CN107502601B - 一种胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶突变体及其基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种对胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2‑m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G及其基因和应用。本发明的三个突变体的胰蛋白酶抗性均有明显提高，经相同浓度的胰蛋白酶处理后，lipY2‑m的抗胰蛋白酶半衰期为41.5min，K36G/K39T的抗胰蛋白酶半衰期为43.9min；R63G的抗胰蛋白酶半衰期为45.7min；组合突变体K36G/K39T/R63G的抗胰蛋白酶半衰期为46.8min，对胰蛋白酶抗性的半衰期分别提高了5.8％、10.1％和12％，显示出了在治疗胰腺功能不全等疾病方面的潜在应用价值。

Description

一种胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶突变体及其基因和应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T/R63G及其基因和应用。
背景技术
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又称甘油酯水解酶，它是一类特殊的酯键水解酶，与只能在单相催化底物反应的酯酶不同，脂肪酶在其催化过程中需要有界面，这个界面分隔两个物理相，在分子水平上是一至两层有序的相邻分子层，一层亲水，一层疏水。它在油水界面可催化甘油三酯的水解生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯。同时脂肪酶在疏水介质中还可催化酯化、转酯、酯交换等反应。
脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，大多数微生物脂肪酶的最适pH作用范围在中性或偏碱性，少数为酸性。细菌脂肪酶最适pH在4.0-11.0，真菌脂肪酶最适pH在4.0-10.0，其中真菌脂肪酶具有在有机溶剂中高活性，且提取成本比较低的优点。因此，脂肪酶在饲料添加剂、食品加工、生物制药等诸多领域有广泛的应用。
脂肪酶是人体内脂肪代谢所必须的酶，若缺失将会引起健康问题。通过外部口服脂肪酶，可以帮助人体内的脂肪消化，同时脂肪酶还可以用于恶性肿瘤的治疗。血液中的脂肪酶还可以用于胰脏疾病的诊断，当胰脏发生病发后，血液中的脂肪酶含量显著上升。慢性胰腺炎等胰腺疾病往往会导致胰腺外分泌功能不全和减少脂肪消化酶的产生，这反过来又会导致脂肪吸收不良，腹泻和营养不良。目前主要的治疗方法是每餐胰脂肪酶代替疗法，即口服补充脂肪酶来治疗胰腺功能不全。而代替脂肪酶必须通过食道，胃和十二指肠才能到达小肠发挥作用。一般情况下正常人胃的平均pH为3，然而大部分脂肪酶在低pH值下很不稳定，甚至可能失活。当食物从胃中被转移到十二指肠后，许多脂肪酶的活性又会被胆汁盐所抑制。
据报道，来源于耶氏解酯酵母的酸性脂肪酶lipY2在较低pH值下仍表现出较高的活性和稳定性，且活性几乎不受胆盐的影响。正由于lipY2独特的生化特性，使其成为胰脂肪酶替代疗法的一个理想的候选酶。然而，这种酶的实际效果往往因为其很容易被胰蛋白酶所降解而降低。脂肪酶普遍存在于自然界中，但目前已确定的脂肪酶不是对胆盐和消化酶敏感就是在较低的pH值下很不稳定，它们没有一个整合这些所有的优势。因此，利用蛋白质工程手段对lipY2进行酶分子改造，提高其在肠道中对胰蛋白酶水解的抗性至关重要。
随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行改造已成为当前酶工程领域研究的热点。
发明内容
本发明的目的是通过定点突变的方法对脂肪酶进行改造，使改造后的脂肪酶在对胰蛋白酶的抗性上性质更加优良。
本发明的另一目的是提供编码上述突变的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组质粒。
本发明还提供了一种工程菌株，其含有如前所述的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因或如前所述的重组质粒。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种定点突变的脂肪酶突变体，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第36位的赖氨酸突变为甘氨酸且第39位的赖氨酸突变为甘氨酸。
一种定点突变的脂肪酶突变体，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第63位精氨酸突变为甘氨酸。
一种定点突变的脂肪酶突变体，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第36位的赖氨酸突变为甘氨酸，第39位的赖氨酸突变为甘氨酸且第63位精氨酸突变为甘氨酸。
一种定点突变的脂肪酶基因，其编码权利要求1所述的定点突变的脂肪酶突变体K36G/K39T，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
或权定点突变的脂肪酶突变体R63G，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
或定点突变脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T/R63G，基因核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
一种包含权利要求4所述脂肪酶突变体基因的重组载体及重组菌株。
一种包含权利要求4所述脂肪酶突变体基因的重组菌株，所述重组菌株为毕赤酵母。
一种制备胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m的方法，包括以下步骤
⑴用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
⑵培养重组菌株，诱导重组定点突变的脂肪酶lipY2-m的表达；
⑶回收并纯化所表达的定点突变的脂肪酶lipY2-m。
定点突变的脂肪酶突变体的应用。
本发明的有点和积极效果如下：
本发明应用定点突变的方法改造脂肪酶，获得脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G。经相同浓度的胰蛋白酶处理后，与lipY2相比，K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G对胰蛋白酶抗性的半衰期分别提高了5.8％、10.1％和12％。
经相同浓度的胰蛋白酶处理后，lipY2的抗胰蛋白酶半衰期为41.5min，K36G/K39T的抗胰蛋白酶半衰期为43.9min；R63G的抗胰蛋白酶半衰期为45.7min；K36G/K39T/R63G的抗胰蛋白酶半衰期为46.8min，对胰蛋白酶抗性的半衰期分别提高了5.8％、10.1％和12％。本发明使脂肪酶在治疗胰蛋白酶缺陷的疾病方面，拥有更广阔的前景。
附图内容
图1为PCR产物电泳图：M：maker(10kb)；1：PCR产物。
图2为重组质粒pPIC9K-lipY2-m突变体的构建。
图3为重组质粒pPIC9K-lipY2-m突变体的酶切验证：M：maker(10kb)；1：pPIC9K-K36G/K39T重组质粒双酶切结果。
图4为MM-罗丹明B培养基筛选，蓝色圆圈为对照GS115。
图5为改造前、后的lipY2及其突变体最适pH的变化曲线图。
图6为改造前、后的lipY2及其突变体酸稳定性的变化曲线图。
图7为改造前、后的胰蛋白酶对lipY2及其突变体的影响曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。
本发明通过定点突变的方法对脂肪酶进行改造，使改造后的脂肪酶在对胰蛋白酶的抗性上性质更加优良，分别是突变的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因。构建含有上述基因的工程菌株和重组质粒。
本发明所述工程菌株为毕赤酵母GS115。本发明所述基因的载体为pPIC9K。
本发明对来源于耶氏解脂酵母的脂肪酶lipY2基因进行定点突变，该脂肪酶lipY2的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。
本实验采用定点突变的方法，获得了3个胰蛋白酶抗性提高的突变体，分别命名为K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G，即K36G/K39T为第36位的赖氨酸突变为甘氨酸且第39位的赖氨酸突变为苏氨酸；R63G为第63位精氨酸突变为甘氨酸；K36G/K39T/R63G为第36位的赖氨酸突变为甘氨酸且第39位的赖氨酸突变为苏氨酸，第63位的精氨酸突变为甘氨酸。
因此根据本发明的胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m突变体K36G/K39T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
突变体R63G，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
突变体K36G/K39T/R63G的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了编码上述胰蛋白酶抗性改良脂肪酶lipY2-m的突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8所示。
将上述编码胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m的突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的分子以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明选择的载体为pPIC9K，使改造的脂肪酶基因插入到pPIC9K上的两个限制性酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到各突变体的重组酵母表达质粒。
具体的操作及重组蛋白的性能检测过程如下：
实施例1：
突变基因的获得
以来源于耶氏解酯酵母胞外脂肪酶lipY2的基因序列(SEQ ID NO.2)进行改造，通过Overlap-PCR的方式引入突变，并对其进行测序，获得突变基因。
突变包括6条引物lipY2-F1、lipY2-R1、K36G/K39T-F1、K36G/K39T-R1、R63G-F1、R63G-R1。
引物序列如下：
lipY2-F1：5’-CCGAATTCGTGTACACCTCTACCGAGACCT-3’
lipY2-R1：5’-CCGCGGCCGCTTAGATACCACAGA-3’
K36G/K39T-F1:5’-TGGTCCCGGCACCggtATCTTCactCCCTTCAACTGTGGCCTGCAATGTG-3’
K36G/K39T-R1:5’-CACATTGCAGGCCACagtTGAAGGGAGTGAAGATaccGGTGCCGGGACCA-3’
R63G-F1:5’-CTCATCGAGGAGTTCCACGACCCCggtCTCATCTTTGATGTTTCTGGTTA-3’
R63G-R1:5’-TAACCAGAAACATCAAAGATGAGaccGGGGTCGTGGAACTCCTCGATGAG-3’
下划线代表限制性酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ，小写字母表示的为突变碱基重叠延伸PCR法是通过3个反应来完成的。以pPIC9K-lipY2质粒为模板，以突变体K36G/K39T为例：
PCR-1反应体系与程序设定：
Figure BDA0001320139930000041
Figure BDA0001320139930000051
PCR-2反应体系与程序设定：
Figure BDA0001320139930000052
将PCR-1产物与PCR-2产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行
切胶回收后，等体积混合后稀释100倍以此作为模板，以lipY2-F1、lipY2-R1为引物，其他同常规PCR反应体系，进行30次循环。
PCR-3反应体系与程序设定如下：
Figure BDA0001320139930000053
PCR-3扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳验证后，如图1所示，切去目的条带，用回收试剂盒进行胶回收。通过测序确定脂肪酶的突变体基因(SEQ ID NO.6)。
实施例2：
表达载体pPIC9K-lipY2突变体的构建
将PCR产物与载体质粒PMD19-T进行连接反应，再将载体转化至菌株Ecoli JM109中，并接种到含有Amp的平板上，因为重组质粒含Amp抗性基因，所以导入了重组质粒的大肠杆菌也具有抗性，本发明根据是否带有抗性来筛选重组子，在抗性平板上可以生长的就是构建成功的重组子。以突变体K36G/K39T为例，
利用试剂盒提取质粒后，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ将上述获得重组子PMD19-T-K36G/K39T质粒与表达载体pPIC9K分别进行双酶切，酶切条件如下
Figure BDA0001320139930000061
37℃反应3h，琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收两个目的片段。用SolutionⅠ连接两个片段，连接体系如下：
Figure BDA0001320139930000062
16℃连接后，转化至大肠杆菌JM109，并接种到含Amp的平板上，筛选重组子，重组质粒pPIC9K-K36G/K39T也含抗性基因，因此可以用同样的方法进行重组子的筛选，完成重组质粒pPIC9K-K36G/K39T的构建如图2所示。然后用试剂盒提取质粒，将各目的基因的重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切验证，酶切电泳结果如图3所示。说明pPIC9K-K36G/K39T连接成功，同样的方法可构建得到重组质粒pPIC9K-R63G与pPIC9K-K36G/K39T/R63G。
实施例3：
lipY2-m突变体表达载体转化毕赤酵母及工程菌的筛选
将经Sal I线性化的重组质粒pPIC9K-lipY2-m(pPIC9K-lipY2-m为定点突变改造后的各脂肪酶基因代号)通过电转仪转入毕赤酵母GS115感受态中，电转化条件为电压1500V，电阻2500Ω。电转化完成后将重组菌涂布在MD平板上，从MD平板上挑取单菌落转接到含浓度0.5mg/mL为遗传霉素G418的平板上，G418是一种氨基糖普类抗生素，能干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，并对原核和真核等细胞产生毒素。重组质粒pPIC9K-lipY2-m上含G418抗性基因，能在含G418的选择性培养基中生长。从G418抗性平板上挑取大的单菌落转接到浓度2mg/mL的平板上，挑取大的单菌落对应编号转接到YPD与MM-罗丹明B培养基上培养。经MM-罗丹明B筛选平板培养后，产脂肪酶的重组酵母菌菌落周围在紫外灯照射下出现了明显的荧光圈，如图4所示。一般来说其所产脂肪酶的活性与荧光圈直径成正比，将荧光圈较大的重组酵母菌株于YPD平板上划线纯化并分离单菌落，以便进行外源基因的大量诱导表达。
实施例4：
摇瓶诱导表达及酶活测定
选取荧光圈直径较大的重组酵母菌株转接30mL的YPD培养基内，30℃培养24h。转接1mL至mL的BMGY培养基，30℃培养20h。离心收集菌体，将菌体转入50mL的BMMY培养基中进行摇瓶发酵，每12h添加250μL，经诱导培养60h后，利用橄榄油乳化法分别测定各个重组酵母菌株发酵液上清液中脂肪酶的酶活。
酶活测定方法采用国标法-橄榄油乳化法。
(1)测定原理
脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯和甘油。所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用酚酞指示剂指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。
反应式为：ROOH+NaOH→RCOONa+H2O
(2)酶活定义
酶活单位的定义：在温度为35℃，pH值为7的条件下，样品水解脂肪每分钟释放出的1μmol游离脂肪酸，即为1个脂肪酶活力单位(U)。
(3)酶活的测定
取4mL橄榄油与2％PVA的乳化液加入到5mL 20mmol/L的磷酸盐缓冲液中(pH7.0)，并加入1mL适当稀释的酶液，在35℃100rpm震荡的条件下反应15min，加入15mL 95％的乙醇终止反应，对照的操作方法为先加入15mL终止液再加入1mL适当稀释过的酶液，用0.05mol/L NaOH滴定样品和对照中生成的脂肪酸，计算消耗0.05mol/L的NaOH的量。
(4)脂肪酶活力的计算
其计算公式为：酶活力(U/mL)＝(B-A)×C/0.05×50×1/15×n
其中B：滴定样品时消耗NaOH标准溶液的体积，mL；A：滴定对照时消耗NaOH标准溶液的体积，mL；C:NaOH标准溶液浓度mol/L；0.05：NaOH标准溶液浓度换算系数；50：0.05mol/L NaOH标准溶液1mL相当于脂肪酸50μmol；n：酶液的稀释倍数；1/15：反应时间15min，折算为1min的系数。
按照上述方法分别测定脂肪酶lipY2各突变体pPIC9k-lipY2-m发酵上清液的酶活，lipY2酶活为1033U/mL；突变体K36G/K39T的酶活为988U/mL；突变体R63G的酶活为991U/mL；突变体K36G/K39T/R63G酶活为996U/mL。
实施例5：
pH对lipY2及其突变体的活性及稳定性影响测定
本发明采用20mmol/L pH 2.0-10.0的缓冲液(pH 2.0-3.0甘氨酸-HCl缓冲液、pH3.0-8.0柠檬酸/Na2HPO4缓冲液、pH 8.0-9.0Tris/HCl缓冲液、pH 10.0甘氨酸-NaOH缓冲液)，分别测定lipY2及其突变体在37℃条件下反应15min后的残余酶活力。以残余酶活最大值pH下的酶活力为100％，计算其它pH值下的相对活力。如图5所示，lipY2最适pH为8，三个突变体的最适pH均降低到7。在pH5.0-8.0的范围内突变体K36G/K39T、R63G的酶活保持在50％以上，K36G/K39T/R63G的酶活保持在80％以上。当pH低于5.0时，lipY2的酶活已经丧失，而在pH 4.0下突变体K36G/K39T还有10％的酶活，突变体R63G及K36G/K39T/R63G的酶活保持在20％左右。
pH稳定性评估是将lipY2及其突变体的酶液置于不同的pH环境中，处理1h后，测定其在最适条件下的剩余酶活力。如图6所示，lipY2及其突变体在pH4.0-7.0处理1h后，酶活力都保持在80％以上，其中突变体K36G/K39T、R63G及K36G/K39T/R63G在pH 3.0下处理1h后，酶活还剩余20％以上。而lipY2已经丧失酶活。与lipY2相比，突变体在酸性条件下能够比较稳定的存在，显示了较好的耐酸性，尤其以K36G/K39T/R63G的耐酸性最好。该脂肪酶突变体比已报道的许多脂肪酶更具有酸性稳定性，这一特点更有利于该酶在人类肠胃中抵抗胃酸的分解，动力学稳定性的增加有助于改善膳食胰脂肪酶酶替代疗法的疗效。
实施例6：
lipY2及其突变体对胰蛋白酶抗性的测定
本发明采用测定半衰期的方法来评估lipY2及其突变体对胰蛋白酶抗性的好坏。脂肪酶对胰蛋白酶抗性的半衰期是指脂肪酶在一定条件下经一定浓度的胰蛋白酶酶切后，当脂肪酶的相对残余酶活降到一半时所需的时间。
将lipY2及其突变体的纯酶液在37℃、pH 8.0条件下用相同浓度的胰蛋白酶(酶解反应时胰蛋白酶浓度：脂肪酶浓度＝1：100)处理0min、5min、10min、20min、30min、40min、60min、90min、120min和150min后，在最适条件下测定其残余酶活。并以相对酶活为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制胰蛋白酶对lipY2及其突变体的影响曲线，如图7所示。经相同浓度的胰蛋白酶处理相同的时间后，突变体的相对残余酶活总是高于lipY2，其中突变体K36G/K39T/R63G的残余酶活最高。且随着时间的延长，其残余酶活差距也会相应增大。
根据脂肪酶对胰蛋白酶抗性的半衰期的定义计算得出lipY2及其突变体经胰蛋白酶处理后，各自的残余酶活降到50％时所用的时间，lipY2的抗胰蛋白酶稳定性半衰期为41.5min，而突变体K36G/K39T、R63G和K36G/K39T/R63G的半衰期分别为43.9min、45.7min和46.8min，较lipY2分别提高了5.8％、10.1％和12.7％。突变体比lipY2更能抵抗肠道中的胰蛋白酶的消化，发挥其作为胰脂肪酶代替疗法的疗效。
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<400> 1
Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 2
<211> 906
<212> DNA
<213> 脂肪酶lipY2核苷酸序列
<400> 2
gtgtacacct ctaccgagac ctctcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcaccaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360
gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct ccaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaa 906
<210> 3
<211> 301
<212> PRT
<213> 突变体K36G/K39T氨基酸序列
<400> 3
Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Gly Ile Phe Thr Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
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290 295 300
<210> 4
<211> 301
<212> PRT
<213> 突变体R63G氨基酸序列
<400> 4
Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
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Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
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His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 5
<211> 301
<212> PRT
<213> 突变体K36G/K39T/R63G的氨基酸序列
<400> 5
Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Gly Ile Phe Thr Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys Ala
35 40 45
His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys Gln
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile Thr
85 90 95
Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn Gly
115 120 125
Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys Leu
130 135 140
Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr Gly
145 150 155 160
His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu Lys
165 170 175
Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile Val
180 185 190
Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly Gln
195 200 205
Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Arg
210 215 220
Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp Gly
225 230 235 240
Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile His
245 250 255
Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys Gln
260 265 270
Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly Asn
275 280 285
His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
290 295 300
<210> 6
<211> 906
<212> DNA
<213> K36G/K39T基因序列
<400> 6
gtgtacacct ctaccgagac ctctcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcaccggtat cttcactccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180
gacccccgtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360
gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct ccaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaa 906
<210> 7
<211> 906
<212> DNA
<213> R63G核苷酸序列
<400> 7
gtgtacacct ctaccgagac ctctcacatt gaccaggagt cctacaactt ctttgagaag 60
tacgcccgac tcgcaaacat tggatattgt gttggtcccg gcaccaagat cttcaagccc 120
ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180
gaccccggtc tcatctttga tgtttctggt tacctcgctg ttgatcatgc ctccaagcag 240
atctaccttg ttattcgagg aacccactct ctggaggacg tcataaccga catccgaatc 300
atgcaggctc ctctgacgaa ctttgatctt gctgctaaca tctcttctac tgctacttgt 360
gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600
gtcgataaac tcttctttgg ccaggagaac cccgatgtct ccaaggtgtc caaagaccga 660
aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
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cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaa 906
<210> 8
<211> 906
<212> DNA
<213> K36G/K39T/R63G的基因序列
<400> 8
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ttcaactgtg gcctgcaatg tgcccacttc cccaacgttg agctcatcga ggagttccac 180
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gatgactgtc ttgtccacaa tggcttcatc cagtcctaca acaacaccta caatcagatc 420
ggccccaagc tcgactctgt gattgagcag tatcccgact accagattgc tgtcaccggt 480
cactctctcg gaggagctgc agcccttctg ttcggaatca acctcaaggt taacggccac 540
gatcccctcg ttgttactct tggtcagccc attgtcggta acgctggctt tgctaactgg 600
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aagctctacc gaatcaccca ccgaggagat atcgtccctc aagtgccctt ctgggacggt 720
taccagcact gctctggtga ggtctttatt gactggcccc tgatccaccc tcctctctcc 780
aacgttgtca tgtgccaggg ccagagcaat aaacagtgct ctgccggtaa cactctgctc 840
cagcaggtca atgtgattgg aaaccatctg cagtacttcg tcaccgaggg tgtctgtggt 900
atctaa 906

Claims (9)

1.一种定点突变的脂肪酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第36位的赖氨酸突变为甘氨酸且第39位的赖氨酸突变为苏氨酸。
2.一种定点突变的脂肪酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第63位精氨酸突变为甘氨酸。
3.一种定点突变的脂肪酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第36位的赖氨酸突变为甘氨酸，第39位的赖氨酸突变为苏氨酸，且第63位精氨酸突变为甘氨酸。
4.一种定点突变的脂肪酶基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的定点突变的脂肪酶突变体，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
或权利要求2所述的定点突变的脂肪酶突变体，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
或权利要求3所述的定点突变脂肪酶突变体，基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.包含权利要求4所述脂肪酶突变体基因的重组载体及重组菌株。
6.包含权利要求4所述脂肪酶突变体基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母。
8.一种制备胰蛋白酶抗性改良的脂肪酶lipY2-m的方法，其特征在于，包括以下步骤
⑴用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
⑵培养重组菌株，诱导重组定点突变的脂肪酶lipY2-m的表达；
⑶回收并纯化所表达的定点突变的脂肪酶lipY2-m。
9.权利要求1或2或3所述的定点突变的脂肪酶突变体在制备治疗胰腺炎的药物方面中的应用。
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Yarrowia lipolytica lipase 2 is Stable and Highly Active in Test Meals and Increases Fat Absorption in an Animal Model of Pancreatic Exocrine Insufficiency;Ahmed Aloulou et al.;《Gastroenterology》;20151231;全文 *

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