肪酶活力，半衰期及T50 15的测定方法：
脂肪酶活力测定的方法为pNPC法(p-nitrophenyl caprylate)(Cai JG，Xie YA，Song B，Wang YP，Zhang ZM，Feng Y(2011)Fervidobacterium changbaicum lip1：Identification，cloning，and characterization of the thermophilic lipase as a new memberof bacterial lipase family v.Appl Microbiol Biotechnol 89(5)：1463-1473.)。酶活的定义为pH7.5、37℃下反应每分钟产生1umol对硝基苯酚的酶量为一个活力单位。
脂肪酶在48℃下半衰期的测定方法为：在48℃下孵育酶液，在不同处理时间取样，pNPC法测定脂肪酶残余活力百分比。以残余活力百分比的ln值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数kinact，由t1/2＝ln2/kinact得到脂肪酶在该温度下的半衰期。
脂肪酶的T50 15测定方法为：将一定浓度的酶液分装到PCR管中，利用PCR仪在不同温度下保温15min，再于冰上放置10min，室温15min，测定每管中的残余活力。以残余活力百分比的ln值对保温温度T(℃)作图，得到斜率k，由T50 15＝ln2/k得到脂肪酶的T50 15。
以下列出本发明中的热稳定性提高的三种脂肪酶突变体的氨基酸残基序列和相应的三种脂肪酶突变体基因的核苷酸序列。
<210>SEQ ID NO：1
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母脂肪酶B氨基酸序列
<400>1
Leu Pro Ser Gly Ser  Asp Pro Ala Phe Ser  Gln Pro Lys Ser Val  Leu Asp Ala Gly Leu
                  5                   10                   15                   20
Thr Cys Gln Gly Ala  Ser Pro Ser Ser Val  Ser Lys Pro Ile Leu  Leu Val Pro Gly Thr
                 25                   30                   35                   40
Gly Thr Thr Gly Pro  Gln Ser Phe Asp Ser  Asn Trp Ile Pro Leu  Ser Thr Gln Leu Gly
                 45                   50                   55                   60
Tyr Thr Pro Cys Trp  Ile Ser Pro Pro Pro  Phe Met Leu Asn Asp  Thr Gln Val Asn Thr
                 65                   70                   75                   80
Glu Tyr Met Val Asn  Ala Ile Thr Ala Leu  Tyr Ala Gly Ser Gly  Asn Asn Lys Leu Pro
                 85                   90                   95                  100
Val Leu Thr Trp Ser  Gln Gly Gly Leu Val  Ala Gln Trp Gly Leu  Thr Phe Phe Pro Ser
                105                  110                  115                  120
Ile Arg Ser Lys Val  Asp Arg Leu Met Ala  Phe Ala Pro Asp Tyr  Lys Gly Thr Val Leu
                125                  130                  135                  140
Ala Gly Pro Leu Asp  Ala Leu Ala Val Ser  Ala Pro Ser Val Trp  Gln Gln Thr Thr Gly
                145                  150                  155                  160
Ser Ala Leu Thr Thr  Ala Leu Arg Asn Ala  Gly Gly Leu Thr Gln  Ile Val Pro Thr Thr
                165                  170                  175                  180
Asn Leu Tyr Ser Ala  Thr Asp Glu Ile Val  Gln Pro Gln Val Ser  Asn Ser Pro Leu Asp
                185                  190                  195                  200
Ser Ser Tyr Leu Phe  Asn Gly Lys Asn Val  Gln Ala Gln Ala Val  Cys Gly Pro Leu Phe
                205                  210                  215                  220
Val Ile Asp His Ala  Gly Ser Leu Thr Ser  Gln Phe Ser Tyr Val  Val Gly Arg Ser Ala
                225                  230                  235                  240
Leu Arg Ser Thr Thr  Gly Gln Ala Arg Ser  Ala Asp Tyr Gly Ile  Thr Asp Cys Asn Pro
                245                  250                  255                  260
Leu Pro Ala Asn Asp  Leu Thr Pro Glu Gln  Lys Val Ala Ala Ala  Ala Leu Leu Ala Pro
                265                  270                  275                  280
Ala Ala Ala Ala Ile  Val Ala Gly Pro Lys  Gln Asn Cys Glu Pro  Asp Leu Met Pro Tyr
                285                  290                  295                  300
Ala Arg Pro Phe Ala  Val Gly Lys Arg Thr  Cys Ser Gly Ile Val  Thr Pro
                305                  310                  315      317
<210>SEQ ID NO：2
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly的氨基酸殘基序列
<400>2
Leu Pro Ser Gly Ser  Asp Pro Ala Phe Ser  Gln Pro Lys Ser Val  Leu Asp Ala Gly Leu
                  5                   10                   15                   20
Thr Cys Gln Gly Ala  Ser Pro Ser Ser Val  Ser Lys Pro Ile Leu  Leu Val Pro Gly Thr
                 25                   30                   35                   40
Gly Thr Thr Gly Pro  Gln Ser Phe Asp Ser  Asn Trp Ile Pro Leu  Ser Thr Gln Leu Gly
                 45                   50                   55                   60
Tyr Thr Pro Cys Trp  Ile Ser Pro Pro Pro  Phe Met Leu Asn Asp  Thr Gln Val Asn Thr
                 65                   70                   75                   80
Glu Tyr Met Val Asn  Ala Ile Thr Ala Leu  Tyr Ala Gly Ser Gly  Asn Asn Lys Leu Pro
                 85                   90                   95                  100
Val Leu Thr Trp Ser  Gln Gly Gly Leu Val  Ala Gln Trp Gly Leu  Thr Phe Phe Pro Ser
                105                  110                  115                  120
Ile Arg Ser Lys Val  Asp Arg Leu Met Ala  Phe Ala Pro Asp Tyr  Lys Gly Thr Val Leu
                125                  130                  135                  140
Ala Gly Pro Leu Asp  Ala Leu Ala Val Ser  Ala Pro Ser Val Trp  Gln Gln Thr Thr Gly
                145                  150                  155                  160
Ser Ala Leu Thr Thr  Ala Leu Arg Asn Ala  Gly Gly Leu Thr Gln  Ile Val Pro The Thr
                165                  170                  175                  180
Asn Leu Tyr Ser Ala  Thr Asp Glu Ile Val  Gln Pro Gln Val Ser  Asn Ser Pro Leu Asp
                185                  190                  195                  200
Ser Ser Tyr Leu Phe  Asn Gly Lys Ash Val  Gln Ala Gln Ala Val  Cys Gly Pro Leu Phe
                205                  210                  215                  220
Val Ile Gly His Ala  Gly Ser Leu Thr Ser  Gln Phe Ser Tyr Val  Val Gly Arg Ser Ala
                225                  230                  235                  240
Leu Arg Ser Thr Thr  Gly Gln Ala Arg Ser  Ala Asp Tyr Gly Ile  Thr Asp Cys Asn Pro
                245                  250                  255                  260
Leu Pro Ala Asn Asp  Leu Thr Pro Glu Gln  Lys Val Ala Ala Ala  Ala Leu Leu Ala Pro
                265                  270                  275                  280
Ala Ala Ala Ala Ile  Val Ala Gly Pro Lys  Gln Asn Cys Glu Pro  Asp Leu Met Pro Tyr
                285                  290                  295                  300
Ala Arg Pro Phe Ala  Val Gly Lys Arg Thr  Cys Ser Gly Ile Val  Thr Pro
                305                  310                  315      317
<210>SEQ ID NO：3
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Leu278Met的氨基酸殘基序列
<400>3
Leu Pro Ser Gly Ser  Asp Pro Ala Phe Ser  Gln Pro Lys Ser Val  Leu Asp Ala Gly Leu
                  5                   10                   15                   20
Thr Cys Gln Gly Ala  Ser Pro Ser Ser Val  Ser Lys Pro Ile Leu  Leu Val Pro Gly Thr
                 25                   30                   35                   40
Gly Thr Thr Gly Pro  Gln Ser Phe Asp Ser  Asn Trp Ile Pro Leu  Ser Thr Gln Leu Gly
                 45                   50                   55                   60
Tyr Thr Pro Cys Trp  Ile Ser Pro Pro Pro  Phe Met Leu Asn Asp  Thr Gln Val Asn Thr
                 65                   70                   75                   80
Glu Tyr Met Val Asn  Ala Ile Thr Ala Leu  Tyr Ala Gly Ser Gly  Asn Asn Lys Leu Pro
                 85                   90                   95                  100
Val Leu Thr Trp Ser  Gln Gly Gly Leu Val  Ala Gln Trp Gly Leu  Thr Phe Phe Pro Ser
                105                  110                  115                  120
Ile Arg Ser Lys Val  Asp Arg Leu Met Ala  Phe Ala Pro Asp Tyr  Lys Gly Thr Val Leu
                125                  130                  135                  140
Ala Gly Pro Leu Asp  Ala Leu Ala Val Ser  Ala Pro Ser Val Trp  Gln Gln Thr Thr Gly
                145                  150                  155                  160
Ser Ala Leu Thr Thr  Ala Leu Arg Asn Ala  Gly Gly Leu Thr Gln  Ile Val Pro Thr Thr
                165                  170                  175                  180
Asn Leu Tyr Ser Ala  Thr Asp Glu Ile Val  Gln Pro Gln Val Ser  Asn Ser Pro Leu Asp
                185                  190                  195                  200
Ser Ser Tyr Leu Phe  Asn Gly Lys Asn Val  Gln Ala Gln Ala Val  Cys Gly Pro Leu Phe
                205                  210                  215                  220
Val Ile Asp His Ala  Gly Ser Leu Thr Ser  Gln Phe Ser Tyr Val  Val Gly Arg Ser Ala
                225                  230                  235                  240
Leu Arg Ser Thr Thr  Gly Gln Ala Arg Ser  Ala Asp Tyr Gly Ile  Thr Asp Cys Asn Pro
                245                  250                  255                  260
Leu Pro Ala Asn Asp  Leu Thr Pro Glu Gln  Lys Val Ala Ala Ala  Ala Leu Met Ala Pro
                265                  270                  275                  280
Ala Ala Ala Ala Ile  Val Ala Gly Pro Lys  Gln Asn Cys Glu Pro  Asp Leu Met Pro Tyr
                285                  290                  295                  300
Ala Arg Pro Phe Ala  Val Gly Lys Arg Thr  Cys Ser Gly Ile Val  Thr Pro
                305                  310                  315      317
<210>SEQ ID NO：4
<211>317
<212>PRT
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly/Leu278Met的氨基酸殘基序列
<400>4
Leu Pro Ser Gly Ser  Asp Pro Ala Phe Ser  Gln Pro Lys Ser Val  Leu Asp Ala Gly Leu
                  5                   10                   15                   20
Thr Cys Gln Gly Ala  Ser Pro Ser Ser Val  Ser Lys Pro Ile Leu  Leu Val Pro Gly Thr
                 25                   30                   35                   40
Gly Thr Thr Gly Pro  Gln Ser Phe Asp Ser  Asn Trp Ile Pro Leu  Ser Thr Gln Leu Gly
                 45                   50                   55                   60
Tyr Thr Pro Cys Trp  Ile Ser Pro Pro Pro  Phe Met Leu Asn Asp  Thr  Gln Val Asn Thr
                 65                   70                   75                   80
Glu Tyr Met Val Asn  Ala Ile Thr Ala Leu  Tyr Ala Gly Ser Gly  Asn Asn Lys Leu Pro
                 85                   90                   95                  100
Val Leu Thr Trp Ser  Gln Gly Gly Leu Val  Ala Gln Trp Gly Leu  Thr Phe Phe Pro Ser
                105                  110                  115                  120
Ile Arg Ser Lys Val  Asp Arg Leu Met Ala  Phe Ala Pro Asp Tyr  Lys Gly Thr Val Leu
                125                  130                  135                  140
Ala Gly Pro Leu Asp  Ala Leu Ala Val Ser  Ala Pro Ser Val Trp  Gln Gln Thr Thr Gly
                145                  150                  155                  160
Ser Ala Leu Thr Thr  Ala Leu Arg Asn Ala  Gly Gly Leu Thr Gln  Ile Val Pro Thr Thr
                165                  170                  175                  180
Asn Leu Tyr Ser Ala  Thr Asp Glu Ile Val  Gln Pro Gln Val Ser  Asn Ser Pro Leu Asp
                185                  190                  195                  200
Ser Ser Tyr Leu Phe  Asn Gly Lys Asn Val  Gln Ala Gln Ala Val  Cys Gly Pro Leu Phe
                205                  210                  215                  220
Val Ile Gly His Ala  Gly Ser Leu Thr Ser  Gln Phe Ser Tyr Val  Val Gly Arg Ser Ala
                225                  230                  235                  240
Leu Arg Ser Thr Thr  Gly Gln Ala Arg Ser  Ala Asp Tyr Gly Ile  Thr Asp Cys Asn Pro
                245                  250                  255                  260
Leu Pro Ala Asn Asp  Leu Thr Pro Glu Gln  Lys Val Ala Ala Ala  Ala Leu Met Ala Pro
                265                  270                  275                  280
Ala Ala Ala Ala Ile  Val Ala Gly Pro Lys  Gln Asn Cys Glu Pro  Asp Leu Met Pro Tyr
                285                  290                  295                  300
Ala Arg Pro Phe Ala  Val Gly Lys Arg Thr  Cys Ser Gly Ile Val  Thr Pro
                305                  310                  315      317
<210>SEQ ID NO：5<211>954
<212>DNA
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly基因的核苷酸序列<400>5
CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCG CAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG  60
ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTC TCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC 120
GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCG AACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT 180
TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCG TTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG 240
GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTC TACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC 300
GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTT GCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT 360
ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCC TTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC 420
GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGT GCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT 480
TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCA GGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC 540
AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTT CAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC 600
TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTC CAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC 660
GTCATCGGTC ATGCAGGCTC GCTCACCTCG CAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC 720
CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGT GCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT 780
CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAA AAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CCTGGCGCCG 840
GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAG CAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC 900
GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACC TGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA       954
<210>SEQ IDNO：6
<211>954
<212>DNA
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Leu278Met基因的核苷酸序列
<400>6
CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCG CAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG  60
ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTC TCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC 120
GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCG AACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT 180
TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCG TTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG 240
GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTC TACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC 300
GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTT GCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT 360
ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCC TTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC 420
GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGT GCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT 480
TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCA GGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC 540
AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTT CAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC 600
TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTC CAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC 660
GTCATCGACC ATGCAGGCTC GCTCACCTCG CAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC 720
CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGT GCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT 780
CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAA AAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG 840
GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAG CAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC 900
GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACC TGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA       954
<210>SEQ IDNO：7
<211>954
<212>DNA
<213>南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly/eu278Met基因的核苷酸序列
<400>7
CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCG CAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG  60
ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTC TCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC 120
GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCG AACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT 180
TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCG TTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG 240
GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTC TACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC 300
GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTT GCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT 360
ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCC TTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC 420
GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGT GCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT 480
TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCA GGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC 540
AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTT CAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC 600
TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTC CAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC 660
GTCATCGGGC ATGCAGGCTC GCTCACCTCG CAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC 720
CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGT GCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT 780
CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAA AAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG 840
GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAG CAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC 900
GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACC TGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA       954

Claims (6)

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于：由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQID No：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No：2、SEQ IDNo：3或SEQ ID No：4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No：2、SEQ ID No：3和SEQ ID No：4均由317个氨基酸组成。
2.根据权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆
对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因；
上游引物：5’-AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’，带下划线碱其为限制性内切酶NcoI识别位点；
下游引物：5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点；
以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b(Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB；
B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定
对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID：1TCA)，脂肪酶的催化三联体为：自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点：自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；
C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选
C1、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞
以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2％(v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37℃下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库；
C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体
将步骤C 1中37℃培养后的LB抗性平板在4℃下放置1天，进行初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到分属5个突变体库的母板；
从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37℃培养3h，4℃放置30min，再加入终浓度为1mM的IPTG，15℃培养24h；
利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液；将所得到的粗酶液在49℃下孵育15min，再于冰上放置10min，室温放置15min，测定每孔的残余活力；
将从5个突变体库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mM，15℃诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T50 15，确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选，得到两个热点的优秀突变体，分别是D223G和L278M；
以L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变：针对285位缬氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并参考上述步骤进行新一轮的筛选；
经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为：Asp223Gly、Leu278Met和Asp223Gly/Leu278Met。
3.如权利要求2所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于：步骤A中所述的PCR反应的反应条件为：98℃2min；然后98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，共25个循环；最后72℃10min。
4.如权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于：步骤C1中所述的该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min；然后98℃10sec，55℃15sec，72℃7min，共25个循环；最后72℃10min。
5.根据权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因，其特征在于：所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5、SEQ IDNo：6或SEQ ID No：7所示。
6.根据权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的应用，其特征在于：所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸、或生物能源工业生产中。
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